CN117106680B - 一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产胞嘧啶的重组微生物及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明意外发现敲除核苷水解酶(RihA)的编码基因，同时过表达核苷酸磷酸核苷酶(PpnN)能够进一步催化生成胞嘧啶，提高胞嘧啶的产量。该重组微生物可用于胞嘧啶的工业化生产，且易于操作，达到绿色环保低成本的胞嘧啶的生产，为胞嘧啶的生产提供了新的思路与方法。

Description

一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法。
背景技术
胞嘧啶(C)是组成DNA的四种基本碱基之一，存在于DNA和RNA中。其外观为白色片状结晶，100℃时失水，300℃时成棕色，320-325℃分解。1g胞嘧啶能溶于130mL水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。胞嘧啶有刺激性，其分子主要以氨-酮式(Amino-Keto)和氨-烯醇式(Amino-Enol)两种异构形式存在。常温常压下，胞嘧啶主要以氨-酮式异构体形式存在。胞嘧啶主要可参与三种反应类型：(1)嘧啶环上的氮原子反应，主要有N1-烷基化和氧化反应、N3-烷基化和氧化反应；(2)碳原子的取代反应，主要有亲电和亲核反应，亲电反应易于进行，而亲核反应不易进行；(3)侧链上的氨基与酸酐等物质发生缩合反应。
胞嘧啶应用前景广泛，其是合成化工、农药、医药的重要中间体。在农业上，以胞嘧啶为原料用于合成胞嘧啶核苷肽类高效低毒的广谱农药抗生素；在医药领域，胞嘧啶主要用于抗艾滋病药物，治疗慢性乙肝的药物，抗真菌药物5-氟胞嘧啶，以及抗肿瘤药物吉西他滨、依诺他滨的制备。因此，对胞嘧啶的合成方法进行研究具有十分重要的意义。
胞嘧啶合成工艺路线较多，按照反应类型主要分为官能团转化法和Pinner合成法。官能团转化法主要是以尿嘧啶(U)或2,4-二硫嘧啶(DTP)为原料通过一系列化学反应，使官能团发生转化，从而合成胞嘧啶；Pinner合成法主要是以3-乙氧基丙烯腈(EA)和3,3-二乙氧基丙腈(DP)或EA和DP的混合物为原料合成胞嘧啶。此外，利用微生物发酵生产胞嘧啶逐渐成为可能。例如，专利CN201711213776.1公开了一种微生物发酵生产胞嘧啶核苷的方法，通过微生物在发酵罐内生长代谢将培养基原料(主要为葡萄糖)转化为胞嘧啶核苷，同时通过采用最优化的培养基配方法，最优的过程控制方法式，达到微生物最佳产物积累状态。专利CN201910602231.2则公开了一种生产胞嘧啶的重组微生物及生产胞嘧啶的方法，所述的重组微生物具有至少一个如下特征：1)重组微生物不降解或不利用胞嘧啶；2)重组微生物体外积累胞嘧啶；3)重组微生物超表达编码核糖激酶的基因；4)重组微生物能同时利用葡萄糖和核糖；5)重组微生物的编码核糖及相关化合物的调控蛋白质的基因缺失或没有功能；采用上述重组微生物菌种能够发酵单独生产胞嘧啶，或生产胞嘧啶和胞苷混合物。
然而，采用专利CN201910602231.2所述的重组微生物发酵法生产胞嘧啶，产量提高有限，且菌种放大存在困难。因此，亟需寻找一种提高微生物发酵生产胞嘧啶的产量，且易于操作，可应用工业化生产的方法。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法。本发明意外发现敲除核苷水解酶(RihA)的编码基因，同时过表达核苷酸磷酸核苷酶(PpnN)能够进一步催化生成胞嘧啶，提高胞嘧啶的产量。该重组微生物可用于胞嘧啶的工业化生产，且易于操作，达到绿色环保低成本的胞嘧啶的生产。
术语：
1、胞嘧啶：如无特殊说明，本发明中的英文简称“C”指胞嘧啶，其分子式为C4H5N3O，分子量111.10，结构式如下式(1)所示。
2、重组微生物：如无特殊说明，本发明中的中文名称“重组微生物”指经过人为处理后的微生物；所述的人为处理包括但不限于：基因敲除、基因抑制、基因沉默、基因插入、基因突变、外源表达或过表达基因等本领域所有可以实现基因操作的技术手段。
3、宿主菌：如无特殊说明，本发明中的中文名称“宿主菌”指待进行人为处理的微生物。
4、种子液：如无特殊说明，本发明中的中文名称“种子液”指经微生物经试管斜面活化、扁平或摇瓶培养或种子罐逐级扩大培养后，获得的含有一定微生物数量，活力、质量较优的微生物培养液。
5、高产：如无特殊说明，本发明中的“高产”指胞嘧啶产量高于亲本微生物。
