CN116042684B - 大肠杆菌及其在催化合成阿洛酮糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于阿洛酮糖生物合成的大肠杆菌，敲除大肠杆菌的FruA基因，在大肠杆菌的基因组上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重组基因，使得DPEase蛋白产物锚定在大肠杆菌细胞表面。还公开了其制备方法、CRISPR质粒A和B以及相应的转座酶体系。本发明敲除了大肠杆菌的FruA基因，降低了果糖的非目的性消耗。并插入cfa、pA和ibpB基因，然后对FruA缺失的大肠杆菌菌株进行了耐高温和耐高果糖的驯化，以提高大肠杆菌宿主在催化环境(55℃)中的稳定性。利用酶锚定技术将阿洛酮糖异构酶锚定在大肠杆菌的表面，使得阿洛酮糖异构酶在大肠杆菌表面生长，并催化外界环境中的果糖转化成阿洛酮糖。
Description
技术领域
本发明涉及一种大肠杆菌及其在催化合成阿洛酮糖中的应用。
背景技术
阿洛酮糖(D-Psicose)属于一种酮糖，是由D-果糖在C-3位置差相异构形成的一种重要稀有糖，有近似蔗糖的甜味，但与蔗糖相比，阿洛酮糖的热量极低，被认为是食品的理想蔗糖替代品，可以用作食品和膳食补充剂中的成分。而阿洛酮糖在人体内经过肠道吸收后几乎不发生代谢、不产生能量，且很少被肠道微生物发酵利用，此特性也是其作为替代型甜味剂的主要原因。不仅如此，阿洛酮糖可以通过抑制α-葡萄糖苷酶从而减少葡萄糖的吸收，可控制血糖浓度的升高。阿洛酮糖被认为是食品的理想蔗糖替代品，且它具有重要的生理功能，如血糖抑制作用，清除活性氧和神经保护作用。由于阿洛酮糖是一种罕见的糖，在自然界中纯在的量非常的少。人们发现阿洛酮糖异构酶(D-Psicose-3-epimerase,DPEase)可以催化D-果糖异构化为稀有糖——阿洛酮糖。尽管在许多物种中发现能够表达阿洛酮糖异构酶，但自然宿主中表达的阿洛酮糖异构酶蛋白量极低，无法产生阿洛酮糖。因此通过基因工程细菌在体外表达重组的阿洛酮糖异构酶蛋白，以提高阿洛酮糖的转化率，成为阿洛酮糖生物合成领域的主流方法。但是，目前发现的阿洛酮糖异构酶都是嗜热型蛋白，最适反应温度在55-65℃，反应底物一般是500-700g/l的果糖。这种高温高渗条件对酶以及其表达宿主的稳定性都是很大的挑战。此外，果糖作为宿主可以利用的碳源之一，容易进入宿主细菌代谢，而不参与阿洛酮糖的合成。
发明内容
本发明主要目的是获取一种大肠杆菌，可用于催化阿洛酮糖的合成。
本发明公开了一种CRISPR质粒A，所述CRISPR质粒A包含crRNA、LE、RE、cfa、ibpA和ibpB基因，所述crRNA靶向FruA。
优选的，该质粒的序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还公开了一种转座酶体系，包括上述的CRISPR质粒A，以及转座酶质粒；
所述转座酶质粒包含TnsA、TnsB、TnsC、TniQ、Cas6、Cas7和Cas8蛋白的编码基因。
优选的，转座酶质粒的序列如SEQ ID:No.1所示。
本发明还公开了一种CRISPR质粒B，所述CRISPR质粒B包含crRNA、LE、RE、DPEase重组基因，其中DPEase重组基因的核苷酸序列见SEQ ID NO:7。
优选的，其序列如SEQ ID:No.5所示。
本发明还公开了一种用于阿洛酮糖生物合成的大肠杆菌，敲除大肠杆菌的FruA基因，在大肠杆菌的基因组上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重组基因，使得DPEase蛋白产物锚定在大肠杆菌细胞表面。
优选的，所述大肠杆菌经诱变和高温度培养条件下驯化处理。
优选的，诱变的方式为等离子诱变、微波诱变、电离辐射诱变、紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、亚硝基胍诱变中的一种或者多种组合；
