CN108611308B - 一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用 - Google Patents

一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术和发酵领域，公开了一种高产聚γ‑谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用，本发明以质粒T2(2)‑Ori为基础，通过构建柠檬酸转运蛋白基因cimH的敲除载体T2‑△cimH，成功在地衣芽胞杆菌WX‑02中敲除了cimH基因，得到了地衣芽胞杆菌工程菌WX‑02△cimH。与对照菌WX‑02相比，工程菌株WX‑02△cimH的γ‑PGA产量至少提高了11%以上，为γ‑PGA高产提供一种新的策略。

Description

一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术和发酵领域，具体涉及一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用。
背景技术
聚γ-谷氨酸(Poly glutamic acid,γ-PGA)是一种由D-谷氨酸、L-谷氨酸或D，L-谷氨酸组成的阴离子型谷氨酸聚合物，相对分子量在10KD-3000KD。根据谷氨酸单体间酰胺键连接方式可分为聚α-谷氨酸和聚γ-谷氨酸，γ-PGA分子链存在着游离羧基，分子与分子之间作用的氢键由游离羧基提供，因此γ-PGA有着诸多特点：易溶于水；良好的保水能力；吸附金属离子；主链由肽键构成，在酶降解下可以降解成短肽或单体氨基酸，因此具有可生物降解性；耐热，耐紫外线。γ-PGA还可以作为药物载体、组织工程材料、化妆品添加剂和食品添加剂等。
作为三羧酸循环重要的中间代谢物—柠檬酸，是γ-PGA合成过程当中不可或缺的物质，同时也是一种良好的金属离子的螯合剂。柠檬酸在菌体代谢过程中会有部分合成，但合成量较低，不足以满足目标产物的合成需求。
本申请发现，通过敲除地衣芽胞杆菌中柠檬酸转运蛋白基因cimH，进而提高了柠檬酸利用效率和γ-PGA的合成量。目前对于γ-PGA高产策略一般集中在途径改造和转录调控，本发明首次通过敲除地衣芽胞杆菌中柠檬酸转运蛋白基因来提高γ-PGA产量，为γ-PGA高产提供一种新的策略。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法，该方法通过在地衣芽胞杆菌的基因组内敲除cimH基因，缺失柠檬酸/苹果酸转运蛋白，提高了γ-PG A产量。
本发明的另一个目的在于提供了一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法的应用。利用本发明的方法，可用于工业化制备聚γ-谷氨酸。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的制备方法，通过将地衣芽胞杆菌中的cimH基因敲除后得到。
以上所述的方法中，优选的，所述的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02；
以上所述的方法中，具体的，包括下述步骤：
(1)以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂；
(2)通过重叠延伸PCR将cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：cimH基因的上游同源臂-cimH基因的下游同源臂；
(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
(4)将步骤(2)得到的酶切目的片段和步骤(3)得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到敲除质粒T2(2)-△cimH；
(5)将敲除质粒T2(2)-△cimH转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
(6)将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到cimH基因的上游同源臂或cimH基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
(7)挑选cimH基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与cimH基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到缺失了cimH基因的地衣芽胞杆菌WX-02△cimH；
所述cimH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法的应用，包括利用本领域的常规方式，将获得的地衣芽孢杆菌进行工业发酵以生产聚γ-谷氨酸；
以上所述的应用中，优选的，所述发酵的培养基配方，包括：30～90g/L葡萄糖(或20～60g/L甘油)，0～30g/L谷氨酸钠，0～10g/L柠檬酸钠，0～10g/L NaNO3，0～10g/LNH4Cl，0～1g/L K2HPO4·3H2O，0～1g/L MgSO4·7H2O，0～1g/L ZnSO4·7H2O，0～0.15g/LMnSO4·H2O，0～1g/L CaCl2，pH6.5～7.2；
所述的发酵的培养基中，其组分谷氨酸钠，柠檬酸钠，NaNO3，NH4Cl，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，ZnSO4·7H2O，MnSO4·H2O和CaCl2中只能有一种组分取0；
以上所述的发酵培养基，优选的：
30～90g/L葡萄糖(或20～60g/L甘油)，15～30g/L谷氨酸钠，5～10g/L柠檬酸钠，5～10g/L NaNO3，5～10g/L NH4Cl，0.5～1g/L K2HPO4·3H2O，0.5～1g/L MgSO4·7H2O，0.5～1g/L Zn SO4·7H2O，0.075～0.15g/L MnSO4·H2O，0.5～1g/L CaCl2，pH6.5～7.2；
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明人首次尝试通过缺失cimH基因，来提高γ-PGA的产量，为提高γ-PGA产量提供了一种新策略。与地衣芽胞杆菌WX-02相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌WX-02△cimH的γ-PGA产量提高了至少11％。本发明的研究结果表明：通过缺失cimH基因来提高γ-PGA产量是一个十分有效的方法。
附图说明
图1为步骤(1)得到的cimH基因的上游同源臂和下游同源臂及其重叠延伸后的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为cimH基因的上游同源臂，泳道3为cimH基因的下游同源臂；泳道4为步骤(2)得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；
图2为步骤(4)得到的敲除质粒T2(2)-△cimH菌落PCR验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为敲除质粒T2(2)-△cimH PCR验证的条带；
图3为步骤(5)得到的阳性转化子WX-02/T2(2)-△cimH菌落PCR验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为WX-02/T2(2)-△cimH菌落PCR验证的条带；
图4为步骤(7)得到的缺失菌株WX-02△cimH进行菌落PCR验证图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为回复突变结果即WX-02菌落PCR验证条带，泳道3为敲除质粒T2(2)-△cimH双交换的菌落PCR验证的条带；
其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000b p，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种能够提高γ-PGA产量的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出cimH基因(SEQ ID NO.1所示)的上游同源臂(555bp)和cimH基因的下游同源臂(518bp)；上游同源臂引物A-F和A-R、下游同源臂引物B-F和B-R；
A-F：GCGAGCTCAAAATCCATAAGGCTCAC
A-R：CGCTCCGCCGATTCTTGTTCAAAGCGAAGAGCAGCA
B-F：TGCTGCTCTTCGCTTTGAACAAGAATCGGCGGAGCG
B-R：GCCGCTCTAGAAGAACCTGCACGCTATCCG；
(2)通过重叠延伸PCR将cimH基因的上游同源臂和下游同源臂连接到一起，所用引物为A-F和B-R，构成目的基因片段(1073bp)，该目的基因片段的排列顺序为：cimH基因的上游同源臂-cimH基因的下游同源臂；
