CN112481231B - 一种兼具酰基转移酶和谷丙转氨酶活性的双功能酶 - Google Patents

一种兼具酰基转移酶和谷丙转氨酶活性的双功能酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兼具酰基转移酶和谷丙转氨酶活性的双功能酶。本发明首次从深海真菌拟茎点霉FS508中分离并鉴定了新型具有显著酰基转移酶活性和具有一定谷丙转氨酶活性的双功能酶GPAT；并以乙酰CoA和α‑酮戊二酸为底物验证了GPAT的酶活力。本发明的酰基转移酶GPAT相比已知的酰基转移酶具有更强的酶活力，且具有较好的热稳定性，为解析lithocarpins的生物合成和生物转化机制并促进活性次级代谢产物的生物转化提供可靠的物质基础和分子生物学基础，从而促进lithocarpins的生物转化、高效生物合成及其在生物医药领域的进一步广泛应用。

Description

一种兼具酰基转移酶和谷丙转氨酶活性的双功能酶
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种兼具酰基转移酶和谷丙转氨酶活性的双功能酶。
背景技术
深海真菌由于其特殊的生长环境和庞大复杂的基因组能产生多种新型活性次级代谢产物，同时也是发掘新型生物催化酶的资源宝库。
本课题组前期从深海真菌Phomopsis lithocarpus FS508中分离鉴定了其中Tenellone杂合十元大环内酯的新骨架化合物lithocarpins A-G，具有显著的抗肿瘤活性。在此基础上，对P.lithocarpus FS508进行二代+三代全基因组测序，预测了lithocarpins生物合成基因簇。酰基转移酶在次级代谢产物生物转化方面发挥重要作用。根据lithocarpins系列化合物的结构，预测该基因簇存在酰基转移酶修饰其结构。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于深海真菌的新型具有酰基转移酶活性和具有一定谷丙转氨酶活性的双功能酶GPAT。
本发明的第一个目的是提供一种酰基转移酶GPAT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供编码所述的酰基转移酶GPAT的酰基转移酶基因。
优选，所述的酰基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供含有所述的酰基转移酶基因的重组表达载体。
本发明还提供含有所述的酰基转移酶基因的重组宿主细胞。
本发明还提供所述的酰基转移酶GPAT作为酰基转移酶和谷丙转氨酶的应用。
发明人基于本课题组前期的数据积累，初步预测lithocarpins生物合成基因簇中g7779编码的蛋白具有酰基转移酶活性。因此对该基因进行扩增，并进行异源表达纯化，并对其酶活力进行分析。经验证，本发明提供的GPAT酶具有显著的酰基转移酶活性，为lithocarpins生物合成机制的解析奠定了分子生物学基础，也为拓宽酰基转移酶数据库和促进活性次级代谢产物的生物转化提供了物质基础。
本发明以深海真菌Phomopsis lithocarpus FS508基因组为模板，根据基因簇中的基因g7779序列设计引物，扩增获得基因g7779。回收目的片段，采用ClonExpress UltraOne Step Cloning Kit(诺唯赞生物科技有限公司，南京)同源重组试剂盒将目的基因插入用限制性内切酶NdeI、HindⅢ双酶切的表达载体pET28a，含Amp的LB平板筛选，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并测序验证。Ni亲和层析柱对目标蛋白进行纯化，含咪唑洗脱液进行洗脱，从而获得纯的GPAT蛋白。将所得蛋白用12％SDS-PAGE胶进行鉴定，并切割条带送至辉骏生物技术有限公司(广州，中国)进行氨基酸测序，从而获得GPAT蛋白的氨基酸序列。
本发明还提供新型双功能酶的酶活力检测方法：
1)酰基转移酶活性检测方法：以乙酰CoA，丁醇为底物，加入GPAT蛋白，并加入DTNB进行显色，通过检测412nm处的吸光值测定GPAT酰基转移酶的活力；
2)谷丙转氨酶活性检测方法：GPAT蛋白催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨反应，生成丙酮酸和谷氨酸；加入2,4-二硝基苯肼溶液，不仅终止上述反应，而且与丙酮酸反应形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，通过在520nm读取吸光值并计算谷丙转氨酶活力。
酰基转移酶在次级代谢产物生物转化方面发挥重要作用，本发明首次从深海真菌拟茎点霉FS508中分离并鉴定了新型具有显著酰基转移酶活性和具有一定谷丙转氨酶活性的双功能酶GPAT。并以乙酰CoA和α-酮戊二酸为底物验证了GPAT的酶活力。本发明所得的新型酰基转移酶GPAT相比已知的酰基转移酶具有更强的酶活力，且具有较好的热稳定性，为解析lithocarpins的生物合成和生物转化机制并促进活性次级代谢产物的生物转化提供可靠的物质基础和分子生物学基础，从而促进lithocarpins的生物转化、高效生物合成及其在生物医药领域的进一步广泛应用。
