CN116286910A - 一种用于马来酸一锅生物合成l-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用 - Google Patents

一种用于马来酸一锅生物合成l-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116286910A
CN116286910A CN202211226431.0A CN202211226431A CN116286910A CN 116286910 A CN116286910 A CN 116286910A CN 202211226431 A CN202211226431 A CN 202211226431A CN 116286910 A CN116286910 A CN 116286910A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aamaia
aspb
recombinant
gene
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211226431.0A
Other languages
English (en)
Inventor
刘洪明
尹夏业
房尚萍
纵旋
王敖
刘梦娜
毕超
刘诗燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Normal University
Original Assignee
Anhui Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Normal University filed Critical Anhui Normal University
Priority to CN202211226431.0A priority Critical patent/CN116286910A/zh
Publication of CN116286910A publication Critical patent/CN116286910A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y502/00—Cis-trans-isomerases (5.2)
    • C12Y502/01—Cis-trans-Isomerases (5.2.1)
    • C12Y502/01001—Maleate isomerase (5.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于马来酸为底物一锅法生物合成L‑天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用，所述重组基因由优化的AaMaiA基因与TAT信号肽基因序列连接，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过优化特定的核糖体结合位点(RBS)序列，使AaMaiA基因表达量提高；为了进一步减少底物或酶跨膜转运限制并加速异构化反应，通过序列优化后的AaMaiA基因与Tat信号肽融合得到重组基因。本发明以重组基因编码的热稳定性酶AaMaiA和热稳定性酶AspB组成的双酶系统有效提高了马来酸一锅生物合成L‑天冬氨酸的产量。

Description

一种用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因、重组 酶及其应用
技术领域
本发明属于L-天冬氨酸合成，具体涉及一种用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用。
背景技术
L-天冬氨酸用于医药和食品添加剂，可以用于合成L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸和L-苏氨酸，它们属于20种蛋白源氨基酸，这五种氨基酸被称为L-天冬氨酸家族氨基酸(AFAAs)。由于丙酮酸对L-赖氨酸和L-异亮氨酸的碳骨架有贡献，因此它们仍然被认为是天冬氨酸家族。除了L-天冬氨酸类，天冬氨酸酯家族的成员是人体无法合成的必需氨基酸。氨基酸也可以用于化学加工，以减少对化石燃料的依赖，L-天门冬氨酸也可以使用通过L-天冬氨酸-α-脱羧酶和L-天门冬氨酸氧化酶产生β-丙氨酸和草酰乙酸。
目前L-天冬氨酸合成是通过微生物发酵和酶法。Sato等人在20世纪70年代通过固定化天冬氨酸酶(AspA)或含有天冬氨酸酶的大肠杆菌菌株合成了L-天冬氨酸酯。Takagi揭示了大肠杆菌的AspA的核苷酸序列，并发现该蛋白质有477个氨基酸残基。随后，从P.fluorescens、Erwinia sp.、Aeromonas media NFB-5、Campylobacter jejuni、芽孢杆菌YM55-1和海洋嗜冷噬细胞菌KUC-115中发现了耐热天冬氨酸酶。天冬氨酸酶是生产L-天冬氨酸酯和天冬氨酶底物的重要工业酶。
马来酸顺反异构酶(Maleate cis-trans isomerase，EC5.2.1.1，MaiA)是一种能够专一性的将马来酸(顺丁烯二酸)转化为富马酸(反丁烯二酸)的异构酶，该酶是天冬氨酸/谷氨酸消旋酶家族蛋白(Fisch,Fleites et al.2010)。MaiA被认为是从马来酸盐合成富马酸盐的有前景的酶，然而，其热不稳定性可能妨碍其广泛使用。目前，关于催化生成天冬氨酸，刘祥涛等在2017年提出了“一锅双酶”法制备L-天冬氨酸，双酶共表达的极不平衡和目前报道的马来酸顺反异构酶稳定性差、酶活低、表达量低等缺点，极大地限制了该方法在工业生产中的应用。
Tat信号肽包含一个带正电荷的N端区、一个疏水性H区和一个极性C端区。大肠杆菌Tat转位酶由TatA、TatB和TatC组成，由大肠杆菌tatABCD操纵子编码，尽管经过三十年的研究，Tat易位机制仍然不完全清楚。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因，该重组基因有效提高了L-天冬氨酸的生产效率。
本发明还提供用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组酶、重组载体、重组菌及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因，所述重组基因由优化的AaMaiA基因与TAT信号肽基因序列连接，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所用重组基因是根据AaMaiA原始氨基酸序列，得到密码子优化的碱基序列然后再将其与TAT序列后融合。
