CN112280727B - 合成乳酰-n-三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

合成乳酰-n-三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种合成乳酰‑N‑三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。本发明构建了利用β‑1,3‑N‑葡糖氨基酶lgtA基因在大肠杆菌中合成乳酰‑N‑三糖的新途径，利用大肠杆菌自身代谢途径中的UDP‑乙酰葡萄糖胺作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖运输酶的作用下转入细胞，合成乳酰‑N‑三糖。本发明的重组大肠杆菌合成乳酰‑N‑三糖的产量达到3.87g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产其他多种母乳寡糖奠定了基础。

Description

合成乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种合成乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。
背景技术
母乳寡糖(HMOs)是人乳区别于其他哺乳动物乳汁的重要特征，具有保护肠道菌群、促进免疫系统等功能。研究表明，添加母乳寡糖到配方奶粉中，可使奶粉更接近母乳，有益于婴儿健康生长。
母乳寡糖有超过200种结构不同的种类，含量在5-15g/L，主要包括岩藻糖基乳糖、非岩藻糖基乳糖和唾液酸基乳糖三大类，都是以乳糖为核心，通过糖基键连接其他的单糖形成。其中，乳酰-N-三糖(lacto-N-triose LNTⅡ)是多种母乳寡糖的重要前体物质，可以此为基础进一步合成乳酰-N-四糖(lacto-N-tetraose LNT)、乳酰-N-新四糖(lacto-N-neotetraose LNnT)、乳酰-N-二岩藻新六糖(lacto-N-neodifucohexaose LNnDFH)等多种母乳寡糖。
作为重要的前体物质，乳酰-N-三糖的产量是后续合成其他母乳寡糖的关键之一。目前，乳酰-N-三糖的合成主要依赖于核苷酸、甲基为原料进行化学合成，昂贵的底物使得乳酰-N-三糖的价格过高，无法进行可行的大规模生产。有研究利用较为廉价的几丁质降解产物作为底物，在β-N-乙酰己糖胺酶的催化下合成乳酰-N-三糖，使生产成本大大降低，但乳酰-N-三糖的摩尔产率仅为2-8％，不利于产业化生产。
此前，已有研究通过对微生物进行改造以合成乳-N-新四糖等母乳寡糖，包括在大肠杆菌属和枯草芽孢杆菌属中构建代谢途径，其中伴随着乳酰-N-三糖的生成，但几乎没有研究针对乳酰-N-三糖的代谢途径。因此，如何提高乳酰-N-三糖的产量、降低生产成本，对于母乳寡糖的研究极为重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明构建了利用β-1,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因在大肠杆菌中合成乳酰-N-三糖的新途径，从外源添加乳糖，并利用大肠杆菌自身代谢途径中的UDP-乙酰氨基葡萄糖作为前体物质，在lgtA基因的作用下合成乳酰-N-三糖。
本发明的第一个目的是提供一种合成乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主基因组上敲除β-半乳糖苷酶lacZ基因、过表达乳糖运输酶lacY基因，以及异源表达β-1,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因。
进一步地，所述重组大肠杆菌还在大肠杆菌宿主菌中进行了如下基因敲除或基因过表达中的一种或多种组合：敲除葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagB基因、敲除UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因、过表达谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶glmS基因、过表达磷酸葡糖胺变位酶glmM基因、过表达葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶glmU基因、过表达葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi基因。
进一步地，所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌MG1655。
进一步地，所述的β-半乳糖苷酶lacZ基因的ID为945006，乳糖运输酶lacY基因的ID为949083，β-1,3-N-葡糖氨基酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagB基因的ID为945290，UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因的ID为944789，葡萄糖-6-磷酸异构酶pgi基因的ID为948535，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶glmS基因的ID为948241，磷酸葡糖胺变位酶glmM基因的ID为947692，葡萄糖胺-1-磷酸乙酰转移酶glmU基因的ID为948246。
本发明的第二个目的是提供所述重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
S1、构建包含β-1,3-N-葡糖氨基酶的重组质粒pCDFDuet-lgtA；
S2、采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，依次敲除大肠杆菌MG1655中lacZ基因、过表达lacY基因，得到敲除lacZ、过表达lacY基因的重组菌；
S3、将重组质粒pCDFDuet-lgtA转入S2步骤得到的重组菌中，构建产乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌。
进一步地，所述方法还包括采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，在S3步骤得到的重组大肠杆菌中敲除nagB、wecB基因中的一种或两种，和/或过表达pgi、glmS、glmM、glmU基因中的一种或多种组合，得到基因敲除和/或过表达的重组大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供所述重组大肠杆菌在发酵生产乳酰-N-三糖中的应用。
进一步地，所述的应用具体包括如下步骤：将重组大肠杆菌的种子液以OD值0.1-0.2的接种量接入发酵培养基中培养至OD达到1.8～2.2时，在28℃下，以0.15～0.25mM的IPTG进行诱导4840-60h。
进一步地，发酵培养基配方为(g/L)：蛋白胨10～14，酵母提取物22～26，甘油3～5，磷酸氢二钾2.2～2.5，三水磷酸氢二钾16.2～16.5，乳糖2～4。
本发明的有益效果是：
本发明构建了利用β-1,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因在大肠杆菌中合成乳酰-N-三糖的新途径，利用大肠杆菌自身代谢途径中的UDP-乙酰葡萄糖胺作为前体物质，仅需要从外源添加乳糖并在乳糖运输酶的作用下转入细胞，合成乳酰-N-三糖。本发明的重组大肠杆菌合成乳酰-N-三糖的产量达到3.87g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产其他多种母乳寡糖奠定了基础。
