CN116348606A - 一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶a的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶A的方法，以优化的麦芽糖‑O‑酰基转移酶(MAT)为生物催化剂，以双醋瑞因为酰基供体，辅酶A为受体酶促合成乙酰辅酶A。该方法提供了MAT及其优化的突变体MAT‑E125F、MAT‑E125Q的氨基酸序列和核苷酸序列，以及酶促合成乙酰辅酶A的最适反应条件。本发明优化的MAT‑E125F、MAT‑E125Q催化合成乙酰辅酶A的产量可分别达到3892.70mg·mL‑1和3569.44mg·mL‑1。

Description

一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶A的方法 技术领域
本发明涉及一种合成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)的新颖方法，特别涉及一种酶促催化的高效方法，其催化工具是来源于E.coli(Escherichia coli)BL 21(DE3)中的麦芽糖-O-酰基转移酶(Maltose-O-acetyltransferase，MAT，accession No:ACT42309.1)及其突变体MAT-E125F、MAT-E125Q，底物包括酰基受体辅酶A和酰基供体双醋瑞因，属于生物催化领域。
背景技术
乙酰辅酶A是大量生物基化学品的重要前体物质，如脂肪酸、固醇、氨基酸等。作为最常见的酰基供体，乙酰辅酶A在选择性酶促酰化修饰中也占有重要地位。由此可见，乙酰辅酶A在不同的生物学领域中发挥着核心作用，其供应量是决定目标产物生成量的关键因素。目前，提高乙酰辅酶A通量的研究大多基于微生物自身的代谢途径，以开源节流、通主阻旁为中心思想，以代谢工程为主要实施策略。但是这种依赖于乙酰辅酶A天然生物合成途径的工程化改造方式大多存在着ATP依赖、碳损失等问题。此外，在微生物自身代谢流路与人工调控的代谢通路之间实现代谢流的理想分配是相当困难的。
乙酰辅酶A的体外合成可以通过化学法和酶法两种途径进行。化学法通常存在非选择性修饰的问题，易产生乙酰辅酶A与其他副产物的混合物，加大了目标产物纯品制备的难度。相比之下，酶催化法能够凭借高选择性获得高纯度的乙酰辅酶A。因此，酶促合成法已成为工业合成乙酰辅酶A的主流方法，如Sigma公司利用磷酸转乙酰酶催化乙酰磷酸和辅酶A合成乙酰辅酶A，但该方法中的酰基供体乙酰磷酸稳定性较差，在50℃孵育3-5h后几乎被完全水解。其他可用于合成乙酰辅酶A的工具酶包括肉碱乙酰转移酶、乙酰辅酶A合酶、丙酮酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂解酶，然而这些方法存在辅因子依赖、催化剂不稳定、供体不易得等问题，尚无法实现工业化大规模应用。因此，亟需建立一种切实可行的乙酰辅酶A酶促合成方法，所用催化剂和底物应具有易获得、廉价、稳定等特性。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶A的方法。该方法具有转化效率高、供体稳定易得、反应步骤简单等特点。
本发明的第二目的是提供该方法中所涉及的生物催化剂。
本发明的第三目的是提供该方法中所需要的底物，尤其是酰基供体。
本发明的第四目的是提供该方法的最适反应条件。
为了实现本发明之目的，采用的技术方案为：本发明提供一种酶促合成乙酰辅酶A的高效方法，
a)麦芽糖-O-酰基转移酶或其突变体为生物催化剂。
b)双醋瑞因为供体底物。
c)辅酶A为受体底物。
d)麦芽糖-O-酰基转移酶或其突变体催化辅酶A和双醋瑞因合成乙酰辅酶A。
在反应过程中，为了提高乙酰辅酶A的生成量，对麦芽糖-O-酰基转移酶进行定向进化，获得了催化效率显著提高的突变体MAT-E125F、MAT-E125Q。
具体的，所述合成乙酰辅酶A的酶催化体系中，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1:4～15:1；反应温度为30～70℃；反应pH为3.5～6.5。
作为优选，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为3:8～5:2；反应温度为40～60℃；反应pH为4～6。
更优选，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1:1～5:2；反应温度为45～55℃；反应pH为4.5～5.5。