本发明所述的用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因编码的重组酶，所述重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因表达形成的蛋白，所述重组基因表达的蛋白可以定位到细胞间隙，减少了细胞膜的阻碍，加快反应速度，定位的过程可以切掉信号肽，形成的蛋白的氨基酸序列比AaMaiA基因编码的蛋白多四个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所述含有所述的用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因的表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据已知的AaMaiA和AspB的氨基酸序列，将氨基酸对应的优化后的碱基序列的基因片段连接到载体上获得pETDuet-1-AamaiA和pET-29a-aspB；根据构建的载体pET-29a-aspB和pETDuet-1-AamaiA，选择以pET-29a-aspB为模板，PCR扩增出AspB片段，插入到载体pETDuet-1-AamaiA，得到重组质粒pETDuet-1-AamaiA-aspB；
(2)根据AaMaiA的氨基酸序列设计RBS序列，根据RBS序列设计引物，以pETDuet-1-AamaiA-aspB质粒为模板，扩增获得优化后的pETDuet-1-RBS-AaMaiA-aspB全序列片段，回收片段经无缝克隆连接后进行转化提取质粒得到重组载体pETDuet-1-RBS-AaMaiA-aspB；
(3)以TorA的TAT信号肽序列为模板设计TAT引物，以重组载体pETDuet-1-RBS-AaMaiA-aspB为模板，扩增获得融合TAT序列的pETDuet-1-TAT-RBS-AaMaiA-aspB全序列片段，回收片段经无缝连接后进行转化提取质粒得到重组载体pETDuet-1-TAT-RBS4-AaMaiA-aspB。
本发明的重组载体构建完之后，测序验证序列是否正确连接，重组质粒完成后进行表达，表达的蛋白定位到细胞间隙，定位过程中会切掉信号肽，剩下的肽段就是多了四个氨基酸的新的活性蛋白。
其中，步骤(2)中RBS引物为SEQ ID NO.4-5，SEQ ID NO.6-7，SEQ ID NO.8-9，SEQID NO.10-11中任意一组所示。
其中，步骤(3)中TAT引物如SEQ ID NO.12-13所示。
其中，所述AspB基因的碱基序列如SEQ ID NO.14所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示。
本发明所述的重组菌，所述重组菌含所构建的重组载体。
本发明所述的用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因或者所构建的表达载体或者重组菌在一锅生物合成L-天冬氨酸中的应用。
进一步地，所述应用包括如下步骤：
(1)将含有所述的重组基因的重组载体pETDuet-1-TAT-RBS4-AaMaiA-aspB质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中得到阳性重组菌株VMB-RBS4-TAT；
(2)将重组菌株VMB-RBS4-TAT培养过夜，诱导蛋白表达；离心收集菌体；悬浮菌体与底物马来酸溶液混合反应合成L-天冬氨酸。
本发明实际提出了一种高效马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的方法，本发明根据AaMaiA原始氨基酸序列，得到密码子优化的碱基序列，然后再将其与TAT序列融合，同时将AaMaiA其上游的RBS序列优化(位于载体pETDuet-1上)，使AaMaiA基因表达量提高同时减少底物或酶跨膜转运限制并加速异构化反应，有效提升了改造后的AaMaiA和AspB双催化。
本发明构建了一个双酶系统，在50℃下由马来酸合成L-天冬氨酸，可以减少副产物的产生。在溶液中由马来酸转化的马来酸盐分别通过马来酸异构酶(MaiA)和热稳定天冬氨酸酶(AspB)催化的富马酸盐转化为L-天冬氨酸酯。由于MaiA是一种限速酶，因此比较了各种MaiA的酶活性，并克隆了产自酸乳杆菌的高效且耐热的马来酸顺反异构酶AaMaiA。在最适pH和温度下，AaMaiA的催化效率Kcat/Km为264.14min-1·mM-1。AaMaiA和AspB在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中共表达产生L-天冬氨酸。为了提高L-天冬氨酸的产生率，本发明首次优化了位于AaMaiA上游的RBS序列，并将Tat信号肽与优化后的AaMaiA融合。以马来酸为底物，融合后的AaMaiA和AspB双催化，60分钟内转化率为96％，未检测到中间体，可能的原因是高温抑制了细菌内源酶的活性，但功能酶仍保持活性，发酵细胞产生的L-天冬氨酸的量为243.6g/L(1.83M)，底物为2M。
内源性延胡索酶阻止了L-天冬氨酸的合成，以前的研究通过敲除大肠杆菌的两个编码延胡索酶基因来改善L-天冬氨酸的产生。本发明抑制内源酶的活性，同时通过高温热稳定性酶保持功能酶的活性。在50℃一锅法合成L-天冬氨酸时，1M马来酸在1h内的最高浓度为127.8g/L。本发明为工业生产L-天冬氨酸提供了一种有前景的绿色工艺。本发明提出了一种在不使用基因敲除的情况下生产L-天冬氨酸的有效方法，并为工业生产L-天冬氨酸提供了策略。本发明提出了一种通过双酶系统以马来酸为底物合成L-天冬氨酸的替代途径。马来酸比富马酸盐便宜，在反应溶液中容易转化为马来酸盐，以马来酸为底物合成L-天冬氨酸是一条经济的路线。本发明中新的双酶系统，来自A.acidoterrestris的AaMaiA和来自菌株YM55-1的AspB，在大肠杆菌BL21菌株中被工程化，以在50℃下产生L-天冬氨酸，同时不需要敲除/敲除延胡索酶基因，因为大肠杆菌的延胡索酸酶在高温下可能失去活性，而功能酶保持活性。