CN118374533B - 一种产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法及应用 - Google Patents
一种产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明适用于分子生物技术领域，提出了一种产L‑赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法及应用，通过同源交换将突变后VOC基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，替换谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 VOC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，得到谷氨酸棒杆菌DXMC013；本发明还提供了谷氨酸棒杆菌DXMC013在产L‑赖氨酸中的应用，相较于原始菌，其能够提高L‑赖氨酸的产量和生长速度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法及应用。
背景技术
L-赖氨酸是蛋白质的重要组分之一，是人体不能自身合成但又十分需要的八种氨基酸之一，主要用于人类医学、制药工业、食品工业等领域。由于L-赖氨酸的重要性，对于提高L-赖氨酸的产量的研究也持续进行。
L-赖氨酸通过谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株的发酵产生，提高L-赖氨酸的产量的研究涉及到发酵技术，例如搅拌、供应氧气、改进培养基等方面，但是这种方式L-赖氨酸的产量提高量有限；还涉及到发酵过程中微生物的性能改变，例如诱变、选择和筛选突变体，微生物的性能改变过程中，对抗代谢物具有抗性，或使具有重要调节性能的代谢物形成营养缺陷。
授权公告号为CN 115038716 B的专利中公开了一种新ABC转运蛋白ATP结合蛋白变体及使用其生产L-赖氨酸的方法，但是并没有公开VOC基因的改变是否影响L-赖氨酸的合成。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法及应用，通过同源交换将突变后的VOC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，替换谷氨酸棒杆菌ATCC13032 VOC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，得到谷氨酸棒杆菌DXMC013，其能够提高L-赖氨酸的产量。
本发明的技术方案是这样实现的：
通过紫外照射将谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）DXMC012进行诱变处理。将活化好的菌液离心，弃上清，菌体用生理盐水稀释至1×108CFU/mL（稀释10倍）；提前开启紫外灯预热30 min，将稀释好的菌液取3 ml涂布于一次性培养皿，于0、30、60、90、120 s紫外处理，每个梯度设置3组平行；紫外照射后用适当的稀释比例涂布平板进行菌落计数(避光培养)，绘制致死率曲线。选择致死率在80-90%的照射时间作为突变的照射时间。筛选L-赖氨酸产量提高的菌株，对其进行基因组测序，发现其VOC产生突变，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。以上启示，VOC基因的改变可能提高谷氨酸棒杆菌生产L-赖氨酸的能力。
本发明中，突变后VOC基因片段上，第97-191核苷酸缺失，对应的第33-64氨基酸缺失。由于缺失的氨基酸不是3的倍数，第64位后面的氨基酸全部产生移码突变。
本发明中，谷氨酸棒杆菌DXMC012，分类命名：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，保藏编号CCTCC NO：M20232577，保藏日期：2023年12月18日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。
通过上述启示，一方面，本发明提供了一种产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：
步骤一
以谷氨酸棒杆菌DXMC012突变菌株基因组DNA为模板，PCR扩增突变后VOC基因片段，核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示；
步骤二
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组DNA为模板，PCR扩增上游同源臂UP核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示、下游同源臂DOWN核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。
本发明中，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源于美国模式培养物集存库，菌种编号ATCC 13032。
步骤三
通过无缝克隆试剂盒将突变后VOC基因片段与上游同源臂UP、下游同源臂DOWN连接，并插入线性化载体，制得重组质粒；
步骤四
将步骤三制得的重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞，筛选，即得谷氨酸棒杆菌DXMC013。
谷氨酸棒杆菌DXMC013，分类命名：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，保藏编号CCTCC NO：M20232578，保藏日期：2023年12月18日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。
优选的，步骤二中，PCR扩增以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA为模板，获得上游同源臂UP，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
UP-F: caggtcgactctagaggatccGTGGTGGACATGGCTTTTCG SEQ ID NO.5；
UP-R: caggatagaacacCCCTAAGTTCGGTTCCCTGG SEQ ID NO.6；
（本发明中，引物序列中存在大小写，为同源重组互补序列，包括部分酶切位点，下同）
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