本发明的深海真菌拟茎点霉FS508(Phomopsis lithocarpus FS508)公开于专利申请号CN201810974840.6，发明名称为：化合物lithocarpinol B及其制备方法和在制备抗真菌药物中的应用。
附图说明
图1为重组载体pET28a-g7779的构建：A)为g7779的扩增；B)为g7779插入pET28a的菌液PCR验证；
图2为新型GPAT蛋白的表达纯化图；A)为诱导原核表达的含GPAT蛋白的上清SDS-PAGE检测的结果，B)为上清总蛋白经Ni亲和层析柱的各部分洗脱液SDS-PAGE检测的结果；
图3为新型GPAT蛋白的氨基酸测序结果：A)为氨基酸测序比对结果；B)为氨基酸测序结果在uniprot数据库的注释结果；
图4为新型GPAT蛋白对酰基转移酶的酶学性质分析结果：A)为GPAT蛋白的最适温度分析；B)为GPAT蛋白的最适pH分析；C)为GPAT蛋白的热稳定性分析；D)为GPAT蛋白的米氏常数分析。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1:
深海真菌Phomopsis lithocarpus FS508中新型双功能酰基转移酶GPAT的表达纯化及鉴定
提取深海真菌P.lithocarpus FS508的基因组为模板，根据基因簇中的基因g7779序列设计引物，用引物g7779-F和g7779-R扩增目的基因，扩增得到与目的基因g7779大小一致的DNA片段(图1A)。采用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(诺唯赞生物科技有限公司，南京)同源重组试剂盒将纯化的PCR产物(目的基因g7779)插入用限制性内切酶NdeI、HindⅢ双酶切的表达载体pET28a，含Amp的LB平板筛选，挑取克隆扩大培养，菌液PCR筛选阳性克隆并测序验证，构建得到原核表达载体pET28a-g7779。
具体如下：
引物g7779-F和g7779-R序列如下：
g7779-F：5’-TAAGAAGGAGATATACCatggcaaaaggggccgcc-3’，
g7779-R：5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGacacagcacgtgtccaacaaatt-3’。
目的基因片段的克隆：
以菌P.lithocarpus FS508的基因组DNA为模板，利用PCR扩增目的基因g7779，反应体系见表1，PCR反应条件见表2。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002825801540000031
表2 PCR反应条件
Figure BDA0002825801540000032
Figure BDA0002825801540000041
用上述的引物g7779-F和g7779-R对阳性克隆进行菌液PCR的结果初步验证了基因g7779成功插入至pET-28a(图1B)。通过测序结果的进一步比对，确定其为981bp的目的基因g7779(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，成功构建表达载体pET28a-g7779。
将构建成功的重组质粒pET28a-g7779转化至E.coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达。结果表明：低温条件(18℃)下，目的蛋白主要在上清中表达，而在E.coli的正常生长温度(37℃)下，表达以沉淀形式为主；其中，中条件18℃、0.1mM IPTG诱导过夜的菌液经处理得到的表达上清)条带在上清中占总蛋白含量比例最高。因此，GPAT蛋白(基因g7779编码的蛋白)的最佳表达条件为：18℃、0.1mM IPTG、200r/min过夜振荡诱导，经诱导原核表达的目的蛋白大小约为40kDa，而且蛋白主要以可溶形式表达(图2A)。
Ni亲和层析柱对目标蛋白进行纯化，含咪唑洗脱液进行洗脱。上清总蛋白经Ni亲和层析柱的各部分洗脱液SDS-PAGE检测的结果如图2B。结果显示：分别在68mM、116mM咪唑的洗脱液中检测到目的蛋白，并且目的蛋白纯度很高，经Bandscan 5.0分析，116mM咪唑洗脱液中GPAT蛋白的纯度为98.6％。将所得蛋白用12％SDS-PAGE胶进行鉴定，并切割条带送至辉骏生物技术有限公司(广州，中国)进行氨基酸测序，从而获得GPAT蛋白的氨基酸序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
由于该GPAT酶的编码DNA序列在NCBI数据库中未检索到相似序列，故将其注释为未知蛋白，这也在一定程度上预示了该蛋白的新颖性。
发明人对纯化后的GPAT蛋白切胶回收后用特异性内切酶如胰酶等消化后进行了质谱检测。质谱检测结果如图3A所示，灰色底纹(点式下划线标出)部分为质谱检测结果与目的蛋白GPAT的可匹配氨基酸序列，在Uniprot数据库中的序列比对结果表明该蛋白氨基酸序列与转录组测序分析结果几乎一致，再次验证了所纯化的蛋白即为目标蛋白。同时在该数据库中对蛋白功能进行比对和预测，结果如图3B所示，推测该蛋白可能具有谷丙转氨酶或者酰基转移酶的功能。
实施例2：
新型双功能酰基转移酶GPAT的酰基转移酶酶学性质分析，具体步骤如下：