驯化的方式是将诱变后的菌株在更高温度的培养环境中培养，选择其中生长速度最快的菌株，再诱变，再置于更高温度的培养环境中培养，重复诱变-培养的过程，直至诱变后的菌株在目标温度的培养环境下的生长速度基本达到或超过诱变前正常环境的生长速度。
上述的大肠杆菌在催化合成阿洛酮糖中的应用。
优选的，反应底物为果糖。
本发明还公开了上述的大肠杆菌的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)敲除大肠杆菌的FruA基因，以降低对果糖的代谢，并插入cfa、ibpA和ibpB基因，以提高大肠杆菌的耐热性能；
(2)将大肠杆菌进行诱变，并在37-55℃培养条件下梯度升温驯化；
(3)在大肠杆菌的基因组中插入阿洛酮糖异构酶DPEase重组基因，将DPEase蛋白产物锚定在大肠杆菌细胞表面。
优选的，步骤(1)通过上述的转座酶体系实现。
优选的，步骤(2)具体为将改造后的菌株诱变处理后，涂布在含果糖的无抗培养基，置于40-45℃培养箱中培养，直至长出单克隆；将长势最快的三个单克隆挑取到无抗培养基中，震荡培养一段时间后，诱变处理，然后涂布在含果糖的无抗培养基，提高培养温度1-2℃培养，直至长出单克隆；将长势最快的三个单克隆挑取到无抗培养基中，重复上述诱变-培养的过程，每次培养温度提升1-2℃，直至培养温度达到50-55℃，选取长势最快的单克隆，即为驯化后的菌株。
优选的，步骤(3)通过上述的转座酶质粒及上述的CRISPR质粒B实现。
本发明还公开了一种阿洛酮糖异构酶DPEase重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
上述阿洛酮糖异构酶DPEase重组蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明的有益效果：
本发明对大肠杆菌进行改造，首先敲除了大肠杆菌的FruA基因，使果糖不能进入到大肠杆菌细胞内部，降低了果糖的非目的性消耗。并插入cfa、pA和ibpB基因，然后对FruA缺失的大肠杆菌菌株进行了耐高温和耐高果糖的驯化，以提高大肠杆菌宿主在催化环境(55℃)中的稳定性，从而提高菌株的重复利用次数。同时，利用酶锚定技术将阿洛酮糖异构酶(DPEase)锚定在大肠杆菌的表面，使得阿洛酮糖异构酶可以在大肠杆菌表面生长，并催化外界环境中的果糖转化成阿洛酮糖。使用这种阿洛酮糖合成方法具有催化效率高、果糖损耗小、菌株可重复利用等优点，非常适用于阿洛酮糖的工业化生产。
附图说明
图1转座酶质粒示意图。
图2CRISPR质粒敲除大肠杆菌的BL21(DE3)的FruA，并插入cfa、bpA和ibpB基因示意图。
图3改造后的菌株耐热性测试。
图4改造后的菌株对果糖代谢测试。
图5CRISPR质粒多位点整合DPEase重组基因示意图。
图6改造前后菌株催化产生阿洛酮糖效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1
在本实施例中，我们利用CRISPR转座技术敲除了Rosetta(DE3)菌株的FruA，并插入cfa、ibpA和ibpB基因，并将菌株进行了耐热性和耐高果糖浓度的驯化。
转座酶质粒的构建：我们在阿拉伯糖操纵子后面插入TnsA、TnsB、TnsC、TniQ、Cas6、Cas7和Cas8蛋白基因，组成转座酶质粒。示意图见图1，核苷酸序列见SEQ ID NO:1。质粒合成于广州艾基生物。
CRISPR质粒A的构建：我们在四环素操纵子后面插入crRNA、LE、RE、cfa、ibpA和ibpB基因，其中crRNA靶向FruA基因，组成CRISPR质粒A，示意图见图2，核苷酸序列见SEQ IDNO:2。质粒合成于广州艾基生物。