6、低产：如无特殊说明，本发明中的“低产”指胞嘧啶产量低于亲本微生物。
7、外源表达或过表达：在相对于本发明使用时应被广义地认为包括在相同条件下与亲本微生物的一种或多种蛋白质(包括编码一种或多种蛋白质的一种或多种核酸)表达水平相比所述蛋白质表达(包括核酸表达)的任何增加。不应被认为意指所述蛋白质(或核酸)以任何具体水平表达。
8、亲本微生物：是本发明的微生物所来源于的微生物。本发明的微生物可以通过任何方法例如人工或天然选择、突变或基因重组而产生。亲本微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前曾被修饰过但是不生产或不过度生产胞嘧啶的微生物。
9、载体：应被广义地认为包括适合用作媒介将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA)，包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。载体可以包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记物。
10、关于蛋白和基因名称的约定：本发明中涉及的英文蛋白名称均为大写正体；本发明中涉及的英文基因名称均为小写斜体。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种生产胞嘧啶的重组微生物，所述的重组微生物包括以下特征：
(1)核苷水解酶的含量或活性降低，和/或，敲除或敲降核苷水解酶的编码基因；
(2)核苷酸磷酸核苷酶的含量或活性提高，和/或，核苷酸磷酸核苷酶的编码基因增加、拷贝数或活力提高。
具体地，所述的核苷水解酶包括RihA、RihB、RihC中的一种或多种；优选为RihA。
具体地，所述的核苷酸磷酸核苷酶包括PpnN。
具体地，所述的微生物包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、沙门氏菌(salmonella)和酵母菌(Yeast)。
又一方面，本发明提供了上述重组微生物在生产胞嘧啶中的应用。
又一方面，本发明提供了一种生产胞嘧啶的方法，所述的方法包括利用上述重组微生物发酵生产胞嘧啶或利用上述重组微生物全细胞产物催化底物生产胞嘧啶。
具体地，所述的全细胞产物包括但不限于：培养液、细胞裂解液、细胞裂解液的上清部分、细胞裂解液的沉淀部分等。需要说明的是，在未来的技术发展中对于全细胞产物的操作方法及其具体产物类型的新增技术由于未脱离本发明的发明点，也应当在本发明的上述要求保护的范围之内。
具体地，所述的方法包括：
将上述重组微生物活化后制备种子液；
采用摇瓶发酵：按照1-5％接种量接种到发酵培养基中，37℃摇床250rpm培养3-4h，添加终浓度为1mM的IPTG，调节摇床温度至34℃，发酵周期为18-22h。
或采用发酵罐发酵：按照8-12％接种量接种到发酵培养基中，37℃培养，维持pH为6.9，溶氧为30-45％，当溶氧高于40％时，开始偶联补料，培养7-9h，OD600至10-30时，温度维持在37℃，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导，发酵周期为65-69h。
进一步具体地，摇瓶发酵中，
所述的接种量为1-2％。
所述的发酵培养基成分为：每升培养基中葡萄糖20-40g，5N-5倍的盐溶液180-220mL，TM2溶液0.5-1.5mL，柠檬酸铁8-12mg，七水硫酸镁240-250mg，氯化钙105-115mg，硫胺素0.5-1.5μg，以无菌去离子水定容至1L；其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠75.6g，磷酸二氢钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L；TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
所述的发酵周期为20h。
进一步具体地，所述的发酵培养基成分为：每升培养基中葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200mL，TM2溶液1mL，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1μg，以无菌去离子水定容至1L。
进一步具体地，发酵罐发酵中，
所述的接种量为10％。