在对质谱检测结果进行分析的基础上，为了进一步验证该蛋白的功能，发明人用相关功能酶活试剂盒(索莱宝生物科技转移酶BC2350酰基转移酶试剂盒)进行了初步检测。检测结果表明：该GPAT蛋白具有较弱的谷丙转氨酶功能，其比酶活为12.45U/mg；但GPAT蛋白具有较显著的酰基转移酶功能，其最高比酶活为15064U/mg。同时以另一种已知的来源于广藿香内生真菌Myrothecium roridum A553的酰基转移酶GNAT1为对照，经检测，其最高比酶活仅为235U/mg。由此，认为GPAT蛋白是一种新型的酰基转移酶，并且具有很强的的酰基转移酶活性。在此基础之上，发明人以乙酰CoA为底物，对GPAT进行了酶学性质分析。
酰基转移酶活性检测参考Garvey等人的方法，配制Buffer A：5mM acetyl CoA,0.1M PBS,pH 8.0；Buffer B：5g/L丁醇,0.1M PBS,pH 8.0；Buffer C：0.2mg/mL GPAT蛋白；Buffer D：20mM DTNB,0.1M PBS,pH 8.0。
配制反应体系(300μL)：10％A+10％B+10％C+1％D+69％Buffer，同时配制一组不含蛋白的空白对照，分别混匀，置于比色皿中，在反应进行0、5、10、15、20min时，用酶标仪分别测得其在412nm下的吸收值。常温下，每mL反应体系中每mg蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为一个酶活单位，以U/mg表示。计算公式为：
U/mg＝(△A测-△A空)/0.001/(Cpr*0.1mL)/T；其中Cpr表示蛋白浓度，mg/mL；T表示反应时间，min。
温度会影响酶催化反应的速率，不同来源酶最适反应温度存在差异。在缓冲液pH＝7.0、底物Acetyl CoA浓度为0.4mM时，计算GPAT蛋白在不同温度下的相对酶活，如图4A所示，其酶活力最高达到6064U/mg，所对应的最适温度T＝35℃。
pH会影响酶的构象，还会影响酶与底物的解离状态，从而影响酶的活性和稳定性。在室温(25℃)下，底物Acetyl CoA浓度为0.4mM时，计算GPAT蛋白在不同pH下的相对酶活，如图4B所示，酶活力最大达到5033U/mg，所对应的最适pH＝7.0。
在室温(25℃)下，底物Acetyl CoA浓度为0.4mM，缓冲液pH＝7.0时，测定蛋白的的热稳定性，结果如图4C。可以发现：发现其在40℃时的热稳定性较好，在此温度下处理2h后，残留酶活力仍大于80％；在45℃时处理2h残留酶活力为25％左右；50℃下热稳定性较差，处理30min后残留酶活力低于10％。
计算不同底物浓度下GPAT的反应速率，用Lineweaver-Burk双倒数法测定GPAT酶促反应中的动力学参数。如图4D，GPAT催化反应与米氏动力学规律相符合，1/[S]与1/v呈线性关系，计算可知GPAT的Km＝0.797mM，Vmax＝2000μmol/(mg·min)，表明在酶的催化反应过程中，GPAT酶与底物乙酰CoA之间具有较高的亲和力，因此GPAT也表现出很强的酰基转移酶活力。
序列表
<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
<120> 一种兼具酰基转移酶和谷丙转氨酶活性的双功能酶
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 拟茎点霉FS508(Phomopsis lithocarpus FS508)
<400> 1
atggcaaaag gggccgcccg atcgaatgga aaacgcgcca agcagtctcg acttcagcat 60
ctcgacccct taatcagcac acggagagag gacggcctgt ggcagagcat tgaaagggat 120
gaggcagaat tggcatcttc tgacaatgat tctactgtca gtcccgtcaa tgagccatct 180
ttggtagcaa aggagaaggg tgcttccggc caagatgtcg ttcactggcc tcaccaagac 240
ctctcgacgg ccagacaaac gtccaggacc tcagagacgc tgtctgctga tgacatcaag 300
cccataaagg aagagaacaa ttcagccagc caacgctcca taaccccaac caaggccgac 360
atcctagcca gcgtgctcac ctctcctacc ccatacccaa gtcttccaac gcccgctcgc 420
cctgttacaa acgcacctca agctgcacca ccgacaccag ctcagactcc gccagcacca 480
aagaggcgca ggggaagacc caggaagtcg agaaacgccc caaactggaa caggcgccgc 540
cgcgtccgct tctccgaccc cattccgtcc aacgatccag atccacggcc agaagaacct 600
cgagacaccc acgtcttcgt ccgtctgctc aagatagtcg tcaccgtcga cgatccccct 660
ccatcccaga gacaggaatt ggggtggaat aatcggtcca agggttggag actggccggg 720