附图说明
图1为本发明重组大肠杆菌合成乳酰-N-三糖的代谢途径。
图2为重组菌株MA发酵过程中发酵过程中乳糖的消耗曲线和生长曲线。
图3为重组菌株MA和原始菌株MG1655乳酰-N-三糖的产量。
图4为代谢途径中的基因分别进行敲除和过表达后乳酰-N-三糖产量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
乳酰-N-三糖利用液质联用色谱仪进行定性和定量检测。质谱离子方式：ESI+，质量范围：20-2000m/z，检测器电压：1800Volts，液相检测器：WATERS ACQUITY PDA，检测波长：200---400nm，分析柱：BEH C18 2.1X150mm 1.7um，流动相：100％乙腈，柱温：45℃，流速：0.3ml/min，进样体积5μL。
实施例1：基因敲除同源臂片段的构建
根据E.coli MG1655序列信息，设计如表1中所示引物,使用上述引物以E.coliMG1655基因组为模板，PCR扩增出lacZ、nagB、wecB、各基因的上下游同源臂片段，通过Overlapping PCR分别融合各基因上下游同源臂，得到片段lacZ12、nagB12、wecB12。
实施例2：基因整合同源臂片段的构建
根据E.coli MG1655序列信息，设计如表1中所示引物，lacY、pgi、glmS、glmM、glmU基因的整合位点分别为fliK、recA、motA、poxB、flhE、arsB基因，使用上述引物以E.coliMG1655基因组为模板，PCR扩增出fliK、motA、poxB、flhE、arsB各基因的上下游同源臂片段、带有tac启动子的目的基因lacY、pgi、glmS、glmM、glmU片段，通过Overlapping PCR分别融合各基因上下游同源臂和目的基因，得到片段lacY12、pgi12、glmS12、glmM12、glmU12。
表1
Figure BDA0002768782220000041
Figure BDA0002768782220000051
实施例3：pTarget质粒的构建
分别在各待敲除基因上选取N20区(CRISPR/Cas9系统中用于靶向待敲除基因的20bp的碱基序列)，设计引物，以pTarget为模板，通过PCR取代模板的N20区。将PCR产物转入E.coli JM109中，提取质粒，得到8个质粒，pTarget-lacZ、pTarget-nagB、pTarget-wecB、pTarget-fliK、pTarget-poxB、pTarget-flhE、pTarget-arsB、pTarget-motA。
实施例4：基因敲除
本实施例使用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除，该方法需要在Cas9蛋白的表达下，同时转入pTarget和重组片段，电转化后涂布双抗板对菌株进行筛选，得到成功敲除目标基因的重组菌株。以lacZ基因的敲除为例阐述基因敲除的步骤，E.coli MG1655为出发菌株，将pCas9质粒转化到出发菌株中，得到表达Cas9蛋白的宿主，随后将pTarget-lacZ质粒和片段lacZ12通过电转转入，涂布于抗性平板，筛选得到敲除lacZ基因的重组菌株，消除pTarget-lacZ质粒和pCas9质粒，得到lacZ基因敲除的重组菌株。其余基因的敲除方法与此相同，若要进行下一步敲除，可先不消除pCas9质粒，直接转化下一个基因的pTarget和重组片段。
实施例5：基因整合
本实施例使用CRISPR/Cas9系统进行基因整合，与实施例4中所述的基因敲除操作类似。以lacY基因的整合为例阐述基因整合的步骤，lacY基因的整合位点是fliK，将pTarget-fliK质粒和片段lacY12通过电转转入，涂布于抗性平板，筛选得到整合lacY基因的重组菌株，消除pTarget-lacY质粒和pCas9质粒，得到整合lacY基因的重组菌株。其余基因的整合方法与此相同。
实施例6：构建合成乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌
出发菌株E.coli MG1655，将pCas9质粒转化到出发菌株中，得到表达Cas9蛋白的宿主，随后将pTarget-lacZ质粒和片段lacZ12电转进去，得到敲除lacZ基因的重组菌株，消除pTarget-lacZ质粒，将pTarget-fliK质粒和片段lacY12电转入重组菌株中，将lacY基因整合到基因组上，按此方法继续电转pTarget-fliK质粒和片段lacY12到重组菌中，将lacY基因整合到基因组上，最后消除pTarget和pCas9质粒，再将重组质粒pCDFDuet-lgtA转化到菌株中，得到敲除lacZ基因、过表达lacY和lgtA基因的重组菌株MA。
实施例7：乳酰-N-三糖代谢途径的优化
在重组菌株MA的基础上，将pCas9质粒转化MA，得到表达Cas9蛋白的宿主MA(pCas9)，再分别将pTarget-nagB、pTarget-wecB、pTarget-motA、pTarget-poxB、pTarget-flhE、pTarget-arsB质粒和对应片段nagB12、wecB12、pgi12、glmS12、glmM12、glmU12通过电转转入MA(pCas9)，得到单独过表达或敲除的重组菌株。再对多个基因进行组合敲除或过表达。
实施例8：发酵合成乳酰-N-三糖
将重组菌株的种子液以OD值0.1-0.2的接种量接入发酵培养基中37℃，200rpm培养，发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4g/L，磷酸氢二钾2.31g/L，三水磷酸氢二钾16.42g/L，乳糖3g/L。当OD值达到2时，在28℃下，以0.2mM的IPTG进行诱导48h。
发酵结束后，使用液质联用色谱仪对发酵液中的乳酰-N-三糖进行定性和定量分析，如图3所示，重组菌株MA的乳酰-N-三糖产量为1.06g/L，发酵过程中乳糖的消耗和生长曲线如图2所示。对代谢途径中的基因分别进行敲除和过表达后，乳酰-N-三糖产量如图4所示，其中，在敲除nagB、wecB基因，同时过表达glmM基因时，乳酰-N-三糖产量最高，达到了3.87g/L，比MA产量提高了2.65倍。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学，光明乳业股份有限公司
<120> 合成乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 80
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Glu Lys Asp Arg Ser Ile Ile Ala Met Gly Ala Trp Leu Glu Val
1 5 10 15
Leu Ser Glu Glu Lys Asp Gly Asn Arg Leu Ala Arg His His Arg His
20 25 30
Gly Lys Ile Trp Lys Lys Pro Thr Arg His Glu Asp Ile Ala Asp Phe
35 40 45
Phe Pro Phe Gly Asn Pro Ile His Asn Asn Thr Met Ile Met Arg Arg
50 55 60
Ser Val Ile Asp Gly Gly Leu Arg Tyr Asn Thr Glu Arg Asp Trp Ala
65 70 75 80