(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段(1044bp)，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段(4244bp)；其中，所述的限制性内切酶SacI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
(4)将酶切基因片段和线性质粒片段经T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1361bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：敲除载体T2(2)-△cimH)；
T2-F ATGTGATAACTCGGCGTA
T2-R GCAAGCAGCAGATTACGC；
(5)将敲除载体T2(2)-△cimH通过电击转化的方法转入地衣芽胞杆菌WX-02中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1361bp处出现电泳条带，证明：敲除载体T2(2)-△cimH成功转入地衣芽胞杆菌WX-02中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了敲除载体T2(2)-△cimH的地衣芽胞杆菌WX-02)；
(6)将步骤(5)得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和△cimH-KYF为引物(或以T2-R与△cimH-KYR为引物)进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1374bp或2528bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，△cimH-KYR和△cimH-KYF的序列为:
△cimH-KYF：CCTTCGGGAATGGTTTCT
△cimH-KYR：TGCTGGCAGCTACTTCGG
(7)将步骤6)得到的PCR检测出现1374bp条带的单交换菌株和步骤6)得到的PCR检测出现2528bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为△cimH-KYF和△cimH-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在2490bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌WX-02；在1336bp处出现电泳条带时，说明地衣芽胞杆菌WX-02的基因组上缺失了cimH的基因，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的cimH缺失菌株(即地衣芽胞杆菌WX-02△cimH)。
实施例2：
地衣芽胞杆菌WX-02△cimH在γ-PGA生产中的应用，包括下述步骤：
1)种子液获得的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌WX-02△cimH活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子培养基后于230r/min、37℃中培养12小时，得到种子培养的菌液；
所述的种子培养基的配方是LB配方(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，pH7.2)
2)向250mL三角瓶中装入50mL的不同配方的发酵培养基(具体配方见表1，pH7.20)，然后将种子培养的菌液以接种量为3％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养28小时，即得。
以相同方法发酵地衣芽胞杆菌WX生产γ-PGA为对照。
本发明人采用测干重的方法对上述生产发酵的菌液中γ-PGA的产量进行测定。
测定条件具体为：取一定体积的发酵液样品，用6mol/L盐酸调pH值至2-3；12000rpm离心5min，沉淀(菌体)于80℃烘箱烘干，测干重；将上清转移至50mL离心管中；用6mol/L氢氧化钠调pH值至7.0；加三倍体积的无水乙醇，充分震荡，析出成团，12000rpm离心5min；将上清液倒掉，沉淀(γ-PGA)于80℃烘箱烘干；称干重。根据干重法计算出生产发酵的菌液中γ-PGA的产量，不同发酵培养基配方获得的γ-PGA的产量见表2。
表1
Figure BDA0001648025440000051
Figure BDA0001648025440000061
Figure BDA0001648025440000071
表2
Figure BDA0001648025440000072
Figure BDA0001648025440000081
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌WX-02来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌WX-02△cimH的生产发酵的菌液中γ-PGA产量有了大幅提升(至少提高11％)，说明：本发明的技术方案在提高芽胞杆菌γ-PGA产量方面具有重大应用价值。申请人同时做了柠檬酸转运蛋白基因citM的研究，发现无论是缺失还是强化表达都不能提高γ-PGA的产量。说明，改造柠檬酸转运蛋白对γ-PGA的影响时不可预知的。本发明的提供的思路对于今后γ-PGA的产量具有重大意义。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种高产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌的制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaagcaa aaccaaaggt acaacatata ccgattcaaa caacgaaaga accggatgaa 60
aatttttttg caagagcaat gaatgttaaa atcggcatca ttccgctgcc cgtatacttg 120
ctgctcttcg ctttgattgt gacgtttgtc tatatgcacg atctgaaaag cgacatttta 180
actgctattg cggttacggg ctttttcgga ttcaccttcg cccaaatcgg aaagtcgctg 240
ccgcttcttc gttctgtcgg cggtgccgct atacttgcga catttattcc ttcagctatc 300
gtctattacc atctcattcc cgatgacatt atcaaatcaa caactgaatt tacagaaaac 360
tcaaactttc tttatttgtt tatctcagcc attgtagtgg gaagcatttt agggatgaaa 420
agagaaacgc tggtcagggc gttcattaaa attttcattc cgctgatcgc agggacaatt 480
gccgcagcgg cagtcggtct gacagttggt acaatgctcg gcctcggatt tcagcatacg 540
ctgctgtaca ttgtgattcc gatcatggcc ggaggggttg gcgagggagc cattccgctg 600
tccatcggct attcggaaat catgcacatg tcacaagggg aagcttttgc acttgtcatt 660
ccttccatta tgttcggaag cttaagcgct gtcattttgt ccggggtttt aaatgtaatg 720
gggaagaaaa agcctgaatg gacaggcaac ggaaaagtcg accgtttcga aagtggggac 780
gcactgccgc ttgaaagccg cgacaaagac aaagaaagcg tttttaacct ttcccacttt 840
gcatcgggag gcattcttgc cgtctcatta tatttggtcg gtatgctttc acatgacttg 900
ttcggatttc cagcacccgt catgatgctt ctcttggctg ttgccgtgaa actgtttcgt 960
ttggctccgg cgaatttgga aaacggcgcc tacggcgtgt cacgtttctt ttcaactgct 1020
gtgacatatc cgctgctttt tgccattggc gtctccatga caccgtggga caagctgatc 1080
gctgctttta atattgccaa tattattacg atcgtatctg tcgtgatcac gatgatagcc 1140
gtcggctttt ttacaggaaa gtggctgaac atgtacccga tcgaaaccgc gattatcaat 1200
gcctgccatt caggtcaggg cggaacgggg gacatcgcca ttctcagcgc cgccgagcgc 1260
ctcgagctca tgccgtttgc tcaggtatcc acaagaatcg gcggagcgat aaccgttaca 1320
ctgacattgc tgctgttagc ccagttttat tga 1353