gagaggagcg agcggaacat tggggatatt ggcgagctgt ttgacgatct gtcggtgcac 780
ggctcgcaat tgacggtcct tcttgcccct acggttggta gaggagcccg ggagccggtg 840
gagatgagct ggaacgcggt gagatggtgt ttccagggtg ccaatcagga ccttgggagt 900
ttgtcggtcg ctttgggcga gatgaaagac atggtgaagg atccgtgggc gaggcaattt 960
gttggacacg tgctgtgtta g 981
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> 拟茎点霉FS508(Phomopsis lithocarpus FS508)
<400> 2
Met Ala Lys Gly Ala Ala Arg Ser Asn Gly Lys Arg Ala Lys Gln Ser
1 5 10 15
Arg Leu Gln His Leu Asp Pro Leu Ile Ser Thr Arg Arg Glu Asp Gly
20 25 30
Leu Trp Gln Ser Ile Glu Arg Asp Glu Ala Glu Leu Ala Ser Ser Asp
35 40 45
Asn Asp Ser Thr Val Ser Pro Val Asn Glu Pro Ser Leu Val Ala Lys
50 55 60
Glu Lys Gly Ala Ser Gly Gln Asp Val Val His Trp Pro His Gln Asp
65 70 75 80
Leu Ser Thr Ala Arg Gln Thr Ser Arg Thr Ser Glu Thr Leu Ser Ala
85 90 95
Asp Asp Ile Lys Pro Ile Lys Glu Glu Asn Asn Ser Ala Ser Gln Arg
100 105 110
Ser Ile Thr Pro Thr Lys Ala Asp Ile Leu Ala Ser Val Leu Thr Ser
115 120 125
Pro Thr Pro Tyr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Ala Arg Pro Val Thr Asn
130 135 140
Ala Pro Gln Ala Ala Pro Pro Thr Pro Ala Gln Thr Pro Pro Ala Pro
145 150 155 160
Lys Arg Arg Arg Gly Arg Pro Arg Lys Ser Arg Asn Ala Pro Asn Trp
165 170 175
Asn Arg Arg Arg Arg Val Arg Phe Ser Asp Pro Ile Pro Ser Asn Asp
180 185 190
Pro Asp Pro Arg Pro Glu Glu Pro Arg Asp Thr His Val Phe Val Arg
195 200 205
Leu Leu Lys Ile Val Val Thr Val Asp Asp Pro Pro Pro Ser Gln Arg
210 215 220
Gln Glu Leu Gly Trp Asn Asn Arg Ser Lys Gly Trp Arg Leu Ala Gly
225 230 235 240
Glu Arg Ser Glu Arg Asn Ile Gly Asp Ile Gly Glu Leu Phe Asp Asp
245 250 255
Leu Ser Val His Gly Ser Gln Leu Thr Val Leu Leu Ala Pro Thr Val
260 265 270
Gly Arg Gly Ala Arg Glu Pro Val Glu Met Ser Trp Asn Ala Val Arg
275 280 285
Trp Cys Phe Gln Gly Ala Asn Gln Asp Leu Gly Ser Leu Ser Val Ala
290 295 300
Leu Gly Glu Met Lys Asp Met Val Lys Asp Pro Trp Ala Arg Gln Phe
305 310 315 320
Val Gly His Val Leu Cys
325

Claims (6)

1.一种酰基转移酶GPAT，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的酰基转移酶GPAT的酰基转移酶基因。
3.根据权利要求2所述的酰基转移酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种含有权利要求2所述的酰基转移酶基因的重组表达载体。
5.一种含有权利要求2所述的酰基转移酶基因的重组宿主细胞。
6.权利要求1所述的酰基转移酶GPAT作为酰基转移酶和谷丙转氨酶的应用。
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