Claims (6)

1.一种合成乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是在大肠杆菌宿主基因组上敲除β-半乳糖苷酶lacZ基因、过表达乳糖运输酶lacY基因，以及异源表达β-1,3-N-葡糖氨基酶lgtA基因；
所述重组大肠杆菌还在大肠杆菌宿主菌中进行了如下基因敲除和基因过表达：敲除葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagB基因、敲除UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因、过表达磷酸葡糖胺变位酶glmM基因；
所述的大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌 MG1655；
所述的β-半乳糖苷酶lacZ基因的ID为945006，乳糖运输酶lacY基因的ID为949083；所述的β-1,3-N-葡糖氨基酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶nagB基因的ID为945290，UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶wecB基因的ID为944789，磷酸葡糖胺变位酶glmM基因的ID为947692。
2.一种权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建包含β-1,3-N-葡糖氨基酶的重组质粒pCDFDuet-lgtA；
S2、采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，依次敲除大肠杆菌MG1655中lacZ基因、过表达lacY基因，得到敲除lacZ、过表达lacY基因的重组菌；
S3、将重组质粒pCDFDuet-lgtA转入S2步骤得到的重组菌中，构建产乳酰-N-三糖的重组大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，在S3步骤得到的重组大肠杆菌中敲除nagB和wecB基因，和过表达glmM基因，得到基因敲除和过表达的重组大肠杆菌。
4.权利要求1所述的重组大肠杆菌在发酵生产乳酰-N-三糖中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用具体包括如下步骤：将重组大肠杆菌的种子液以OD值0.1-0.2的接种量接入发酵培养基中培养至OD达到1.8~2.2时，在28℃下，以0.15~0.25mM的IPTG进行诱导48-60h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨10~14g/L，酵母提取物22~26 g/L，甘油3~5 g/L，磷酸氢二钾2.2~2.5 g/L，三水磷酸氢二钾16.2~16.5 g/L，乳糖2~4 g/L。
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