将两个质粒共转到ROSETTA(DE3)菌株(全式金生物)中，涂布在含50mg/l的链霉素和卡那霉素平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆，加入含相应抗生素的液体培养基，震荡培养至OD600值达到0.4时，加入10mM的阿拉伯糖和0.1ug/L的四环素，25℃震荡培养2天。用含相应抗生素的LB平板进行划线，37℃培养过夜。挑取单克隆，加入含相应抗生素的液体培养基，震荡培养至OD600值达到0.8。挑取测序正确的单克隆。将改造后的菌株在ARTP诱变仪中诱变20s后，涂布在含500g/L果糖的无抗培养基，置于40℃培养箱中培养，直至长出单克隆。将长势最快的三个单克隆挑取到无抗培养基中，震荡培养至OD600值达到0.2时，在ARTP诱变仪中诱变20s后，涂布在含500g/L果糖的无抗培养基，置于42℃培养箱中培养，直至长出单克隆。将长势最快的三个单克隆挑取到无抗培养基中，震荡培养至OD600值达到0.2时，在ARTP诱变仪中诱变20s后，涂布在含500g/L果糖的无抗培养基，置于44℃培养箱中培养，直至长出单克隆。按照上述条件继续诱变培养，每次培养温度提升2℃，直至温度达到50℃。挑取单克隆，分别在无抗培养基、链霉素抗性培养基和卡那霉素抗性培养基中进行划线培养。挑取只在无抗培养基中生长，而不在链霉素抗性培养基和卡那霉素抗性培养基中生长的菌株，即为质粒已经丢失的菌株。
挑取长势较好的菌株，在无抗培养基中培养至OD值0.8时，利用生工生物的感受态试剂盒制备成感受态。
将改造前后的菌株分别在55℃和500g/L果糖条件下放置一段时间，通过稀释涂布平板检测菌株的致死率。
结果见图3和图4，改造后的菌株在55℃和500g/L果糖培养条件下的耐受性更好，且果糖基本上不被消耗。
对比例1
传统DPEase载体构建：未改造的DPEase基因的氨基酸序列见SEQ ID NO:3，核苷酸序列见SEQ ID NO:4。将未改造的DPEase基因构建到pET-28a载体上，转到ROSETTA(DE3)菌株中，涂布在含50mg/l的卡那霉素平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆，加入1000ml液体培养基，30℃和1mM IPTG震荡培养至OD600值达到1时，用0.45um滤膜抽滤的方法收集大肠杆菌，加入750g/L的D-果糖和1mM氯化钴的反应液(pH7.5)100ml悬浮菌体，55℃，150rpm进行反应1h。用0.45um滤膜抽滤的方法再次收集大肠杆菌，加入750g/L的D-果糖和1mM氯化钴的反应液(pH7.5)100ml悬浮菌体，55℃，150rpm进行反应1h，重复3-5次。HPLC检测阿洛酮糖的产量。
实施例2在实施例1制备的大肠杆菌中整合DPEase重组基因
CRISPR质粒B的构建：我们在四环素操纵子后面插入crRNA、LE、RE、DPEase重组基因，其中crRNA靶向大肠杆菌IS1、IS6和IS8位点，组成CRISPR质粒B，示意图见图5，核苷酸序列见SEQ ID NO:5。DPEase重组基因的氨基酸序列见SEQ ID NO:6，核苷酸序列见SEQ IDNO:7。质粒合成于广州艾基生物，改造后的DPEase能够锚定到细胞表面。
将转座酶质粒和CRISPR质粒B共转到权利要求1获得的ROSETTA(DE3)菌株中，涂布在含50mg/l的链霉素和卡那霉素平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆，加入含相应抗生素的液体培养基，震荡培养至OD600值达到0.4时，加入10mM的阿拉伯糖和0.1ug/L的四环素，25℃震荡培养2天。用含相应抗生素的LB平板进行划线，37℃培养过夜。挑取单克隆，加入含相应抗生素的液体培养基，震荡培养至OD600值达到0.8。挑取测序正确的单克隆，加入1000ml液体培养基，30℃震荡培养至OD600值达到1时，用0.45um滤膜抽滤的方法收集大肠杆菌，加入750g/L的D-果糖和1mM氯化钴的反应液(pH7.5)100ml悬浮菌体，55℃，150rpm进行反应1h。用0.45um滤膜抽滤的方法再次收集大肠杆菌，加入750g/L的D-果糖和1mM氯化钴的反应液(pH7.5)100ml悬浮菌体，55℃，150rpm进行反应1h，重复3-5次。HPLC检测阿洛酮糖的产量。