最优选，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为3:4；反应温度为48～53℃；反应pH为4.6～5.2。
本发明还提供了麦芽糖-O-酰基转移酶MAT为催化剂，其合成乙酰辅酶A的最高产量为2847.47mg·L -1
本发明还提供了优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125F，其氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125F为催化剂，其乙酰辅酶A产量最高可达到3892.70mg·L -1。
本发明还提供了一种优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125Q，其氨基 酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了优化的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125Q为催化剂，其乙酰辅酶A产量最高可达到3159.02mg·L -1。
本发明还提供了一种含有所述核苷酸序列的表达载体，选自pET-28a(+)。
本发明还提供了一种所述表达载体的宿主细胞。其优选的宿主细胞选自大肠杆菌BL21(DE3)。
有益技术效果：
本发明提供了一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶A的方法，催化剂为麦芽糖-O-酰基转移酶MAT或其突变体MAT-E125F、MAT-E125Q，目前尚未见报道。与其他乙酰辅酶A合成方法相比，本发明所述的乙酰辅酶A合成方法具有以下显著特点：酰基供体双醋瑞因稳定性好、易于制备；反应过程无需辅因子参与；催化剂MAT或其突变体MAT-E125F、MAT-E125Q表达量高、易获取；同时也具备操作简便、产率高、反应条件温和、环境友好的优势，可显著降低乙酰辅酶A的制备成本，适合大规模工业化推广应用。
附图说明
图1：BL21(DE3)基因组提取结果，M是DNA分子量标准；1是BL21(DE3)基因组条带。
图2：maa基因的PCR分析结果，M是DNA分子量标准；1是maa基因PCR结果。
图3：重组质粒pET28a-maa示意图。
图4：MAT重组蛋白SDS-PAGE分析考马斯亮蓝染色结果，M为蛋白分子量标准；1为空载体对照；2为pET28a-maa诱导结果；3为MAT纯酶。
图5：MAT纯酶催化辅酶A和双醋瑞因合成乙酰辅酶A的结果：(A)HPLC检测结果，1为底物辅酶A标准品；2为目标产物乙酰辅酶A标准品；3为对照组(不加MAT纯酶)；4为实验组；5为实验组与乙酰辅酶A标准品共进样组。(B)辅酶A标准品，乙酰辅酶A标准品及MAT-Acetyl-CoA的紫外光谱对比图。
图6：MAT催化合成产物MAT-Acetyl-CoA的液质检测结果。
图7：MAT催化合成产物MAT-Acetyl-CoA的结构鉴定。(A)MAT-Acetyl-CoA的 裂分方式。(B)MAT-Acetyl-CoA的二级质谱检测结果。
图8：pH对MAT酶促合成乙酰辅酶A活性的影响。
图9：温度对MAT酶促合成乙酰辅酶A活性的影响。
图10：供受体浓度对MAT酶促合成乙酰辅酶A活性的影响。
图11：GAT与MAT基于结构相似性的序列比对结果。
图12：丙氨酸突变位点与His113和CoA之间的位置关系。
图13：MAT及其丙氨酸突变体催化合成乙酰辅酶A的效率比较。
图14：MAT与辅酶A、双醋瑞因形成的催化中心的分子表面。
图15：MAT及其125位饱和突变体催化合成乙酰辅酶A的效率比较。
具体实施方式
本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
本发明中的Trans1-T1感受态、BL21(DE3)感受态、pEASY @-Blunt Cloning Kit试剂盒、Fast Mutageneis System试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。
本发明中所使用的双醋瑞因购自成都普思生物科技股份有限公司，辅酶A购自上海源叶生物科技有限公司。
