CN110951797A

CN110951797A - 消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用

Info

Publication number: CN110951797A
Application number: CN201911236047.7A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 杨帆; 蔡冬波; 陈耀中; 张清; 马昕; 陈建刚
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: US20210171918A1; CN110951797B; US11952596B2

Abstract

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，公开了消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ‑谷氨酸产量中的应用。本发明通过同源重组的方式，将来源于消化链球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)中的谷氨酸脱氢酶GdhA替换地衣芽胞杆菌WX‑02(Baclicus lincheniformis)自身的谷氨酸脱氢酶，显著提高了地衣芽胞杆菌聚γ‑谷氨酸合成水平，获得菌株聚γ‑谷氨酸产量相较于对照菌株至少提高了20%以上。本发明为聚γ‑谷氨酸的高效生产提供了一种新策略。

Description

消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用。

背景技术

聚γ-谷氨酸是由α-氨基和γ-羧酸基团之间的酰胺键连接的D/L-型谷氨酸残基构成的阴离子多肽。因其生物结构特征，使它具有很多优良的性质。聚γ-谷氨酸作为水溶性、生物可降解性、生物相容性、可食用性、无毒性的生物可降解材料，可广泛用于食品、农业、医药、化妆品、环保等领域。因此，聚γ-谷氨酸具有广泛的应用前景。

目前，聚γ-谷氨酸的商业化生产主要依赖于微生物发酵法，但是由于需要添加聚γ-谷氨酸合成前体物和发酵副产物过多，导致葡萄糖向聚γ-谷氨酸的转化率偏低。从目前报道看，聚γ-谷氨酸的商业生产菌株几乎完全依赖于芽胞杆菌属，如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌等。根据营养要求，这些聚γ-谷氨酸生产菌株可分为L-谷氨酸依赖型和L-谷氨酸非依赖型。L-谷氨酸依赖型菌株在商业生产上增加了生产成本。L-谷氨酸非依赖型菌株虽然是潜在的低生产成本的细胞工厂，但是其生产力却受到了极大的限制。谷氨酸脱氢酶是聚γ-谷氨酸合成途径中关键酶，负责催化α-酮戊二酸形成谷氨酸，随后通过聚γ-谷氨酸合成酶进一步反应生成终产物聚γ-谷氨酸。由于胞内谷氨酸的合成积累是聚γ-谷氨酸高效合成的必要条件，因此谷氨酸脱氢酶也是聚γ-谷氨酸生物合成的关键酶。目前，尚未有研究对影响聚γ-谷氨酸高产的谷氨酸脱氢酶进行分析和研究。消化链球菌是人体口腔、上呼吸道及肠道的正常菌群，尚未有研究表明其具有聚γ-谷氨酸的合成能力，也没有研究对其谷氨酸脱氢酶进行研究及与芽胞杆菌谷氨酸脱氢酶进行比较。本研究通过将来源于消化链球菌的谷氨酸脱氢酶替换了地衣芽胞杆菌自身的谷氨酸脱氢酶，显著提高了地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸的合成水平，取得了聚γ-谷氨酸产量提高的技术效果。本研究表明，消化链球菌中谷氨酸脱氢酶对于地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸高效合成意义重大，本研究为聚γ-谷氨酸的高效生物合成提供了一种新策略。

发明内容

本发明的目的在于提供了来源于消化链球菌的谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用，所述的谷氨酸脱氢酶GdhA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用，包括将编码消化链球菌谷氨酸脱氢酶gdhA的基因替换地衣芽胞杆菌中的谷氨酸脱氢酶基因，将得到的重组菌株用于发酵生产聚γ-谷氨酸，所述的谷氨酸脱氢酶gdhA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；或是利用本领域的常规方案，将消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在地衣芽胞杆菌中表达，从而促进聚γ-谷氨酸的合成。

以上所述的应用中，优选的，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为能生产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌。

以上所述的应用中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02。

以上所述的应用中，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：

葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠0～10g/L，NaNO₃ 5～10g/L，NH₄Cl0-10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5-1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8-1.2g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8-1.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.1-0.2g/L，CaCl₂ 0.8-1.2g/L，所述的谷氨酸钠，柠檬酸钠和氯化铵，最多只能有一个含量可取0；