所述的发酵培养基为半合成培养基，每升培养基中含硫酸铵4-6g，氯化钠1-3g，磷酸二氢钾3-5g，七水硫酸镁1-3g，葡萄糖10-20g，氯化钙0.05-0.15g，氯化锌0.005-0.015g，TM3 0.5-1.5mL，柠檬酸铁90-100mg，玉米浆2-8g，VB1 2-3mg，NA 35-45mg，泡敌0.5-1.5g，以去离子水定容；补料培养基为每升含葡萄糖450-550g，调节pH至6.9；TM3溶液为每升含四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
所述的发酵周期为67h。
进一步具体地，所述的发酵培养基为半合成培养基，每升培养基中含硫酸铵5g，氯化钠2g，磷酸二氢钾4g，七水硫酸镁2g，葡萄糖15g，氯化钙0.105g，氯化锌0.01g，TM3 1mL，柠檬酸铁94mg，玉米浆5g，VB1 2.5mg，NA 40mg，泡敌1g，以去离子水定容；补料培养基为每升含葡萄糖500g，调节pH至6.9。
又一方面，本发明提供了敲除或敲降核苷水解酶的试剂和/或过表达核苷酸磷酸核苷酶的试剂在提高胞嘧啶产量中的应用。
具体地，所述的核苷水解酶包括RihA、RihB、RihC中的一种或多种；优选为RihA。
具体地，所述的核苷酸磷酸核苷酶包括PpnN。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)实际生产过程中，在产胞苷菌株中表达核苷水解酶(RihA)以提高胞嘧啶产量，其产量提高有限，且菌种放大困难。本发明意外发现，敲除微生物基因组中的rihA，表达核苷酸磷酸核苷酶(PpnN)反而大大提高了胞嘧啶的产量，为胞嘧啶的生产提供了新的思路与方法。
(2)采用本发明所述的重组微生物生产胞嘧啶，其产量更高，且发酵周期短，生产强度高，可用于胞嘧啶的大规模工业化生产。
(3)本发明所提供的重组微生物的构建方法是一种定向的理性的菌种构建方法，相比传统诱变方法更为高效便捷，可操作性强。
附图说明
图1为摇瓶发酵胞嘧啶及胞苷产量检测结果图。
图2为摇瓶发酵折合总胞嘧啶检测结果图。
图3为发酵罐胞嘧啶产量检测结果图。
图4为发酵罐菌株生长曲线图。
图5为实施例3所述的微生物的胞嘧啶产量检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的技术方案可以应用大肠杆菌，枯草杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳杆菌或者其他的微生物，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。
实验方法1：基因敲除方法
本发明采用Datsenko的方法进行微生物基因敲除，大致步骤为基于Red重组系统，用具有36-nt同源延伸的引物通过PCR生成的可选择的抗生素耐药基因替换基因序列，从而达到基因敲除的目的。本发明所采用的具体基因敲除的方法记载于文献：K.A.Datsenko,B.L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy Sciences of the USA,2000,97(12):6640-6645。相应的基因敲除引物见Baba 2006.Mol Syst Biol,2(1)0008。
实验方法2：摇瓶发酵验证重组菌株生产胞嘧啶的方法
1、试剂
(1)发酵培养基：每升培养基中葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200mL，TM2溶液1mL，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1μg，以无菌去离子水定容至1L。
其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠每升75.6g，磷酸二氢钾每升15g，氯化钠每升2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L；TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。
(2)LB培养基：每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水定容至1L(著[美]J.莎姆布鲁克.黄培堂译,分子克隆指南2002,1595)。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。
2、仪器：恒温摇床培养箱。
3、方法：