本发明的催化反应通过高效液相(HPLC)进行监测与分析。HPLC分析方法为：高效液相色谱仪Agilent 1200，色谱柱型号CAPCELL PAK ADME-HR S5 column(4.6mm I.D×150mm,OSAKA SODA CO.,LTD,Osaka,Japan)，检测波长254nm。A相为95％NaH 2PO 4(0.2M)+5％Na 2HPO 4(0.2M)；B相为80％的0.2M磷酸盐缓冲液(95％NaH 2PO 4+5％Na 2HPO 4)+20％乙腈。
实施例1 MAT基因克隆
挑取大肠杆菌BL21(DE3)单克隆接种于20mL液体LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水)，37℃，220rpm过夜培养。吸取BL21(DE3)细菌培养物3mL置于离心管中，12000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取BL21(DE3)基因组， 取5μL进行电泳，结果如图1所示，获得了一条长度超过8000bp的特异性条带，表明成功提取出基因组DNA。以BL21(DE3)的基因组为模板，将EACYMATF(5'-ATGAGCACAGAAAAAGAAAAGATG-3')(SEQ ID NO.7)和EACYMATR(5'-TTACAATTTTTTAATTATTCTGGC-3')(SEQ ID NO.8)作为扩增MAT编码基因maa的特异性引物，按照如下程序和体系通过PCR扩增maa基因。50μL体系中含10×KOD buffer 5μL，2mM dNTPs 5μL，25mM MgSO 4 2μL，10μM的上游引物和下游引物各1μL，KOD-Plus-Neo 1μL，模板2μL，ddH 2O补足。PCR程序：98℃预变性3min；98℃变性30s，60.3℃退火45s，68℃延伸25s，共30个循环；68℃终延伸7min，4℃保温。PCR产物通过电泳分析，结果表明，扩增得到一条长约为550bp的条带，与maa基因的理论大小相当(图2)。
根据pEASY @-Blunt Cloning Kit试剂盒说明书，将上述PCR产物与pEASY @-Blunt载体按照摩尔比为7:1的比例进行连接，连接产物转化至Trans1-T1感受态中，在含50μg·mL -1卡那霉素的LB固体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠溶于1L蒸馏水中，加入15g琼脂粉)上倒置培养约16h。从该平板上挑取单克隆进行菌落PCR，筛选出阳性克隆送样测序。结果表明，PCR扩增得到的产物与BL21(DE3)基因组中注释的麦芽糖-O-酰基转移酶的核苷酸序列完全一致，全长共552bp，含有该基因的载体命名为pEASY-maa。
实施例2 MAT表达载体的构建
根据In-Fusion(Clontech)同源重组的原理，设计如下用于构建maa基因表达载体的特异性引物，每个引物分别含有载体同源臂和目的基因同源臂，包括Eacy28aMATF(5'-CAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAGCACAGAAAAA-3')(SEQ ID NO.9)和Eacy28aMATR(5'-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACAATTTTTTAAT-3')(SEQ ID NO.10)。以测序正确的质粒pEASY-maa为模板，以Eacy28aMATF和Eacy28aMATR为特异性引物，按照实施例1中相同的程序和体系进行PCR，以获取目的基因片段。
将获得的PCR产物通过同源重组的方法连接到经EcoR I和Hind III双酶切处理过的pET-28a(+)线性载体中，连接产物转化到Trans1-T1感受态中，在卡那霉素抗性的LB固体培养基上倒置培养约16h，挑取单克隆进行菌落PCR，筛选出阳性克隆进行测序。结果表明，maa基因已成功插入到pET-28a(+)中，所获质 粒命名为pET28a-maa(图3)。
实施例3 MAT蛋白的诱导表达和检测
将构建好的质粒pET28a-maa用热激法转化至表达感受态BL21(DE3)中，转化产物涂布于卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养约16h，直至长出单克隆。挑取单克隆转接于10mL卡那霉素抗性(50μg·mL -1)的LB液体培养基，37℃，220rpm过夜培养，按1:100的比例将种子液转接入100mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，至菌液OD 600约为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，18℃，160rpm诱导培养16小时。