结果见图6，其中的重组基因表面展示后是指采用转座酶法，通过转座酶质粒与CRISPR质粒B直接将DPEase重组基因整合到ROSETTA(DE3)菌株(全式金生物)中。可以看出，使用本方法表达的阿洛酮糖异构酶在催化果糖产生阿洛酮糖上具有更好的效率，且菌株的重复利用效果更好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种CRISPR质粒B，其特征在于所述CRISPR质粒B包含crRNA、LE、RE、DPEase重组基因，其中DPEase重组基因的核苷酸序列见SEQ ID NO:7。
2.根据权利要求1所述的CRISPR质粒B，其特征在于其序列如SEQ ID: No.5所示。
3.一种用于阿洛酮糖生物合成的大肠杆菌，其特征在于，敲除大肠杆菌的FruA基因，在大肠杆菌的基因组上插入cfa、ibpA和ibpB基因，以及DPEase重组基因，使得DPEase蛋白产物锚定在大肠杆菌细胞表面；所述大肠杆菌经诱变和高温度培养条件下驯化处理，其中驯化的方式是将诱变后的菌株在提高培养温度1-2℃的培养环境中培养，选择其中生长速度最快的菌株，再诱变，再置于提高培养温度1-2℃的培养环境中培养，重复诱变-培养的过程，直至诱变后的菌株在目标温度的培养环境下的生长速度基本达到或超过诱变前正常环境的生长速度，其中目标温度指50-55℃。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌，其特征在于诱变的方式为等离子诱变、微波诱变、电离辐射诱变、紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、亚硝基胍诱变中的一种或者多种组合。
5.权利要求3或4所述的大肠杆菌在催化合成阿洛酮糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于反应底物为果糖。
7.权利要求3或4所述的大肠杆菌的制备方法，其特征在于其步骤包括：
（1）敲除大肠杆菌的FruA基因，并插入cfa、ibpA和ibpB基因；
（2）将大肠杆菌进行诱变，并在37-55℃培养条件下梯度升温驯化；
（3）在大肠杆菌的基因组中插入阿洛酮糖异构酶DPEase重组基因，将DPEase蛋白产物锚定在大肠杆菌细胞表面。
8.根据权利要求7所述的大肠杆菌的制备方法，其特征在于步骤（1）通过转座酶体系实现，所述转座酶体系包括CRISPR质粒A，以及转座酶质粒，所述CRISPR质粒A的序列如SEQ IDNO:2所示，所述转座酶质粒包含TnsA、TnsB、TnsC、TniQ、Cas6、Cas7和Cas8蛋白的编码基因。
9.根据权利要求7所述的大肠杆菌的制备方法，其特征在于步骤（2）具体为将改造后的菌株诱变处理后，涂布在含果糖的无抗培养基，置于40-45℃培养箱中培养，直至长出单克隆；将长势最快的1~4个单克隆挑取到无抗培养基中，震荡培养一段时间后，诱变处理，然后涂布在含果糖的无抗培养基，提高培养温度1-2℃培养，直至长出单克隆；将长势最快的1~4个单克隆挑取到无抗培养基中，重复上述诱变-培养的过程，每次培养温度提升1-2℃，直至培养温度达到50-55℃，选取长势最快的单克隆，即为驯化后的菌株。
10.根据权利要求7所述的大肠杆菌的制备方法，其特征在于步骤（3）通过转座酶质粒及权利要求1或2所述的CRISPR质粒B实现，其中转座酶质粒包含TnsA、TnsB、TnsC、TniQ、Cas6、Cas7和Cas8蛋白的编码基因。
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