摇瓶发酵过程如下：(1)接种重组菌株至含有抗生素的4mL的LB培养基中，置37℃摇床250rpm培养；(2)取培养16h后的种子500μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h；(3)将2.5mL二级种子全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养4h；(4)添加IPTG至终浓度1mM后，调节摇床温度至34℃，继续培养20h左右，取1mL发酵液离心后(12000rpm，1min)，取上清检测，检测方法详见实验方法4。
实验方法3：发酵罐中重组菌株生产胞嘧啶的方法
1、试剂
(1)发酵培养基：为半合成培养基，每升培养基中含硫酸铵5g，氯化钠2g，磷酸二氢钾4g，七水硫酸镁2g，葡萄糖15g，氯化钙0.105g，氯化锌0.01g，TM3 1mL，柠檬酸铁94mg，玉米浆5g，VB1 2.5mg，NA 40mg，泡敌1g，以去离子水定容。
TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
(2)补料培养基：每升含葡萄糖500g，以氨水调节pH至6.9。
2、仪器
恒温摇床培养箱，发酵罐。
3、方法
发酵过程如下：(1)活化种子，从种子甘油管按接种量0.25％接入装有30mL LB的250mL摇瓶，37℃培养16h至OD600为3-4；(2)以接种量1％接种至装有100mL LB培养基的500mL种子摇瓶，37℃培养4h至OD600为1-2；(3)以接种量10％接种到装有2L半合成培养基的5L发酵罐中，37℃培养，用氨水调节pH为6.9，溶氧转速偶联，维持溶氧在30％，当溶氧高于40％时，开始偶联补料，使溶氧维持在30-45％。发酵8h至OD600为10-30时，温度维持在37℃，加入IPTG，使其终浓度为0.4mmol/L进行诱导，发酵19h后开始取样进行HPLC检测，检测方法详见实验方法4。
实验方法4：HPLC测定发酵液中的胞苷和胞嘧啶
吸取发酵液用水稀释至一定的倍数，离心过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测。HPLC的参数如下：采用Agilent SB C18 4.6*150mm 5μm，流动相为甲醇和10mMPBS(pH 4.0)，流动相比例0.01-2.80分钟甲醇比例为2％，2.80-3.50分钟甲醇比例由2％上升到10％，3.50-3.60分钟甲醇比例由10％降至2％，3.60-8.50分钟甲醇比例为2％，利用紫外检测器检测，波长260nm；初始流动相的流速为1.0mL/min，发酵液的上样量为5μL，柱温30℃。
实施例1：敲除rihA、表达ppnN提高胞嘧啶产量
在实验室构建的产胞苷菌株HS8409(W3110△udk△cdd△purR△cmkΔcodBAΔflgL::trc-nudG-pyrHm△ybbD::carAB948-pyrBCD)基础上，早期研究一直围绕在该产胞苷菌株中表达核苷水解酶(RihA)试图提高胞嘧啶的产量，但发现不管如何改造，胞嘧啶产量提高始终有限，且菌种放大尤其困难。因此，申请人在后续实验过程中转换思路，创造性地敲除了基因组中的rihA，同时过表达核苷酸磷酸核苷酶(PpnN，Uniprot ID:P0ADR8)来催化单磷酸胞苷(CMP)生成胞嘧啶。考虑到CMP由ppnN催化生成胞嘧啶，同时也会生成胞苷，所以在发酵完成后，会产生大部分胞嘧啶和少量胞苷。因此采用核苷水解酶(BL21(DE3ΔcodBA/pET28a-rihA))，具体内容及操作方法详见专利CN201910602231.2实施例5-8)催化发酵液中的胞苷，在最佳反应条件下可近似将1g/L的胞苷转化为0.456g/L的胞嘧啶，在以下的实验中将采用这种方法计算胞嘧啶总产量进行直观对比。
为验证以上观点，分别构建以下5个菌株：1，HS8409ΔrihA/pEZ07-ppnN；2，HS8409ΔppnN/pEZ07-rihA；3，HS8409ΔrihA/pEZ07；4，HS8409/pEZ07-ppnN；5，HS8409/pEZ07-rihA-ppnN。并按实验方法2所述的方法进行摇瓶发酵，按实验方法4所述的方法进行胞嘧啶和胞苷产量的检测。检测结果如图1和图2所示。
根据图1可知，表达rihA的菌株没有胞苷积累，敲除rihA不表达ppnN的菌株几乎没有胞苷积累，单纯比较胞嘧啶产量，敲除rihA并且表达ppnN的菌株产量最高，还有1g/L左右的胞苷积累。将上述5个菌株的胞苷检测结果按投入核苷水解酶(BL21(DE3ΔcodBA/pET28a-rihA))的转化比例来计算总胞嘧啶产量，结果如图2所示。由图2结果可知，摇瓶发酵完成后实际得到的总胞嘧啶产量仍然是敲除了rihA并且表达ppnN的菌株最高。