取1.5mL诱导后的菌液，12000rpm，离心1min收集菌体。加入100μL磷酸盐缓冲液(pH 8.0，20mM Na 2HPO 4/NaH 2PO 4)重悬菌体沉淀，菌体悬浮液采用超声破碎法破碎(超声3s，停3s，总工作时间为2min)。破碎液通过12000rpm，离心2min。而后取40μL上清，加入10μL的5×Loading buffer，100℃水浴5min。取6μL处理好的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，通过考马斯亮蓝法进行染色(图4)，结果显示在标准蛋白分子量25kDa附近处有明显的加粗条带，该条带的大小等于MAT蛋白分子量与其N末端融合的pET-28a(+)序列表达的His标签肽段分子量之和。在对照组(泳道1)相应位置则未观察到该条带，表明MAT蛋白在大肠杆菌中成功表达。
实施例4重组MAT蛋白的纯化和定量
E.coli[pET28a-MAT]在18℃，160rpm条件下，经0.2mM IPTG诱导培养16h后，利用大型高速离心机，在6566rpm，4℃的条件下离心6min，收集菌体。按1L菌液加入30mL的磷酸盐缓冲液(pH 8.0，20mM Na 2HPO 4/NaH 2PO 4)的比例将低温离心后的菌体重悬，冰浴条件下超声破碎(超声5s，间歇5s，总时间40min)。大量菌体则采用高压细胞破碎仪进行破碎，在800bar压力下循环破碎3次；在10000rpm、4℃的条件下离心30min。收集破碎后所得粗酶液，按1U/10mL的比例加入RNase-free DNase I(TaKaRa公司)，在4℃条件下过夜消化以去除核酸。而后在10000rpm，4℃的条件下再次离心30min，去除经DNA酶消化后的碎片，所得上清通过镍离子亲和层析法进行纯化。首先将处理好的蛋白上样液加入已经预平衡的Ni胶纯化树脂，使蛋白同胶结合。然后用洗脱缓冲液(pH 8.0，20mM Na 2HPO 4/NaH 2PO 4，10-30mM咪唑)冲洗不能结合以及非特异性结合的蛋白，用洗脱缓冲液(pH 8.0，20mM Na 2HPO 4/NaH 2PO 4，60-300mM咪唑)冲洗 结合在Ni胶上的带有His标签的目的蛋白，重组MAT蛋白在200mM咪唑缓冲液中被集中洗脱下来。收集流出液，取10μL进行SDS-PAGE分析，利用考马斯亮蓝染色法对蛋白进行染色(图4)，于泳道3中观察到在蛋白标准分子量25kDa附近出现单一且清晰的条带，说明纯化后的MAT蛋白样品纯度较高。
纯化后的蛋白用10kDa的超滤管进行超滤，以达到去除咪唑及浓缩蛋白的目的。所得蛋白加入终浓度为20％的甘油，混匀后分装至EP管中，-20℃保存。通过Bradford法对纯化浓缩的MAT蛋白进行定量以确定蛋白浓度，具体过程如下。用与待测蛋白样品一致的稀释液将标准浓度牛血清白蛋白BSA(2000μg·mL -1)逐级稀释形成梯度浓度(1500，1000，500，250，125μg·mL -1)，取0μg·mL -1浓度为空白对照；分别取5μL稀释好的BSA标准品以及待测蛋白样品(原液或者稀释液)加入到96孔板中，再加入250μL Bradford protein Assay Peagent，每组平行重复3次，充分混匀，室温放置10min，而后用酶标仪检测595nm波长下的吸光值；以蛋白含量(μg·mL -1)为横坐标，吸光度值(A 595)为纵坐标，绘制标准曲线，计算待测样品的浓度。根据获得的标准BSA蛋白的浓度方程：计算纯化后的MAT蛋白浓度为127.61mg·mL -1。
实施例5 MAT催化合成乙酰辅酶A
1、乙酰辅酶A的酶法合成
以纯化的MAT蛋白作为催化剂，建立100μL柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0，10mM)的反应体系，包括1.5μL的辅酶A(500mM)，5μL的双醋瑞因(100mM)和158.63μg纯化的MAT蛋白酶。反应在50℃中进行2h，而后用等体积100μL甲醇终止，12000rpm离心2min，收集反应上清，用0.22μL滤膜过滤，取15μL滤液进行HPLC分析。同时设置空白对照组，以水代替MAT纯酶，与样品组在相同条件下进行处理。
2、HPLC检测