UP-F（10μmol/L） 2μl
UP-R（10μmol/L） 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
优选的，步骤二中，PCR扩增以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA为模板，获得下游同源臂DOWN，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
DOWN-F: cggagttctagGCAGTTCTAAGCGCTCCACG SEQ ID NO.7；
DOWN-R: acgacggccagtgccgaattcCCAAGAAGCTCTCGTAGAATTCG SEQ ID NO.8；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
DOWN-F（10μmol/L） 2μl
DOWN-R（10μmol/L） 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
优选的，步骤一中，PCR扩增以谷氨酸棒杆菌DXMC012的基因组DNA为模板，获得突变后VOC基因片段，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
VOC-F: cttagggGTGTTCTATCCTGGCGGCATG SEQ ID NO.9；
VOC-R: tagaactgcCTAGAACTCCGCGATATTGATCTTC SEQ ID NO.10；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
VOC-F（10μmol/L） 2μl
VOC-R（10μmol/L） 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
优选的，步骤三中，无缝克隆试剂盒中，多片段无缝克隆体系如下，总体系为10μl：
线性化载体pK19mobsacB 2μl
UP 1μl
DOWN 1μl
突变VOC基因片段 1μl
2 × ClonExpress Mix 5μl
多片段无缝克隆程序如下：多片段重组反应，50℃，15 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
优选的，步骤四中，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞制备步骤如下：
S1 挑取谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却至4℃，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞；
S2 将重组质粒高压电击转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28～32℃培养12~16 h，筛选，即得谷氨酸棒杆菌DXMC013。
进一步优选的，种子培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、葡萄糖4～6g。
进一步优选的，电转缓冲液，每升组分包括如下成分：山梨醇85～96 g、甘露醇85～96 g、甘油95～105 mL。
进一步优选的，液体复苏培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96 g 、甘露醇65～73g。
进一步优选的，步骤S2中，高压电击转化的条件为：2200 V电击5 ms。
另一方面，本发明还提供了谷氨酸棒杆菌DXMC013在产L-赖氨酸中的应用。
本发明的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法相对于现有技术具有以下有益效果：
谷氨酸棒杆菌DXMC013相对于原始菌谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，能够明显提高L-赖氨酸的产量和生长速度快，节约发酵时间和成本，并且可以减少染菌几率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例4中琼脂糖凝胶电泳检验图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
敲除框构建
PCR扩增以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA为模板，获得上游同源臂UP核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
UP-F: caggtcgactctagaggatccGTGGTGGACATGGCTTTTCG SEQ ID NO.5；
UP-R: caggatagaacacCCCTAAGTTCGGTTCCCTGG SEQ ID NO.6；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
UP-F（10μmol/L） 2μl
UP-R（10μmol/L） 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
PCR扩增以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA为模板，获得下游同源臂DOWN核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
DOWN-F: cggagttctagGCAGTTCTAAGCGCTCCACG SEQ ID NO.7；
DOWN-R: acgacggccagtgccgaattcCCAAGAAGCTCTCGTAGAATTCG SEQ ID NO.8；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
DOWN-F（10μmol/L） 2μl
DOWN-R（10μmol/L） 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
PCR扩增以谷氨酸棒杆菌DXMC012的基因组DNA为模板，获得突变VOC基因片段核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
VOC-F: cttagggGTGTTCTATCCTGGCGGCATG SEQ ID NO.9；
VOC-R: tagaactgcCTAGAACTCCGCGATATTGATCTTC SEQ ID NO.10；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