Claims (5)

1.一种高产γ-PGA的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）的制备方法，通过将地衣芽胞杆菌WX-02中的cimH基因敲除后得到，所述的cimH基因为SEQ ID NO.1所示。
2.一种高产γ-PGA的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）的制备方法，包括下述步骤：
（1）以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，PCR扩增出cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂；
（2）通过重叠延伸PCR将cimH基因的上游同源臂和cimH基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：cimH基因的上游同源臂-cimH基因的下游同源臂；
（3）采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
（4）将步骤（2）得到的酶切目的片段和步骤（3）得到的线性质粒片段经 T4-DNA连接酶进行连接，经过氯化钙转化法将酶连的产物转入大肠杆菌DH5α中，以卡那青霉素为抗性筛选标记，并经过菌落PCR，得到阳性转化子，经过测序得到敲除质粒T2(2)-△cimH；
（5）将敲除质粒T2(2)-△cimH转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；
（6）将阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到cimH基因的上游同源臂或cimH基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（7）挑选cimH基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与cimH基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到缺失了cimH基因的地衣芽胞杆菌WX-02△cimH；
所述cimH基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.利用权利要求1所述的方法制备得到的地衣芽胞杆菌在生产聚-γ-谷氨酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述生产的过程中的发酵培养基配方包括：30~90g/L葡萄糖或20~60g/L甘油，0~30g/L谷氨酸钠，0~10g/L柠檬酸钠，0~10g/L NaNO3，0~10g/LNH4Cl，0~1g/L K2HPO4·3H2O，0~1g/L MgSO4·7H2O，0~1g/L ZnSO4·7H2O，0~0.15g/LMnSO4·H2O，0~1g/L CaCl2，pH6.5~7.2；
所述的发酵的培养基中，其组分谷氨酸钠，柠檬酸钠， NaNO3，NH4Cl， K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O， ZnSO4·7H2O， MnSO4·H2O和CaCl2中每次只能有一种组分取0。
5.根据权利要求3所述的应用，所述生产的过程中的发酵培养基配方：30~90g/L葡萄糖或20~60g/L甘油，15~30g/L谷氨酸钠，5~10g/L柠檬酸钠，5~10g/L NaNO3，5~10g/L NH4Cl，0.5~1g/L K2HPO4·3H2O，0.5~1g/L MgSO4·7H2O，0.5~1g/L ZnSO4·7H2O，0.075~0.15g/LMnSO4·H2O，0.5~1g/L CaCl2，pH6.5~7.2。
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