通过HPLC对经过处理的滤液样品进行检测，检测程序如表1所示。HPLC检测结果如图5A所示，加入MAT纯酶后，实验组中形成了和乙酰辅酶A标准品保留时间(17.516min)相同的化合物，该化合物具有和乙酰辅酶A标准品相同的紫外吸收谱(图5B)，表明其与乙酰辅酶A具有相似的骨架结构，将其命名为MAT-Acetyl-CoA。将乙酰辅酶A标准品与实验组进行共进样检测，结果显示实验组中的MAT-Acetyl-CoA新产物峰明显升高，初步判断MAT-Acetyl-CoA即为乙酰 辅酶A。
表1乙酰辅酶A的HPLC检测条件
时间 A相(％) B相(％) 流速(mL/min)
0 97 3 1
5 82 18 1
7.5 72 28 1
12.5 60 40 1
18 58 42 1
19 3 97 1
20 97 3 1
25 97 3 1
2、质谱分析
在此基础上，对MAT-Acetyl-CoA进行纯化制备，通过高分辨液质(LC/MS)和高分辨二级质谱(MS/MS)确认该化合物的结构。ESI-MS显示其准分子离子峰m/z 808.0526[M-H] -和810.1315[M+H] +，表明该化合物为辅酶A乙酰化后的产物(图6和图7)。进一步，通过MS/MS光谱分析对该产物的裂分方式进行推断(图7A)，以进一步鉴定MAT-Acetyl-CoA的结构。由于短链酰基辅酶A在正离子模式下具有更高的检测灵敏度，因此选择MAT-Acetyl-CoA的[M+H] +质子化分子离子进行MS/MS测量。m/z 810[M+H] +的源内裂解产生了两个特征性片段，其m/z分别为507和303。m/z 507碎片与乙酰辅酶A的二磷酸腺苷部分相对应，而m/z 303碎片则代表乙酰辅酶A中乙酰基与泛酰巯基乙胺部分。此外，还能观察到发生在磷酸腺苷二磷酸的α-和β-磷酸基团之间的碎裂，分别在m/z 382和428处形成两个碎片(图7B)。
以上数据结果可证明样品组中新产生的化合物MAT-Acetyl-CoA即为目标产物乙酰辅酶A。表明在MAT的催化下，双醋瑞因是一个有效的酰基供体，可成功地将乙酰基团转移到辅酶A的巯基基团上，合成乙酰辅酶A。
实施例6 MAT酶促合成乙酰辅酶A最适反应条件测定
1、MAT催化合成乙酰辅酶A最适温度的测定
探究温度对MAT体外酶促合成乙酰辅酶A活性的影响，设计6个平行反应温度梯度：20、30、40、50、60、70、80℃，每组设立有3个平行样品。具体反应体系及HPLC检测条件同实施例5。结果表明(图8)，MAT催化合成乙酰辅酶A的最适温度为50℃，当温度高于或低于此温度时，产物的转化率明显下降，因此 在反应过程中需要准确地控制温度。相比于较低的温度(20-40℃)，适当的提高温度有助于MAT展现出更好的催化活性，表明MAT对高温的耐受性更强。
2、MAT催化合成乙酰辅酶A最适pH的测定
探究pH对MAT体外酶促合成乙酰辅酶A活性的影响，设计5个平行反应pH梯度：3、4、5、6、7，每组设立3个平行样品。其中pH＝3-5为10mM的柠檬酸盐缓冲液，pH＝6-7为20mM的磷酸盐缓冲液。具体反应体系及HPLC检测条件同实施例5。结果表明(图9)，MAT催化合成乙酰辅酶A的最适pH为5。该反应具有较强的pH敏感度，在非最适pH的条件下，其反应效率降至最佳值的50％以下。此外，碱性条件不适合MAT活性发挥，当pH大于7时，其乙酰辅酶A合成效率几乎为零。
3、MAT催化合成乙酰辅酶A酶促动力学参数的测定
在最适pH 5.0和最适温度50℃条件下，对MAT催化乙酰辅酶A合成的酶促动力学参数进行测定(表2)。MAT对酰基供体双醋瑞因的K m值明显低于辅酶A，表明MAT对双醋瑞因的亲和力高于辅酶A水合物。
表2 MAT催化乙酰辅酶A合成的酶促动力学参数
Substrate K m(μM) V max(μM/min)
Coenzyme A 188.80±44.33 2.29±0.32
Diacerein 98.78±11.16 7.73±0.24
4、MAT酶促合成乙酰辅酶A的最佳供受体浓度的测定
为提高乙酰辅酶A的合成产量，探究供受体摩尔比对转化效率的影响。首先，配置不同浓度的双醋瑞因母液：10，20，40，60，100，140，200，300，400，600mM。当浓度大于等于140mM时，双醋瑞因的母液呈现混悬液的状态。在pH 5.0，50℃条件下，参照实施例5建立反应体系，固定辅酶A水合物的终浓度为7.5mM，双醋瑞因终浓度为0.5-30mM。HPLC检测结果显示，当双醋瑞因的最终浓度为10mM时，乙酰辅酶A的产量为最高值，可达到2847.47mg/L。继续增大双醋瑞因的终浓度，乙酰辅酶A的产量几乎不再变化(图10)。