或甘油18-22g/L，谷氨酸钠25-35g/L，柠檬酸钠8-13g/L，NaNO₃ 7-12g/L，NH₄Cl 8-12g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.8-1.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.9-1.2g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8-1.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.1-0.25g/L，CaCl₂ 0.5-1.5g/L。

葡萄糖30-90g/L，谷氨酸钠0～30g/L，柠檬酸钠9-10g/L，NaNO3 9-10g/L，NH4Cl9-10g/L，K2HPO4·3H2O 0.8-1g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1g/L，ZnSO4·7H2O 0.8-1g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.2g/L，CaCl2 0.8-1.2g/L，所述的谷氨酸钠，柠檬酸钠不能同时取0。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过同源重组的方式，将来源于消化链球菌(Peptostreptococcusasaccharolyticus)中的谷氨酸脱氢酶GdhA替换地衣芽胞杆菌WX-02(Baclicuslincheniformis)自身的谷氨酸脱氢酶，解决了目前聚γ-谷氨酸合成过程中谷氨酸供应不足的问题，改造后的菌株合成聚γ-谷氨酸显著提高，其聚γ-谷氨酸合成水平相较于对照菌株至少提高了20％。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实验材料和试剂

1、菌株：地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，保藏号为CCTCCNO.M208065，菌株E.coli DH5α购自于北京全式金生物技术有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：高保真Taq酶购自武汉擎科生物技术有限公司公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶等分子生物学试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司，其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

LB培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min后使用。

实施例1：

消化链球菌谷氨酸脱氢酶替换菌株地衣芽胞杆菌WX-gdhA的构建：

1、根据消化链球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)DSM 20463基因组DNA序列通过基因合成gdhA基因(基因扩增引物为T2-F2和T2-R2)(SEQ ID NO.2所示)；以地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis WX-02基因组DNA为模板，PCR扩增出地衣芽胞杆菌自身谷氨酸脱氢酶基因rocG的上游同源臂(引物为T2-F1和T2-R1)和基因rocG的下游同源臂(引物为T2-F3和T2-R3)；

T2-F1:GCTCTAAGAGCGGCTGATGAAGGT

T2-R1:ACGGATTAAGTGTATCTGTCATTAACAGGCACGCCAAAAG

T2-F2:CTTTTGGCGTGCCTGTTAATGACAGATACACTTAATCCGT

T2-R2:CGCTAAGACTTCCAGGTGATTAATACCATCCTCTTAATTTC

T2-F3:GAAATTAAGAGGATGGTATTAA TCACCTGGAAGTCTTAGCG

T2-R3:CGAGCT ATCAAAAACAGAAGGGGGAGGA

2、通过重叠延伸PCR将基因rocG的上游同源臂、扩增出的gdhA基因和基因rocG的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：基因rocG的上游同源臂-扩增出的gdhA基因-基因rocG的下游同源臂；

3、采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-Ori进行双酶切得到线性质粒片段；

4、将步骤3得到的酶切目的片段和步骤3得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶连接，验证正确后得到质粒T2(2)-gdhA；

5、将质粒T2(2)-gdhA转入地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis WX-02中，经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证；

6、将步骤4得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和gdhA-R为引物进行菌落PCR检测单交换菌株；

T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA

gdhA-R：CGCTAAGACTTCCAGGTGATTAATACCATCCTCTTAATTTC

7、将步骤5得到的菌株和步骤6得到的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为T2-KYF和T2-KYR)。得到阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的gdhA菌株(即地衣芽胞杆菌WX-gdhA)。

T2-KYF:GAGATTATTCGTAAAGCCGAGATG

T2-KYR:CTGTCTCCCGTGTCTTTACCCG

实施例2：

地衣芽胞杆菌WX-gdhA在提高聚γ-谷氨酸发酵产量中的应用：

发酵产物产量分析

将实施例1获得的重组菌株接种到LB培养基中，37℃，培养14h；向500mL三角瓶中装入50mL的聚γ-谷氨酸发酵培养基(表1)，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)接种至发酵培养基中。培养条件为转速230r/min，温度37℃，发酵周期36小时。

本实施例，针对不同的发酵培养基配方，考察了地衣芽胞杆菌WX-gdhA对聚γ-谷氨酸合成水平的影响(同时也在这24种培养基中以相同接种量接种地衣芽胞杆菌WX-02作为对照)，24组培养基配方具体如表1所示：