同时本发明通过特定的核糖体结合位点(RBS)序列优化提高了双酶系统的L-天冬氨酸产量，为了进一步减少底物或酶跨膜转运限制并加速异构化反应，通过与Tat信号肽融合将优化后的AaMaiA引导至周质。在马来酸合成L-天冬氨酸的过程中，新型双酶系统(Tat信号肽融优化后的AaMaiA以及AspB)展示了L-天门冬氨酸生产的高效性。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过特定的RBS序列优化提高AaMaiA 在全细胞催化中的表达水平，进一步将Tat信号肽与优化后的AaMaiA融合，融合蛋白具有高活性，同时将AaMaiA定位到细胞间隙，减少底物或酶跨膜转运限制，加速了异构化反应速度。本发明通过在大肠杆菌中共表达耐热的重组AaMaiA和AspB，构建了一种高效的双酶系统，用于从马来酸生产L-天冬氨酸，1小时内将1M马来酸转化为0.96M的L-天冬氨酸(127.8g/L)，转化率为96％。在5L的发酵罐中在50℃一锅法合成L-天冬氨酸时，2M马来酸酐在1h内的浓度为127.8g/L，转化率为91.5％，该重组基因和方法为工业生产L-天冬氨酸提供了一种有前景的绿色工艺。
附图说明
图1为AaMaiA、AspB纯化后SDS-PAGE分析；A中泳道A-1，2，3：通过Ni-NTA纯化的AaMaiA；B中泳道B-8，9，10：通过Ni NTA纯化的AspB。
图2为蛋白浓度标准曲线。
图3为pH值和温度对AaMaiA酶活性的影响。(A)AaMaiA最适pH值的测定。(B)AaMaiA最佳温度的确定。(C)AaMaiA在45℃和50℃下的热稳定性。
图4为pH值和温度对AspB酶活性的影响。(A)AspB最适pH值的测定。(B)AspB最佳温度的确定。(C)AspB在45℃和50℃下的热稳定性。
图5为RBS对AaMaiA表达的影响SDS-PAGE分析。(A)原RBS序列的AaMai-AspB表达，通道1诱导前AaMaiA-AspB表达；通道2为诱导后AaMaiA AspB的表达。(B)四种不同RBS序列的AaMaiA-AspB的表达，泳道1、2为诱导前后AaMaiA-AspB-RBS1的表达；通道3、4为诱导前后AaMaiA-AspB-RBS2的表达；通道5、6为诱导前后AaMaiA-AspB-RBS3的表达；通道7、8为诱导前后AaMaiA-AspB-RBS4的表达。(C)原始RBS和四种不同RBS细胞的相对活性，含有原始RBS的细胞活性定义为100％。
图6为RBS序列优化后的pETDuet-1-AamaiA-aspB PCR产物胶回收。
图7为RBS序列优化后质粒提取验证。
图8为重组菌株VMB-RBS4(A)和VMB-RBS4-TAT(B)的转化率。
图9为使用VMB-RBS4-TAT菌株生产L-天冬氨酸。(A)在5升发酵罐中发酵VMB-RBS4-TAT菌株。当细胞密度(OD600)为60时加入0.5mM诱导剂IPTG。测量细胞生长(开环)和细胞活性(实心正方形)。(B)全细胞催化，反应混合物包含2.0M底物和重组细胞(OD600＝20)。通过HPLC测定L-天冬氨酸(实心三角形)、富马酸(实心正方形)和马来酸(开环)的浓度。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
生化试剂：基因的克隆表达酶类及试剂购于TaKaRa公司。
表达宿主大肠杆菌(Escherichia coli)株系BL21、pETDuet-1和pET-29a(+)为均为市售可得。
马来酸、富马酸HPLC检测条件：
检测HPLC设备是岛津LC-20A突出HPLC系统。使用Wondasil C18-WR柱(4.6mm*250mm*5μm)通过HPLC检测马来酸和富马酸的浓度，检测波长设置为210nm。流动相A(98％磷酸盐缓冲液)和B(2％甲醇)，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，进样量10μL。
天冬氨酸柱前衍生及HPLC检测条件：
柱前衍生后，可通过HPLC检测L-天冬氨酸。柱前衍生L-天冬酰胺：反应液上清液125μL，0.1M HCl 125μL、0.1M硼酸钠300μL、200μL衍生试剂OPA(0.0137g邻苯二甲醛、0.0588g乙酰半胱氨酸、2mL乙醇、8mL 0.1M硼酸钠)，将上述试剂混合并在25℃下放置15分钟，然后用0.22μm有机尼龙膜过滤后通过HPLC检测衍生产物。HPLC条件：安捷伦ZORBAXEclipse XDB-C18柱(4.6223mm*250mm*5μm)，334nm，50％A相(37mm乙酸钠，pH 4.5)，50％B相(甲醇)，0.6mL/min，柱温35℃。
实施例1
AaMaiA、AspB蛋白的纯化
1、基因获取：根据已经报道的来自Geobacillus stearothermophilus菌属的MaiA氨基酸序列在National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中进行BLAST比对，选择马来酸顺反异构酶：aspartate/glutamateracemase family protein(AaMaiA、Alicyclobacillus acidoterrestris)。根据已报道的来自Escherichia coli的AspA氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，选择耐高温的天冬氨酸酶:aspartase(AspB、Bacillus sp.YM55-1)。
2、载体构建：本实施例中选择pET-29a(+)和pETDuet-1两种表达载体，将从数据库中获知的上述氨基酸序列合成，将氨基酸对应的密码子优化后的碱基序列的基因片段连接到载体上的双酶切位点获得pETDuet-1-AamaiA(BamHI--NotI)，pET-29a-aspB(NdeI--XhoI)重组质粒用于后续研究，其中，密码子优化后的AamaiA序列如SEQ ID NO.16，密码子优化后的AspB序列如SEQ ID NO.14所示。
3、重组质粒转化到大肠杆菌BL21进行诱导表达，获得菌液，诱导过程为：分别在长有含上述各种重组质粒的重组菌的LB平板上挑取单一菌落至3mL含相应抗性的LB试管中，37℃恒温摇床，150rpm过夜培养；按1％接种量在相应抗性的无菌100mL的LB培养基的三角瓶中扩大培养，37℃，150rpm恒温摇床培养3-4h；移液枪吸取1mL培养液用紫外分光光度计测定此时细胞密度OD600，当OD600在0.6-0.8之间时，加入100μL 1mol/L IPTG溶液，20℃，150rpm，摇床诱导20h，获得菌液。获得的菌液进行蛋白胶分析蛋白诱导情况。AaMaiA经IPTG诱导后均有明显的27KDa左的蛋白条带，AspB诱导后有明显的51KDa左右的蛋白条带。