VOC-F（10μmol/L） 2μl
VOC-R（10μmol/L） 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30 sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
实施例2
重组质粒构建
多片段无缝克隆体系如下，总体系为10μl：
线性化载体pK19mobsacB 2μl
UP 1μl
DOWN 1μl
突变VOC基因片段 1μl
2 × ClonExpress Mix 5μl
多片段无缝克隆程序如下：多片段重组反应，50℃，15 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
实施例3
感受态细胞制备及转化
S1 挑取谷氨酸棒杆菌ATCC 13032单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.8，置于冰上冷却至4℃，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体4次，电转缓冲液重悬菌体，制得感受态细胞；
S2 将重组质粒高压电击转化至步骤S1制得的感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在30℃培养14h，筛选转化子，即得谷氨酸棒杆菌DXMC013。
种子培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、葡萄糖5g，余量水。
电转缓冲液，每升组分包括如下成分：山梨醇90g、甘露醇90g、甘油100mL，余量水。
液体复苏培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇90g 、甘露醇70g，余量水。
高压电击转化的条件为：2200 V电击5 ms。
实施例4
阳性菌落筛选
挑取实施例3的阳性重组菌落（筛选转化子），依次接种到含25μg/mL卡那霉素抗性和含15g/L蔗糖的固体LB培养基（蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 10g/L，蔗糖 15g/L，琼脂粉 2 g/L，余量水）中30℃培养过夜，培养完成后，挑取只在含15g/L蔗糖LB固体培养基（蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 10g/L，蔗糖 15g/L，琼脂粉 2 g/L，余量水）生长的单菌落为模板，以UP-F和DOWN-R为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证，参见图1；
PCR引物序列如下:
UP-F: caggtcgactctagaggatccGTGGTGGACATGGCTTTTCG SEQ ID NO.5；
DOWN-R: acgacggccagtgccgaattcCCAAGAAGCTCTCGTAGAATTCG SEQ ID NO.8；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为20μl：
2×Phanta Max Master Mix 10μl
UP-F（10μmol/L） 1μl
DOWN-R（10μmol/L） 1μl
模板 1μl
dd H2O 7μl
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，使用引物UP-F和DOWN-R能够扩增出一条特异性基因条带，大小约为1800bp，见图1，与理论值1865bp接近，表明VOC基因替换成功，得到谷氨酸棒杆菌DXMC013。
实施例5
L-赖氨酸发酵测试
将实施例4制备的谷氨酸棒杆菌DXMC013、原始菌谷氨酸棒杆菌ATCC 13032分别接种至100mL LBG培养基（蛋白胨 10g/L，酵母膏 5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖 5g/L，余量水）中220rpm 30℃下进行种子培养16h，其后按体积百分比5%接种量分别接种至100 mL发酵培养基（葡萄糖20 g/L、玉米浆30 g/L、(NH4)2SO4 20 g/L、CH3COONa 10 g/L、尿素5 g/L、L-丙氨酸1.34 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 1.35 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L、MnSO4·H2O0.04 g/L、烟酰胺0.008 g/L、生物素0.001 g/L、亮氨酸0.04 g/L，余量水）发酵培养50h取样，并通过生物传感分析仪SBA-40C（山东省科学院生物研究所制，市售产品）测定发酵液中L-赖氨酸的含量，三次发酵测量取平均值，通过紫外分光光度计测量OD600值，L-赖氨酸的含量计算结果如表1所示，OD600结果如表2所示。
表1 谷氨酸棒杆菌DXMC013与原始菌L-赖氨酸的产量
表2 谷氨酸棒杆菌DXMC013与原始菌L-赖氨酸的OD600值
通过表1中数据可以看出：
与原始菌相比，在发酵48h时，谷氨酸棒杆菌DXMC013发酵液中L-赖氨酸的产量达到2.43 g/L，而原始菌在48h时发酵液中L-赖氨酸的产量2.29 g/L，谷氨酸棒杆菌DXMC013的L-赖氨酸产量较原始菌提高了6.1％；
谷氨酸棒杆菌DXMC013，L-赖氨酸的产量达到2.21 g/L时，发酵时间为24h，而原始菌发酵36h时，L-赖氨酸的产量才达到2.22 g/L，与原始菌相比，节约发酵时间约12h，说明谷氨酸棒杆菌DXMC013相较于原始菌生长速度快，节约发酵时间和成本。
由于谷氨酸棒杆菌DXMC013的生长速度较快，相对于其他菌种能够形成优势菌，避免其他菌种的生长，因此，可以减少染菌几率。
通过表2中数据可以看出：
在发酵12h、24h、36h、48h时，谷氨酸棒杆菌DXMC013的OD600值均大于原始菌的OD600值，说明谷氨酸棒杆菌DXMC013的生物量也有提高，在发酵36h时，提高量最大，为22.69%。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一
以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）DXMC012突变菌株基因组DNA为模板，PCR扩增突变后VOC基因片段，核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示；
步骤二