表1发酵培养基配方

以上培养基成分单位均为g/L，发酵培养基的pH为6.5～7.2，115℃灭菌20min后使用。

采用干重法测量聚γ-谷氨酸产量，具体操作步骤如下：取一定体积的发酵液样品，使用6mol/L HCl将pH调至3.0，12000r/min离心10min，菌体沉淀80℃烘箱烘干，测菌体干重。取上清，用6mol/L NaOH将上清液pH调至中性，加入3倍体积乙醇沉淀聚γ-谷氨酸，离心收集聚γ-谷氨酸絮状沉淀，将沉淀在80℃烘箱烘干，测干重。根据干重法计算生产发酵的菌液中聚γ-谷氨酸产量(见表2)。

表2发酵试验聚γ-谷氨酸的产量

序列表

<110> 湖北大学

<120> 消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Asp Thr Leu Asn Pro Leu Val Ala Ala Gln Glu Lys Val Arg

1 5 10 15

Ile Ala Cys Glu Lys Leu Gly Cys Asp Pro Ala Val Tyr Glu Leu Leu

20 25 30

Lys Glu Pro Gln Arg Val Ile Glu Ile Ser Ile Pro Val Lys Met Asp

35 40 45

Asp Gly Thr Val Lys Val Phe Lys Gly Trp Arg Ser Ala His Ser Ser

50 55 60

Ala Val Gly Pro Ser Lys Gly Gly Val Arg Phe His Pro Asn Val Asn

65 70 75 80

Met Asp Glu Val Lys Ala Leu Ser Leu Trp Met Thr Phe Lys Gly Gly

85 90 95

Ala Leu Gly Leu Pro Tyr Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Cys Val Asp

100 105 110

Pro Ala Glu Leu Ser Glu Arg Glu Leu Glu Gln Leu Ser Arg Gly Trp

115 120 125

Val Arg Gly Leu Tyr Lys Tyr Leu Gly Asp Arg Ile Asp Ile Pro Ala

130 135 140

Pro Asp Val Asn Thr Asn Gly Gln Ile Met Ser Trp Phe Val Asp Glu

145 150 155 160

Tyr Val Lys Leu Asn Gly Glu Arg Met Asp Ile Gly Thr Phe Thr Gly

165 170 175

Lys Pro Val Ala Phe Gly Gly Ser Glu Gly Arg Asn Glu Ala Thr Gly

180 185 190

Phe Gly Val Ala Val Val Val Arg Glu Ser Ala Lys Arg Phe Gly Ile

195 200 205

Lys Met Glu Asp Ala Lys Ile Ala Val Gln Gly Phe Gly Asn Val Gly

210 215 220

Thr Phe Thr Val Lys Asn Ile Glu Arg Gln Gly Gly Lys Val Cys Ala

225 230 235 240

Ile Ala Glu Trp Asp Arg Asn Glu Gly Asn Tyr Ala Leu Tyr Asn Glu

245 250 255

Asn Gly Ile Asp Phe Lys Glu Leu Leu Ala Tyr Lys Glu Ala Asn Lys

260 265 270

Thr Leu Ile Gly Phe Pro Gly Ala Glu Arg Ile Thr Asp Glu Glu Phe

275 280 285

Trp Thr Lys Glu Tyr Asp Ile Ile Val Pro Ala Ala Leu Glu Asn Val

290 295 300

Ile Thr Gly Glu Arg Ala Lys Thr Ile Asn Ala Lys Leu Val Cys Glu

305 310 315 320

Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr Pro Glu Gly Asp Lys Val Leu Thr Glu

325 330 335

Arg Gly Ile Asn Leu Thr Pro Asp Ile Leu Thr Asn Ser Gly Gly Val

340 345 350

Leu Val Ser Tyr Tyr Glu Trp Val Gln Asn Gln Tyr Gly Tyr Tyr Trp

355 360 365

Thr Glu Ala Glu Val Glu Glu Lys Gln Glu Ala Asp Met Met Lys Ala

370 375 380

Ile Lys Gly Val Phe Ala Val Ala Asp Glu Tyr Asn Val Thr Leu Arg

385 390 395 400

Glu Ala Val Tyr Met Tyr Ala Ile Lys Ser Ile Asp Val Ala Met Lys

405 410 415

Leu Arg Gly Trp Tyr

420

<210> 2

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacagata cacttaatcc gttagtagcg gcacaagaaa aagtaagaat agcatgcgaa 60