4、蛋白纯化及SDS-PAGE
(1)纯化前处理：1)将步骤3中诱导好的100mL菌液分装在无菌的50mL离心管中，4℃，6000rpm，离心5min，去掉上清：2)50mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液重悬洗涤一次，获得含MaiA、AspA目的蛋白的菌体；3)加入25mL Lew Buffer(50mL NaH2PO4，300mM NaCl，pH 7.5)重悬菌体，置于冰上，利用细胞破碎仪超声15min(超声1s，间隔2s，功率85％)得到粗酶液；4)MaiA、AspA粗酶液4℃，10,000rpm，离心10min，上清用0.22μm水系滤膜过滤后，Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白。
(2)纯化步骤：1)从4℃冰箱中取出20％酒精保存的Ni-NTA亲和层析柱，流掉保存液，加入2mL 去离子水洗去保存液，再加入3mL LEW Buffer进行柱平衡；2)将处理好的粗酶液倒入柱子中，收集流出液，重复上柱2次，放出液体，加入4mL Lew buffer洗去未结合蛋白；3)加入10mL 10mM洗涤缓冲液(50mL NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑)洗去少量结合的杂蛋白；4)加入3mL LEW Buffer冲去低浓度的洗涤缓冲液；5)加入10mL，150mM的洗脱缓冲液(50mL NaH2PO4，300mM NaCl，150mM咪唑)收集目的蛋白。
(2)纯化蛋白的SDS-PAGE分析：
1)吸取20μL纯化蛋白液，加入5μL5×蛋白上样缓冲液，混匀，100℃处理10min，10,000rpm离心10min；2)吸取5μL非预染蛋白Marker和25μL处理好的蛋白样品加入制备好的蛋白胶孔中，电压80V跑完浓缩胶，切换至120V待指示剂到达胶底，停止电泳；3)取出胶体，染色2小时；4)染色完成后再放置到脱色液中进行脱色，每半小时更换一次脱色液，直至可看到清晰的蛋白胶条带，分析诱导后是否有目的蛋白条带出现以及蛋白大小、纯化情况。
在构建重组载体时，均保留了载体上相应的His-tag，组氨酸标签能够和镍离子结合方便对酶进行纯化操作，因此对诱导后的AaMaiA、AspB菌液离心收集菌体，超声破碎获得粗酶液后进行Ni2+亲和层析柱纯化，先用洗涤缓冲液(50mL NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑)洗去少量结合的杂蛋白，再用(洗脱缓冲液：50mL NaH2PO4，300mM NaCl，150mM咪唑)洗脱，纯化蛋白收集液用SDS-PAGE法进行蛋白大小和单一程度分析，结果如图1所示。经纯化后，AaMaiA条带较为单一、大小约为27.53kDa(图1的A)；AspB胶图也有蛋白大小符合(51.64kDa)且较为单一的蛋白条带(图1的B)。
5、纯化酶浓度检测
改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。根据两个相同样品稀释液A595值的平均值，利用蛋白浓度标准曲线计算出稀释后的各个MaiA、AspA浓度，再由稀释倍数计算原液的蛋白浓度。根据改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒制作标准曲线的方法，得到50-300μg/mL浓度范围内的蛋白浓度标准曲线(图2)，拟合后得到一次方程：y＝0.003x+0.021，R2为0.995。纯化AaMaiA稀释4倍后测得A595平均值为0.666，根据蛋白浓度方程计算得到AaMaiA浓度约为860.667μg/mL；纯化AspB稀释4倍后测得A595平均值为0.758，根据蛋白浓度一次方程计算得到AspB浓度约为982.67μg/mL。
纯化的AaMaiA的生化特性：AaMaiA的理论分子量为27.5kDa(经纯化AaMaiA大小约为27.53kDa，与B.stearothermophilus MI-102的MaiA具有80.1％的氨基酸同一性。密码子优化后，含有C-His6标签序列的AaMaiA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，并通过镍亲和层析纯化，测定了涉及最适温度和pH的生化性质。使用50mM Tris-HCl和Na2HPO4-NaOH缓冲液在5.0至11.0的pH范围内进行pH对AaMaiA转化底物马来酸盐的影响。AaMaiA在Tris-HCl缓冲液中表现出相对较高的活性(详见实施例2)。
实施例2
AaMaiA和AspB理化性质测定
1、AaMaiA、AspB的米氏常数的测定
AaMaiA米氏常数测定：选择不同浓度(1、2、5、10、15、20、30、40、50mM)的马来酸，加入AaMaiA20μg，补充缓冲液50mM Tris-HCl(pH 8.0)至反应总体系为1mL，反应温度为45℃，反应时间为10min，反应结束后100℃处理失活酶。取上清测定产物富马酸的浓度，计算反应速率，并根据反应速率与底物浓度的关系，用Orign软件中的公式Michaelis-Mententequine进行非线性拟合，得到AaMaiA的Vmax、Km值，根据Km值计算出Kcat值。
AspB米氏常数测定：选择不同浓度(10、20、30、40、50、60、70mM)的马来酸，加入AspB 20μg，补充缓冲液50mM Tris-HCl(pH 8.0)至反应总体系为1mL，反应温度为45℃，反应时间为10min，反应结束后100℃处理失活酶。取上清测定产物天冬氨酸的浓度，计算反应速率，并根据反应速率与底物浓度的关系，用Orign软件中的公式Michaelis-Mententequine进行非线性拟合，得到AspB的Vmax、Km值，根据Km值计算出Kcat值。
米氏方程：v＝Vmax[s]/(Km+[s])；
Kcat计算公式：Kcat＝Vmax/[E]；