其中，质粒构建具体过程如下：以pEZ07-ppnN为例，以大肠杆菌W3110(ATCC27325)为模板，分别以引物ppnN-F/ppnN-R扩增ppnN片段(引物序列见表1)，得到的PCR产物大小为1300bp，且电泳检测无杂带，直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒)，得到的纯化片段与NcoI/KpnI酶切回收的pEZ07载体以纳摩尔比3:1进行无缝克隆构建(苏州神洲基因GBclonart无缝克隆试剂盒)，重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，转入TG1化转感受态细胞，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB，复苏培养1h后离心涂布含50mg/L壮观霉素抗性的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒pEZ07-ppnN。
表1表达质粒引物序列
引物名称 序列信息
ppnN-F1 CGATTAAATAAGGAGGAATAAACCatgattacacatattagcccgcttggc
ppnN-R1 GCTTCGAATTCCCATATGGTACttacgtgcagatttcgtagcaaggg
rihA-F1 CAATTCCCATATAAAGGAGGAAGGATCatggcactgccaattctgttag
rihA-R1 cggggacGTCGACTCTAGAGGATCttaagcgtaaaatttcagacgatcag
基因敲除过程具体如下：以ΔrihA为例
(1)以pKD4质粒为模板，用引物对rihA-F2/rihA-R2(引物见表2)，PCR扩增得到含上下游同源臂的Kan-FRT片段，PCR产物过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒)。
(2)HS8409转化pKD46质粒：过夜培养的HS8409种子试管按初始OD600＝0.02转接50mL/250Ml LB摇瓶，37℃，200rpm培养至OD600＝0.4-0.6，将菌液置于冰上预冷15min，6000rpm，4℃离心3min，弃上清，使用预冷的0.1M CaCl2溶液重悬菌体，冰上放置15min，6000rpm，4℃离心3min去上清，重复该步骤3次，按每50mL菌液分别加2mL 0.1M CaCl2和2mL30％预冷甘油重悬，200μL每管分装。每管感受态细胞加入pKD46质粒2μL，冰上混匀后放置15min，42℃热击90s，冰浴2-3min，37℃，200rpm复苏1h，涂布含100ng/mL Amp的LB平板，30℃培养箱过夜培养，获得HS8409/pKD46转化子。
(3)电转化感受态细胞制备：HS8409/pKD46接种于含100ng/mL Amp的LB试管。次日，按照1：100接种至30mL含100ng/mL Amp及20mM L-阿拉伯糖的LB液体培养基，30℃、200rpm培养2h左右OD600＝0.25时，补加L-阿拉伯糖20mM，继续诱导培养1h，使pKD46上的Exo、Bet和Gam三个蛋白充分表达，然后收集菌体进行电转感受态制备；电转感受态制备过程：1)培养好的菌体冰上预冷10min，然后4000rpm、4℃离心10min，弃上清；2)用预冷10％甘油离心洗涤菌体，4000rpm、4℃离心10min，弃上清；3)重复操作2次；4)加入10％甘油浓缩100倍，分装80μL/管。
(4)电转化、验证：1)电转化：将上述扩增纯化的敲除片段约200ng加入上述感受态细胞，混匀，转入0.1cm电击杯中，用电击仪作电转化。电击条件：200Ω，25μF，电击电压1.8kV，电击时间为5ms，电击后迅速加入1mL的LB，37℃，200rpm培养1h，之后涂于含50ng/mLkan的LB平板，37℃过夜培养。
(5)转化子验证：电转化得到的转化子进行菌液PCR验证，引物为rihA-200-F/rihA-200-R，验证正确的转化子进行化转感受态制备，并转化质粒pCP20，涂布含Cm抗性的平板。30℃过夜培养后得到的单克隆接种于含20ng/mL Cm的LB试管，30℃培养4h后转接到LB无抗性液体培养基试管继续培养4h后升温42℃，培养过夜，然后进行涂布LB平板，得到的单克隆分别点板于LB+Amp、LB+Cm以及LB+Kan确认抗性片段消除成功，最后通过引物rihA-200-F/rihA-200-R进行菌液PCR验证，得到菌株HS8409ΔrihA重组菌株。