aaattaggat gcgatccagc agtatatgaa ctattaaaag aaccacaaag agtaattgaa 120

atctcaattc cagtaaaaat ggatgatggt acagttaaag tgttcaaagg atggagaagt 180

gctcactcaa gcgctgtagg tccatcaaaa ggtggagtta gattccatcc aaatgtaaac 240

atggatgaag ttaaagctct ttctctatgg atgacattca aaggtggagc actaggctta 300

ccatacggcg gaggaaaagg tggaatctgc gtagatccag cagaactatc agaaagagaa 360

ttagaacaat tatcaagagg atgggtaaga ggtctttata aatatcttgg agacagaatc 420

gatatcccag caccagacgt aaacactaac ggacaaatca tgagctggtt cgttgatgaa 480

tatgtaaaat taaacggcga aagaatggac atcggaactt tcacaggaaa gccagtagca 540

tttggcggaa gtgaaggaag aaacgaagca actggattcg gagtagctgt agtagttaga 600

gaatctgcta agagattcgg aatcaaaatg gaagatgcta aaatagctgt tcaaggtttc 660

ggaaacgtag gtactttcac tgttaagaac attgaaagac aaggcggaaa agtttgtgct 720

atcgctgaat gggatagaaa cgaaggaaac tatgctctat acaatgaaaa tggaatcgac 780

ttcaaagaat tattagctta caaagaagct aacaaaactc ttatcggatt cccaggagca 840

gaaagaatta ctgatgaaga attctggaca aaagaatatg atatcatagt accagcagca 900

ttagaaaatg taatcacagg cgaaagagct aaaacaataa acgctaaatt agtttgtgaa 960

gcagctaatg gtcctacaac tccagaagga gacaaagtat taactgaaag aggaatcaac 1020

ttaacaccag atatcttaac taactcaggt ggagttctag tatcttacta tgaatgggta 1080

caaaatcaat atggatacta ctggacagaa gcagaagtag aagaaaaaca agaagcagac 1140

atgatgaaag ctatcaaagg cgtattcgca gttgctgatg aatacaatgt aactctaaga 1200

gaagctgttt acatgtatgc aatcaaatca atagatgtag ctatgaaatt aagaggatgg 1260

tattaa 1266

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctaagag cggctgatga aggt 24

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acggattaag tgtatctgtc attaacaggc acgccaaaag 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttttggcgt gcctgttaat gacagataca cttaatccgt 40

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctaagact tccaggtgat taataccatc ctcttaattt c 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaattaaga ggatggtatt aatcacctgg aagtcttagc g 41

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgagctatca aaaacagaag ggggagga 28

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtgataac tcggcgta 18

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgctaagact tccaggtgat taataccatc ctcttaattt c 41

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagattattc gtaaagccga gatg 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctgtctcccg tgtctttacc cg 22

Claims

1.消化链球菌谷氨酸脱氢酶GdhA在提高地衣芽胞杆菌聚γ-谷氨酸产量中的应用，所述的谷氨酸脱氢酶GdhA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列为SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为能生产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌。

4.根据权利要求1所述的应用，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis) WX-02。

5.根据权利要求1所述的应用，在应用过程中，发酵时，使用的发酵培养基配方为：

葡萄糖30-90 g/L，谷氨酸钠0~30 g/L，柠檬酸钠0~10 g/L，NaNO₃5~10 g/L，NH₄Cl0-10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5-1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8-1.2 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8-1.2 g/L，MnSO₄·H₂O 0.1-0.2 g/L，CaCl₂0.8-1.2 g/L，所述的谷氨酸钠，柠檬酸钠和氯化铵，最多只能有一个含量可取0；

或甘油18-22 g/L，谷氨酸钠25-35 g/L，柠檬酸钠8-13g/L，NaNO₃7-12 g/L，NH₄Cl 8-12g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.8-1.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.9-1.2 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8-1.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.1-0.25 g/L，CaCl₂0.5-1.5g/L。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

葡萄糖30-90 g/L，谷氨酸钠0~30 g/L，柠檬酸钠9-10 g/L，NaNO₃9-10 g/L，NH₄Cl9-10g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.8-1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8-1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.8-1g/L，MnSO₄·H₂O0.1-0.2 g/L，CaCl₂0.8-1.2 g/L，所述的谷氨酸钠，柠檬酸钠不能同时取0。