根据实验测定的不同的底物浓度所对应的产物生成速率平均值，利用公式米氏方程(Michaelis-Menten)进行非线性拟合得到AaMaiA和AspB的Km、Vmax值，拟合曲线。再根据Kcat＝Vmax/[E]计算得到催化常数Kcat值。AaMaiA的Km为20.02mM，Kcat为5288.42min-1，Kcat/Km值为264.14min-1·mM-1；AspB的Km为14.66mM，Kcat为8130.46min-1，Kcat/Km值为554.6min-1·mM-1。
2、AaMaiA、AspB的最适pH检测方法
AaMaiA酶促反应最适pH的测定：AaMaiA在pH 7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0以及反应温度为45℃的反应条件下反应15min后，热失活酶后取上清反应液测定反应液中富马酸的浓度，并计算相对酶活。反应体系：20μgAaMaiA，20μL底物(1M马来酸，氨水调pH至7.3)，940μLTris-HCl缓冲液(50mM)或者Na2HPO4-NaOH缓冲液(50mM)；AspB在pH 7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0以及反应温度为45℃的反应条件下反应15min后终止反应，取上清反应液测定天冬氨酸的浓度，并计算相对酶活。
如图3A所示，AaMaiA的最适pH是8.0(Tris-HCl)，在此pH下酶的剩余活力最高，当pH为6.0时酶的剩余活力为30.0％，pH为11.0时酶的剩余活力为39.02％。此外，AaMaiA在Na2HPO4-NaOH缓冲液中在pH 10.0时也具有高活性，这表明AaMaiA具有更好的耐碱性。
AspB在pH 8.5(Tris-HCl)反应条件下的剩余酶活力最高(图4A)，pH 7.0条件下，酶的剩余活力仅为9.54％，pH为10.5的条件下AspB剩余活力为11.2％。
3、AaMaiA、AspB的最适温度测定方法
按上述方法采用Tris-HCl缓冲液(50mM)，酶促反应最适温度的测定：AaMaiA在20℃，25℃，35℃，45℃，50℃，55℃，60℃，70℃，75℃不同温度的反应条件下，反应15min后终止反应，测定反应液中富马酸浓度，并计算相对酶活。AspB在25℃，35℃，45℃，50℃，55℃，60℃不同温度的反应条件下，反应15min后终止反应，测定反应液中天冬氨酸浓度，并计算相对酶活。
AaMaiA在45℃时表现出最佳活性，在50°℃时相对活性略有下降(图3B)。如图4B所示，AspB的最适温度为50℃，在65℃时仍有54.82％的剩余活力，AspB对高温条件的耐受性很好。综合以上结果后续在用双酶系统生产天冬氨酸时候，采用50℃作为生产温度。
4、AaMaiA、AspB的热稳定性测定方法
酶的热稳定性是酶性质的一项重要指标，本实验对AaMaiA、AspB两种酶进行热稳定检测。AaMaiA热稳定性测定：将纯化后的AaMaiA置于45℃、50℃水浴锅中孵育1，2，3，4，5，6，7，8小时后，测定不同孵育时间酶的相对活力。AspB热稳定性测定：将纯化后的AspB置于50℃水浴锅中孵育1，2，3，4，5，6，7，8小时后，测定不同孵育时间酶的相对活力。
AaMaiA在45℃和50℃下稳定，其酶活性在45℃下5小时内没有变化，在50℃孵育5小时内检测到大约80％的初始活性(图3C)。在55℃孵育条件下测定AspB的稳定性，结果表明AspB在55℃酶活力基本不变(图4C)，热稳定性非常好。
由于AaMaiA在45℃孵育条件下稳定性较好，当温度提高至50℃时，活性略有降低，同时AspB在50℃活性最高。综合考虑，以最适温度50℃以及最适pH值8，进行后续双酶全细胞催化的实验。
实施例3
AaMaiA-AspB双酶联载体构建与表达
根据构建的载体pET-29a-aspB和pETDuet-1-AamaiA，选择以pET-29a-aspB为模板，PCR扩增出AspB基因片段，插入到pETDuet-1-AamaiA的NdeI--XhoI酶切位点之间，得到重组质粒pETDuet-1-AamaiA-aspB。
1、AspB基因片段获取
根据AspB基因序列设计扩增AspB片段的正反向引物(AspBF/AspBR)，以pET-29a-aspB重组质粒为模板，在高保真PCR酶(2×ApexHF PCR Master Mix)作用下扩增目的序列，PCR反应体系见表1，PCR扩增的程序见表2。
表1
Figure BDA0003880096810000101
表2
Figure BDA0003880096810000102
其中step2-4为循环体系，共进行35个循环。
2、pETDuet-1-AamaiA线性载体获取
根据pETDuet-1序列设计扩增pETDuet-1-AaMaiA线性载体的正反向引物(pETDuet-1-AaMaiAF/pETDuet-1-AaMaiAR)，以pETDuet-1-AaMaiA重组质粒为模板，在高保真PCR酶(ApexHF HS DNA Polymerase FL)作用下扩增pETDuet-1-AaMaiA线性载体，PCR反应体系见表3，PCR扩增的程序见表4。
表3
Figure BDA0003880096810000111
表4
Figure BDA0003880096810000112
其中step2-4为循环体系，共进行35个循环。
3、PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳验证，AspB、pETDuet-1-AaMaiA片段切胶回收根据EasyPure Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒的方法进行胶回收。
表5为上述构建时所用引物。
表5
Figure BDA0003880096810000113
4、重组质粒构建与转化
重组质粒构建：采用无缝克隆方法把AspB、pETDuet-1-AaMaiA连接，构建重组质粒，连接体系(10μL)如下：2×Assembly Mix 5μL，AspB 2μL，pETDuet-1-AaMaiA 3μL，50℃反应15min，冰上放置数秒，备用。转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞培养重组菌；从重组菌平板挑取一个单菌落，培养过夜进行质粒提取，琼脂糖凝胶电泳法结果在UV照射下观察是否有相应大小的质粒条带，得到重组质粒pETDuet-1-AamaiA-aspB，对应的重组菌为AaMaiA-AspB。
5、重组菌AaMaiA-AspB诱导表达和SDS-PAGE分析蛋白表达情况