以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组DNA为模板，PCR扩增上游同源臂UP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、下游同源臂DOWN核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示；
步骤三
通过无缝克隆试剂盒将所述突变后VOC基因片段与所述上游同源臂UP、下游同源臂DOWN连接，并插入线性化载体，制得重组质粒；
步骤四
将所述重组质粒电转入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞，筛选，即得谷氨酸棒杆菌DXMC013（Corynebacterium glutamicum DXMC013）。
2.如权利要求1所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，PCR扩增突变后VOC基因片段时，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
VOC-F: cttagggGTGTTCTATCCTGGCGGCATG SEQ ID NO.9；
VOC-R: tagaactgcCTAGAACTCCGCGATATTGATCTTC SEQ ID NO.10；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
VOC-F，10μmol/L 2μl
VOC-R，10μmol/L 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
3.如权利要求1所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，PCR扩增上游同源臂UP时，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
UP-F: caggtcgactctagaggatccGTGGTGGACATGGCTTTTCG SEQ ID NO.5；
UP-R: caggatagaacacCCCTAAGTTCGGTTCCCTGG SEQ ID NO.6；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
UP-F，10μmol/L 2μl
UP-R，10μmol/L 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
4.如权利要求1所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，PCR扩增下游同源臂DOWN时，PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
DOWN-F: cggagttctagGCAGTTCTAAGCGCTCCACG SEQ ID NO.7；
DOWN-R: acgacggccagtgccgaattcCCAAGAAGCTCTCGTAGAATTCG SEQ ID NO.8；
PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：
2×Phanta Max Master Mix 25μl
DOWN-F，10μmol/L 2μl
DOWN-R，10μmol/L 2μl
模板 2μl
dd H2O 19μl；
PCR扩增程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸30sec，32个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。
5.如权利要求1所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤三的无缝克隆试剂盒中，多片段无缝克隆体系如下，总体系为10μl：
线性化载体pK19mobsacB 2μl
UP 1μl
DOWN 1μl
突变VOC基因片段 1μl
2 × ClonExpress Mix 5μl
多片段无缝克隆程序如下：多片段重组反应，50℃，15 min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
6.如权利要求1所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤四中，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞的制备步骤如下：
S1 挑取谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的单菌落，在种子培养基中培养至菌体浓度OD600为0.7～0.9，置于冰上冷却至4℃，冷却后离心，用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3～5次，电转缓冲液重悬菌体，制得谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞；
S2 将重组质粒高压电击转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞中，移入液体复苏培养基，在28～32℃培养12~16 h，筛选，即得谷氨酸棒杆菌DXMC013。
7.如权利要求6所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述种子培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、葡萄糖4～6g。
8.如权利要求6所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述电转缓冲液，每升组分包括如下成分：山梨醇85～96 g、甘露醇85～96 g、甘油95～105 mL。
9.如权利要求6所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述液体复苏培养基，每升组分包括如下成分：蛋白胨8～12g、酵母粉4～6g、氯化钠8～12g、山梨醇85～96 g、甘露醇65～73g。
10.权利要求1-9任一项所述的产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的构建方法制得的谷氨酸棒杆菌DXMC013在产L-赖氨酸中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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