综上，MAT催化合成乙酰辅酶A的最适反应条件如表3所示。
表3 MAT催化乙酰辅酶A合成的最适条件
酶 酰基受体(最佳浓度) 酰基供体(最佳浓度) 最佳受/供体比例 最适温度 最适pH
MAT 辅酶A(7.5mM) 双醋瑞因(10mM) 3:4 50℃ 5.0
实施例7酰基供体双醋瑞因和酰基受体辅酶A与MAT蛋白结构的分子对接模拟
1.MAT与GAT的序列比对
MAT(PDB 6AG8_A)和GAT(半乳糖苷-O-酰基转移酶，PDB 1KRU)是同属于“Hexapeptide repeat family”的三聚体蛋白，具有相似的蛋白结构。已有的结构和生化数据表明，MAT和GAT具有相似的催化功能，序列比对表明这两个蛋白的氨基酸序列具有41％的同源性，根据序列比对结果将His113确定为MAT的催化活性中心(图11)。
2.分子对接模拟
计算软件使用MOE 2015.10版本，步骤如下：
(1)MAT蛋白模型和配体底物的结构准备
分别从PDB数据库(http://www1.rcsb.org/)和ZINC15数据库(http://zinc15.docking.org/)中下载MAT蛋白的晶体结构(PDB 6AG8_A)以及配体(辅酶A和双醋瑞因)的分子结构。利用MOE软件删去MAT蛋白结构中的水分子，并进一步利用“Quickprep”功能完成结构修正，加氢以及局部电荷计算。将力场设定为Amber10:EHT，将gradient设定为0.05RMS，其他值设定为默认值，以实现MAT蛋白模型的能量最小化。辅酶A和双醋瑞因的结构准备过程与以上MAT蛋白模型的结构准备过程相同，包括结构优化与能量最小化。
(2)对接模拟
将His113确定为MAT蛋白的催化活性中心。利用MOE软件中“Site Finder”功能将含His113且评分最高的区域设置为Dummy Atoms。利用MOE算法的DOCK功能将辅酶A和双醋瑞因对接到MAT蛋白的活性区域内。设置对接参数：Site选择Dummy Atoms；Placement选择Triangle Matcher，评分对应选择London dG，Refinement选择Induced Fit，评分选择GBVI/WSA dG。
实施例8定向进化筛选MAT高效突变体
1、MAT蛋白的丙氨酸突变
为进一步提高乙酰辅酶A的合成产量，通过定向进化的方法筛选具有高效合成乙酰辅酶A功能的MAT突变体。如图12所示，辅酶A的巯基与His113残基的N 3原子之间能够形成氢键，进而发生相互作用。以此对接模型为基础，选定5个可能对MAT催化合成活性产生影响的氨基酸，包括3个与His 113的N3原子的 距离小于
Figure PCTCN2021104951-APPB-000001
的氨基酸(Met 101，Glu 125和Trp 137)和2个与辅酶A的S原子距离小于
Figure PCTCN2021104951-APPB-000002
的氨基酸(Phe81，Asn83)。通过丙氨酸突变的方式观察上述位点对MAT催化乙酰辅酶A合成效率的影响。利用Fast Mutageneis System试剂盒进行定点突变，根据试剂盒中的说明书进行引物设计，每条引物均包含突变位点，5’端重叠区和3’端延伸区。以质粒pET28a-maa为模板，以丙氨酸突变引物(SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.20)为特异性引物，通过如下程序和体系进行PCR，50μL体系中含模板pET28a-MAT 1μL，10μM的引物FET28aMAT和RET28aMAT各1μL，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25μL，ddH 2O补足。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性20s，55-60℃退火20s，72℃延伸3min，共20个循环；72℃终延伸10min，4℃保温。PCR产物经DMT去甲基消化酶消化后转入DMT感受态中。经菌落PCR筛选以及测序验证，获得相应位点的丙氨酸突变体。
2、MAT丙氨酸突变体的催化效率比较
在最佳反应条件下，即pH 5.0，温度50℃，对MAT-M101A，MAT-E125A，MAT-W137A，MAT-F81A，MAT-N83A突变体催化乙酰辅酶A合成的效率进行比较。结果如图13所示，与野生型MAT相比，MAT-E125A的催化效率略有提高，而其余丙氨酸突变体的催化效率维持不变或者显著下降。表明125位谷氨酸残基对MAT蛋白的乙酰辅酶A合成反应具有促进作用。图14所示的分子对接结果阐明了Glu125在反应过程中的调节作用，MAT催化活性中心His113的N 1原子与Glu125的羰基氧形成氢键，从而增加His113的N 3原子的碱性，进而调节MAT的乙酰辅酶A合成活性。
3、饱和突变筛选MAT的高效突变体
由于MAT的125位丙氨酸突变体在乙酰辅酶A的合成过程中表现出促进作用，故对MAT的125位进行饱和突变。以质粒pET28a-maa为模板，以SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.58所示核苷酸序列为特异性引物，参考实施例8中的PCR程序和体系对MAT的125位进行饱和突变。如图15所示，共筛选出12个乙酰辅酶A合成效率得到提高的突变体。其中MAT-E125F的乙酰辅酶A合成效率最高，其次为MAT-E125Q。MAT-E125F和MAT-E125Q催化乙酰辅酶A的最终产率分别为3892.70mg·mL -1和3569.44mg·mL -1。

Claims (13)

  1. 一种乙酰辅酶A的合成方法，其特征在于，
    a)麦芽糖-O-酰基转移酶或其突变体为生物催化剂；
    b)双醋瑞因为供体底物；
    c)辅酶A为受体底物；
    d)麦芽糖-O-酰基转移酶催化辅酶A和双醋瑞因合成乙酰辅酶A。
  2. 根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的麦芽糖-O-酰基转移酶MAT，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1，核苷酸序列选自SEQ ID NO.2。
  3. 根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125F、MAT-E125Q，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5。
  4. 根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体的核苷酸序列包括所有能编码MAT-E125F、MAT-E125Q的核苷酸序列。
  5. 根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述的麦芽糖-O-酰基转移酶突变体MAT-E125F、MAT-E125Q，其核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6。
  6. 根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述双醋瑞因供体的分子结构式如下：
    Figure PCTCN2021104951-APPB-100001
  7. 根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述辅酶A受体的分子结构式如下：
    Figure PCTCN2021104951-APPB-100002
  8. 根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A的分子结构式如下：
    Figure PCTCN2021104951-APPB-100003
  9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成乙酰辅酶A是在酶催化体系中进行的，酰基受体辅酶A与酰基供体双醋瑞因的摩尔比为1:4～15:1；反应温度为30～70℃；反应pH为4～6。
  10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，合成乙酰辅酶A或在体外以非细胞形式进行，或以全细胞转化的形式进行。
  11. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的全细胞选自大肠杆菌。
  12. 一种含有权利要求2、3和4所述的核苷酸序列的表达载体。
  13. 根据权利要求11所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的宿主细胞选自大肠杆菌。
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