重组菌AaMaiA-AspB挑取单一菌落至3mL LB试管中，37℃摇床过夜培养；吸取1mL菌液加入一管含氨苄青霉素抗性的新的5mL的LB试管中，培养3-4h，OD600在0.6-0.8之间，记录OD值；以诱导前的菌体蛋白胶条带作为对照组，诱导后的菌体蛋白胶条带作为实验组；取1ml的诱导前的菌液测定OD600值，根据诱导后的OD600值计算出诱导后的菌体体积，保证做蛋白胶的菌体量相同；对照组和实验组10,000rpm离心3min收集菌体，加入25μL 1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液将菌体吹打均匀，将样品置于水浴100℃中处理10min，然后12,000rpm离心10min，保存在-20℃冰箱备用。经1mmol/L IPTG 20℃诱导16h后菌液处理后进行SDS-PAGE，结果如图5A所示，AspB有明显较宽的蛋白条带，但AaMaiA蛋白基本无表达，这可能是双酶共表达时存在竞争关系导致AaMaiA表达量很低，因此还需要对AaMaiA的表达进行优化，提高酶表达量。
实施例4
双酶重组质粒构建、RBS序列优化和Tat信号肽融合
1、AaMaiA和AspB双酶共表达时AaMaiA蛋白表达量很少，考虑通过对AaMaiA插入位点前的核糖体结合位点进行序列优化以提高蛋白表达能力。使用RBS Calculator 2.0web软件计算和预测具有不同初始翻译率的RBS序列。以AaMaiA基因为模板，选择4条优化后的RBS序列(AAGGAG)替换AaMaiA上游的原始RBS序列。以pETDuet-1-AamaiA-aspB质粒为模板，根据4条优化后RBS序列设计四对引物(RBS1F/RBS1R、RBS2F/RBS2R、RBS3F/RBS3R、RBS4F/RBS4R)(SEQ ID NO.4-11)，具体详见表6，在高保真PCR酶作用下扩增获得优化后的pETDuet-1-RBS-AamaiA-aspB全序列，PCR反应体系见表7，扩增体系详见表8。
表6 RBS序列设计四对引物
Figure BDA0003880096810000131
表7
Figure BDA0003880096810000132
ApexHF HS DNA Polymerase FL 购自TaKaRa
表8
Figure BDA0003880096810000133
其中step 2-4为循环体系，共进行35个循环。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析是否条带大小符合。将目的条带切胶回收，用无缝连接试剂盒连接成环状，反应体系如下：2×Assembly Mix 5μL pETDuet-1-RBS-AamaiA-aspB 3μL，H2O 2μL。连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞培养重组菌，从重组菌平板挑取一个单菌落，至含氨苄青霉素抗性的3mL LB试管中过夜培养，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳验证是否转化成功，得到重组载体pETDuet-1-RBS-AaMaiA-aspB以及优化的重组菌。对转化成功的菌液用20％的无菌甘油混匀，-80℃保存。按实施例3的方法进行优化后重组菌诱导表达和SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
本实施例中，采用对AaMaiA基因序列前的核糖体结合位点(RBS)进行序列优化，以提高AaMaiA的翻译率，提高蛋白表达水平。在RBS计算器优化后的序列中，选择翻译起始率相对较高的四条RBS序列，根据序列设计四对引物RBS1F/RBS1R、RBS2F/RBS2R、RBS3F/RBS3R、RBS4F/RBS4R，以重组质粒pETDuet-1-AamaiA-aspB为模板进行PCR扩增，即可得到RBS序列优化后的片段，PCR产物胶回收后的琼脂糖凝胶电泳如图6所示。回收片段经无缝连接后转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布在含Ampicillin的LB平板中，得到重组菌RBS1、RBS2、RBS3、RBS4。挑取RBS序列优化后的重组菌进行质粒提取验证，结果如图7所示，结果表明重组质粒成功转化到宿主菌中。四种重组菌修饰后的蛋白表达情况如图5B所示，其中重组菌RBS4的AaMaiA蛋白条带明显变宽，说明RBS修饰后提高了了AaMaiA的表达，并且没有影响AspB的正常表达。
本实施例为了提高AaMaiA在全细胞催化中的表达水平，通过优化重组质粒中AaMaiA的RBS序列。选择四个RBS序列来增强AaMaiA表达。在50℃下用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中的粗酶溶液评估活性(方法通过实施例1)，并使用SDS-PAGE评估由四种不同RBS序列引发的重组AaMaiA的表达水平。如图5B所示，AaMaiA用四个RBS序列表达良好，含有RBS4(VMB-RBS4)的细胞表现出最高的活性(图5C)。所以选取重组质粒pETDuet-1-RBS4-AaMaiA-aspB用于后续实验，对应的重组菌命名为VMB-RBS4，。
2、以TorA的TAT信号肽序列为模板设计TAT引物(SEQ ID NO.12-13)，详见表9，以重组载体pETDuet-1-RBS4-AaMaiA-aspB为模板，扩增获得融合TAT的pETDuet-1-TAT-RBS4-AaMaiA-aspB全序列片段，回收片段经无缝克隆连接后进行转化提取质粒得到重组载体pETDuet-1-TAT-RBS4-AaMaiA-aspB和重组均VMB-RBS4-TAT，其中重组载体以及重组菌的构建参照实施例4的步骤1。
表9 TAT引物
Figure BDA0003880096810000141
Figure BDA0003880096810000151
/>
本实施将RBS4优化后的AaMaiA通过细胞质膜以进一步提高L-天冬氨酸的生产效率。本发明也采用过冰核蛋白NINP(22kDa)的N结构域首先与RBS4优化后的AaMaiA融合，但融合蛋白无活性。然后将Tat信号肽与RBS4优化后的AaMaiA融合，融合蛋白具有高活性，具体实验数据详见实施例5。本发明中密码子优化的AaMaiA基因与TAT信号肽基因序列连接其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的氨基酸序列如如SEQ ID NO.2所示。同时重组菌中重组基因表达的蛋白可以定位到细胞间隙，减少了细胞膜的阻碍，加快反应速度，定位的过程可以切掉信号肽，形成的蛋白的氨基酸序列比AaMaiA基因编码的蛋白多四个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例5