表2敲除引物序列
实施例2：5L发酵罐检测
将上述实施例1制备的5个菌株进行编号，按照实验方法3所述的方法进行发酵，发酵周期67h，65h时按比例投入核苷水解酶(BL21(DE3ΔcodBA/pET28a-rihA))，将积累的胞苷完全转化为胞嘧啶，按照实验方法4所述的方法进行检测，结果如表3及图3、图4所示。
表3
根据上表3及图3检测结果可知，发酵从19h开始取样HPLC检测产量，敲除rihA并且表达ppnN的菌株胞嘧啶产量及下罐后折合成的胞嘧啶最终总产量都最高，且糖转化率(胞嘧啶total(g)/葡萄糖used(g)*100％)更高，菌株生产效率越高，发酵成本更低。根据图4检测结果可知，从生长曲线来看，HS8409ΔrihA/pEZ07-ppnN(F1)相对于表达rihA的菌株活力更持久，发酵时间更长，同时这也说明表达rihA的菌株在5L罐发酵时普遍存在早衰的情况。
实施例3
在W3110中同时敲除编码胞嘧啶脱氨酶的基因(codA)和胞嘧啶转运蛋白的基因(codB)(命名为HS8411)再次进行实施例1实验，来证明以上观点的普适性。基因敲除过程、表达质粒构建过程及摇瓶发酵过程、HPLC检测方法见实施例1。检测结果如图5所示。
根据图5可知，常规菌株发酵胞嘧啶产量较低，5组菌株均不积累胞苷，不表达ppnN的菌株均不积累胞嘧啶，敲除rihA过表达ppnN胞嘧啶产量最高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州华赛生物工程技术有限公司
<120> 一种生产胞嘧啶的重组微生物及方法
<130> 20220505
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
cgattaaata aggaggaata aaccatgatt acacatatta gcccgcttgg c 51
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
gcttcgaatt cccatatggt acttacgtgc agatttcgta gcaaggg 47
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
caattcccat ataaaggagg aaggatcatg gcactgccaa ttctgttag 49
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
cggggacgtc gactctagag gatcttaagc gtaaaatttc agacgatcag 50
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
acatcctggc gttacccttg tcgcaaagaa gcacacaaca aggagcaaca tgtaggctgg 60
agctgcttcg 70
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
agattaagac cacccaggta acgcgtggtg atcttaatca atgacgtgtg atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 7
cgataccaat ggcgagtt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
gggtgatctt tatggacgag 20

Claims (4)

1.一种生产胞嘧啶的重组微生物，其特征在于：所述的重组微生物包括以下特征：
（1）核苷水解酶RihA的含量或活性降低，和/或，敲除或敲降核苷水解酶RihA的编码基因；
（2）核苷酸磷酸核苷酶PpnN的含量或活性提高，和/或，核苷酸磷酸核苷酶PpnN的编码基因增加、拷贝数或活力提高；
所述的微生物为大肠杆菌。
2.权利要求1所述的重组微生物在生产胞嘧啶中的应用。
3.一种生产胞嘧啶的方法，所述的方法包括利用权利要求1所述的重组微生物发酵生产胞嘧啶。
4.敲除或敲降核苷水解酶RihA的试剂和过表达核苷酸磷酸核苷酶PpnN的试剂在提高胞嘧啶产量中的应用。
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