全细胞催化马来酸
分别将实施例3构建的重组菌AaMaiA-AspB以及实施例4构建的重组菌VMB-RBS4、重组菌VMB-RBS4-TAT，从平板上挑取单一菌落至3mL含氨苄青霉素抗性的LB液体试管中，培养过夜；按体积比1％的接种量接种到100mL含氨苄青霉素抗性的LB培养基中，待OD600值达到0.6-0.8之间时，加入100μL IPTG，20℃、150rpm摇床培养20小时诱导蛋白表达；6000rpm，4℃，冷冻离心机离心5min，收集菌体；用PBS缓冲液悬浮菌体，将菌液与底物马来酸溶液混合，体系中马来酸1M，菌浓度为OD600值为20，在最适温度下(50℃、200rpm)，以及pH为8的条件下反应，每20分钟收集一次反应液。检测剩余马来酸、中间产物富马酸及产物天冬氨酸的浓度，计算产物生成率。
其中重组菌AaMaiA-AspB的L-天冬氨酸的收率仅为35.3％，主要由于AaMaiA在双酶系统中表达不佳。使用重组菌VMB-RBS4将1.0M马来酸酐转化为L-天冬氨酸，但100分钟内转化率为64.6％(图8A)，未检测到中间代谢物富马酸，表明AspB耗尽中间代谢物。虽然通过重组菌VMB-RBS4优化提高了转化率，但是反应时间增加到200min，转化率没有明显变化。重组细胞VMB-RBS4-TAT可以在1小时内将1M马来酸转化为0.96M L-天冬氨酸(127.8g/L)，底物和代谢物富马酸盐几乎耗尽(图8B)，所以本发明构建的重组菌VMB-RBS4-TAT不仅转化马来酸转化为L-天冬氨酸的速度快，而且效率高。
实施例6
重组基因在双酶系统放大生产L-天冬氨酸中的应用
由于重组菌VMB-RBS4-TAT的高转化率，使用5L发酵罐来扩大L-天冬氨酸的生产，在5升发酵罐中进行补料分批次发酵，将重组菌VMB-RBS4-TAT在37℃下培养10小时培养到对数期，然后按体积比10％接种到发酵罐中，保持pH值为7.0并用氨(25％)调节，并且将溶解氧控制在30％。当细胞浓度达到60(OD600)时，在温度降至30℃后加入IPTG(0.5M)在100rpm下继续反应，以细胞活性的一个单位是在50℃下每分钟可产生1mmol L-天冬氨酸的细胞数。如图9A所示，IPTG(0.5mM)诱导后，重组菌VMB-RBS4-TAT培养物的OD600值在24h时缓慢升高到80左右。细胞活性在36h时达到峰值431.9U/mL。用发酵罐检测L-天冬氨酸的产量，马来酸初始浓度为2M，6小时内L-天冬氨酸的产量可达1.83M(243.6g/L)，转化率为91.5％(图9B)，无积累六小时后反应中富马酸盐的含量(图9B)。因此，虽然转化率没有达到完全，但它具有较少的副产物以促进纯化过程。因此，双酶生物催化剂在工业应用中具有潜力。

Claims (10)

1.一种用于马来酸一锅法生物合成L-天冬氨酸的重组基因，其特征在于，所述重组基因由密码子优化的AaMaiA基因与TAT信号肽基因序列连接，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述的用于马来酸一锅法生物合成L-天冬氨酸的重组基因编码的重组酶，其特征在于，所述重组酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种权利要求1所述的用于马来酸一锅法生物合成L-天冬氨酸的重组基因表达形成的蛋白，其特征在于，所述重组基因表达的蛋白可以定位到细胞间隙，减少了细胞膜的阻碍，加快反应速度，定位的过程可以切掉信号肽，形成的蛋白的氨基酸序列比AaMaiA基因编码的蛋白多四个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种含有权利要求1所述的用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因的表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据已知的AaMaiA和AspB的氨基酸序列，将氨基酸对应的优化后的碱基序列的基因片段连接到载体上获得pETDuet-1-AamaiA和pET-29a-aspB；根据构建的载体pET-29a-aspB和pETDuet-1-AamaiA，选择以pET-29a-aspB为模板，PCR扩增出AspB片段，插入到载体pETDuet-1-AamaiA，得到重组质粒pETDuet-1-AamaiA-aspB；
(2)根据AaMaiA的氨基酸序列设计RBS序列，根据RBS序列设计引物，以pETDuet-1-AamaiA-aspB质粒为模板，扩增获得优化后的pETDuet-1-RBS-AaMaiA-aspB全序列片段，回收片段经无缝克隆连接后进行转化提取质粒得到重组载体pETDuet-1-RBS-AaMaiA-aspB；
(3)以TorA的TAT信号肽序列为模板设计TAT引物，以重组载体pETDuet-1-RBS-AaMaiA-aspB为模板，扩增获得融合TAT序列的pETDuet-1-TAT-RBS-AaMaiA-aspB全序列片段，回收片段经无缝连接后进行转化提取质粒得到重组载体pETDuet-1-TAT-RBS4-AaMaiA-aspB。
5.根据权利要求4所述的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中RBS引物优选为SEQ ID NO.4-5，SEQ ID NO.6-7，SEQ ID NO.8-9，SEQ ID NO.10-11中任意一组所示。
6.根据权利要求4所述的表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)中TAT引物如SEQID NO.12-13所示。
7.根据权利要求4所述的表达载体的构建方法，其特征在于，所述AspB基因的碱基序列如SEQ ID NO.14所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
8.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含权利要求4所构建的重组载体。
9.一种权利要求1所述的用于马来酸一锅生物合成L-天冬氨酸的重组基因或者权利要求4所构建的表达载体或者重组菌在一锅生物合成L-天冬氨酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
(1)将含有权利要求1所述的重组基因的重组载体pETDuet-1-TAT-RBS4-AaMaiA-aspB质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中得到阳性重组菌株VMB-RBS4-TAT；
(2)将重组菌株VMB-RBS4-TAT培养过夜，诱导蛋白表达；离心收集菌体；悬浮菌体与底物马来酸溶液混合反应合成L-天冬氨酸。
CN202211226431.0A 2022-10-09 2022-10-09 一种用于马来酸一锅生物合成l-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用 Pending CN116286910A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211226431.0A CN116286910A (zh) 2022-10-09 2022-10-09 一种用于马来酸一锅生物合成l-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211226431.0A CN116286910A (zh) 2022-10-09 2022-10-09 一种用于马来酸一锅生物合成l-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116286910A true CN116286910A (zh) 2023-06-23

Family

ID=86798373

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211226431.0A Pending CN116286910A (zh) 2022-10-09 2022-10-09 一种用于马来酸一锅生物合成l-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116286910A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111621482B (zh) 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法
CN109609475A (zh) 草铵膦脱氢酶突变体及其合成l-草铵膦的应用
CN108913724B (zh) 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用
CN112831488B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸高产菌株
CN111808829B (zh) 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用
CN111057686B (zh) 一种醇脱氢酶突变体及应用
CN114806913B (zh) 具有线粒体定位还原tca途径的高产琥珀酸酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN114686547B (zh) 一种以双醋瑞因为供体的酶促合成乙酰辅酶a的方法
CN112779233B (zh) 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用
CN106119272B (zh) 一种高效联产l-苯甘氨酸及葡萄糖酸的策略
CN112481320B (zh) 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法
CN116286910A (zh) 一种用于马来酸一锅生物合成l-天冬氨酸的重组基因、重组酶及其应用
Ben et al. Expression and Characterization of a New L-amino Acid Oxidase AAO Producing α-ketoglutaric Acid from L-glutamic Acid
CN113913317A (zh) 一种重组酿酒酵母及提高重组酿酒酵母表面展示葡萄糖脱氢酶的酶活性的方法
CN111172143B (zh) D-木糖酸脱水酶及其应用
US20230107679A1 (en) Method For Preparing (S)-1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline-1 Carboxylic Acid and Derivatives Thereof
CN112941093B (zh) 一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法
CN114107270B (zh) 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体
CN114196642B (zh) 谷氨酸脱氢酶变体及其在制备l-氨基酸中的应用
CN116064494B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因及其应用
AU2020103435A4 (en) Method for preparing (s)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid and derivatives thereof
CN114015634B (zh) 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN112725298B (zh) 一种机器学习基因挖掘方法及氨基转位用草铵膦脱氢酶突变体
CN110452899B (zh) 一种葡萄糖异构酶、突变体及其在制备d-果糖中的应用
CN117210431A (zh) 一种热稳定性转氨酶突变体及其工程菌与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination