CN111621482B

CN111621482B - 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法

Info

Publication number: CN111621482B
Application number: CN202010614951.3A
Authority: CN
Inventors: 薛亚平; 程峰; 李举谋; 李清华; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111621482A; US20220307061A1; WO2022001038A1

Abstract

本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法。所述草铵膦脱氢酶突变体由来源于荧光假单胞菌的草铵膦脱氢酶第164位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸所得，第205位精氨酸突变为赖氨酸，第332位苏氨酸突变为丙氨酸获得的所得，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述基因工程菌为将所述草铵膦脱氢酶突变体的基因导入宿主细胞。宿主细胞中还可以将葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶的编码基因也导入，进行同步定向进化，使双基因过表达。本发明一锅法多酶同步定向进化方法可以筛选到活性大大提高的基因工程菌。本发明L‑PPT制备方法与转氨酶等催化工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高，转化率可达100％，且立体选择性高。

Description

一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，特别是涉及一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法。

背景技术

草铵膦(phosphinothricin，也叫glufosinate，简称PPT)的化学名称为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的制备方法主要有三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：

1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物e.e.值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。

2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如Cao等人(CaoC-H,Cheng F,Xue Y-P,Zheng Y-G(2020)Efficient synthesis of L-phosphinothricinusing a novel aminoacylase mined from Stenotrophomonas maltophilia.Enzyme andMicrobial Technology 135doi:10.1016/j.enzmictec.2019.109493)采用一种来源于Stenotrophomonas maltophilia的新型的氨基酰化酶手性拆分N-乙酰-PPT，得到L-草铵膦。用全细胞进行催化，在4小时内转化率>49％，获得了光学纯的L-PPT(>99.9％e.e.)。

3)以α-酮酸-2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与草铵膦脱氢酶。Bartsch(Bartsch K(2005)Processfor the preparation of l-phosphinothrcine by enzymatic transamination withaspartate.US Patent no.US6936444B1)等利用PPO为底物，L-天冬氨酸为氨基供体，利用从土壤微生物中筛选分离出来的对PPO和L-天冬氨酸有特异性酶活的转氨酶进行催化，当底物浓度为552mM时，在非常高的温度(80℃)下反应4小时，转化率仍达到52％，时空产率为4.5g L-PPT/g of biocatalyst/h。但利用转氨酶制备L-草铵膦有两大缺陷，其一是这是一个可逆反应，原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率无法达到100％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要加入至少2倍以上的L-天冬氨酸作为氨基供体，过量的天冬氨酸给L-PPT的分离带来了很大的麻烦。

在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得，且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线。

氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.X，AADH)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的氨基酸脱氢酶，其反应需要核苷类辅酶的参与(NAD(P)⁺)，被广泛的应用于天然与非天然α-氨基酸的合成。根据其底物特异性，可分为谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶等。如果其表现出对草铵膦前体具有一定的活力，就可称之为“草铵膦脱氢酶(PPTDH)”。

葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47，GDH)是生物催化的重要辅助酶，用于氧化还原催化反应中辅酶NAD(P)H的再生循环。

发明内容

本发明提供了一种多酶一锅同步定向进化法，可以同步定向进化草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶以及它们之间的基因元件。本发明提供了草铵膦脱氢酶突变体，高表达葡萄糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶突变体以及包含这两种酶的基因的工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用，该基因工程菌中的两种酶经过了一锅法多酶同步进化，使两种酶在合成L-PPT过程中协同效率更高，催化制备的L-草铵膦时底物转化率高，时空产率高、总转换数高。且进一步缩短了反应进程。

一种草铵膦脱氢酶突变体，由来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的草铵膦脱氢酶第164位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第205位精氨酸突变为赖氨酸，第332位苏氨酸突变为丙氨酸获得的所得，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明又提供了编码所述草铵膦脱氢酶突变体的基因。

本发明又提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含所述的基因。

所述的基因工程菌，目的基因还包括葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶的编码基因。

所述的基因工程菌，使用双基因表达载体，所述草铵膦脱氢酶突变体的基因克隆到其中一个多克隆位点区域，葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶的编码基因克隆到第二个多克隆位点区域。

所述葡萄糖脱氢酶的编码基因序列GenBank登录号为KM817194.1，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因起始密码子与质粒上对应核糖体结合位点之间的连接碱基长度为8～10bp。其中，效果最好的情况是该连接碱基长度为8bp时。

所述甲酸脱氢酶突变体的编码基因序列如SEQ ID No.3所示。如SEQ ID No.3所示基因序列编码的甲酸脱氢酶由来源于布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的甲酸脱氢酶第224位组氨酸突变成谷氨酰胺所得。

本发明还提供了所述草铵膦脱氢酶突变体、所述基因或所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

一种L-草铵膦的制备方法，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，葡萄糖或甲酸铵为辅助底物，在无机氨基供体、和辅酶循环系统存在的条件下，利用催化剂催化底物反应获得L-草铵膦；

所述辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统或甲酸脱氢酶循环系统；所述催化剂为所述的基因工程菌、该基因工程菌的粗酶液或固定化的所述基因工程菌，

当所述基因工程菌中含有所述葡萄糖脱氢酶的编码基因时，辅助底物为葡萄糖，辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统；当所述基因工程菌中含有所述甲酸脱氢酶的编码基因时，辅助底物为甲酸铵，辅酶循环系统为甲酸脱氢酶循环系统。无机氨基供体在葡萄糖脱氢酶循环系统中是硫酸铵，在甲酸脱氢酶循环系统中是甲酸铵。

本发明还提供了一种一锅法多酶同步定向进化方法，包括：

(1)将辅酶循环系统所用再生酶的基因也克隆到双基因表达载体中与草铵膦脱氢酶进行共表达；(2)将偶联共表达后的双酶利用易错PCR方法构建易错PCR库并克隆到双基因表达载体中；(3)将克隆有双基因的表达载体导入宿主细胞中进行培养，得到的各单菌落分别进行L-草铵膦制备实验并筛选制备效率提高的菌株；(4)确定筛选到的菌株中草铵膦脱氢酶基因的突变位点，对该基因进行定点饱和突变，筛选获得活性最高的突变体。

本申请中，克隆了来源于Pseudomonas fluorescens、NCBI登录号为WP_150701510.1的草铵膦脱氢酶基因，来源于Exiguobacterium sibiricum、GenBank编号为ACB59697.1的葡萄糖脱氢酶，来源于Lactobacillus buchneri、NCBI登录号为WP_013726924.1的甲酸脱氢酶，草铵膦脱氢酶基因导入pETDuet-1质粒上的MCS1(多克隆位点1)，葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶分别导入带有草铵膦脱氢酶载体pETDuet-1质粒上的MCS2(多克隆位点2)上，然后将pETDuet-1质粒转化进在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现该基因的异源表达，草铵膦脱氢酶能够催化PPO不对称胺化还原为L-PPT，同时辅酶NADPH变成NADP⁺。葡萄糖脱氢酶能够催化葡萄糖生成葡萄糖酸或甲酸脱氢酶能催化甲酸铵生成铵根离子，二氧化碳和水，同时使NADP⁺变成NADPH，从而在胞内形成辅酶循环(图4)。虽然该草铵膦脱氢酶经过突变体A164G_R205K_T332A之后对PPO的活力有了明显提高，但是和葡萄糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶一锅法偶联制备L-PPT时，两种酶整体的酶活还有待提高，所以需要将草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶两种酶同时一锅法同步定向进化催化生成L-PPT。这种方法很新颖，而且将具有较强的工业应用价值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过发展一锅法多酶同步定向进化技术，通过将获得的PPTDH-A164G_R205K_T332A和EsGDH偶联共表达，同时优化了核糖体结合位点和EsGDH编码基因起始密码子之间的碱基长度，使EsGDH进一步过表达，或者突变LbFDH，获得突变体LbFDH-H224Q，从而使一锅法生物合成L-PPT的转化率和时空产率进一步提高。通过一锅法多酶同步定向进化后，总转换数较之前单酶突变体PPTDH-A164G_R205K_T332A提高了5.8倍，最终L-PPT时空产率高达7110g·L^–1·d^–1，且产物L-PPT的e.e.值大于99％。

(2)本发明提供的L-PPT制备方法原料转化率高、收率高、产物易于分离提纯。

(3)本发明方提供的L-PPT制备方法与化学法及其他生物法(转氨酶等)工艺相比，工艺相对简单，原料转化率高，转化率可达100％，产物光学纯度高(e.e.>99％)。

附图说明

图1为PPO样品的高效液相色谱(HPLC)光谱分析图。

图2为D,L-PPT样品的高效液相色谱(HPLC)光谱分析图。

图3为实施例1获得的PPTDH和EsGDH偶联表达载体的质粒图谱。

图4为实施例1利用PPTDH与EsGDH双酶偶联催化PPO不对称胺化还原制备L-PPT的反应示意图。

图5为实施例4中PPTDH和EsGDH双酶偶联SDS-PAGE图。其中泳道1：标准蛋白分子量；泳道2：EsGDH过表达之前的重组大肠杆菌细胞；泳道3：EsGDH过表达之后的重组大肠杆菌细胞。

图6为草铵膦脱氢酶的野生型和突变体的SDS-PAGE图。泳道M：标准蛋白分子量；泳道1：草铵膦脱氢酶的野生型粗酶液上清液；泳道2：草铵膦脱氢酶的野生型纯化后酶液；泳道3：含有野生型草铵膦脱氢酶的大肠杆菌；泳道4：草铵膦脱氢酶的突变体A164G_R205K_T332A粗酶液上清液；泳道5：草铵膦脱氢酶的突变体A164G_R205K_T332A纯化后酶液；泳道6：含有草铵膦脱氢酶突变体A164G_R205K_T332A的大肠杆菌。

图7为用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-PPTDH-EsGDH不对称还原胺化合成L-PPT反应进程图。反应体系中外加了0.5mM NADP⁺辅酶，反应条件：40℃，pH＝7.5。LE：低表达；HE：过表达。

具体实施方式

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；质粒等购自上海生工；DNA marker、Fast Pfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序以及基因合成工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。

下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(PPO)，D,L-PPT、L-PPT标准品购自Sigma-Aldrich公司；NADPH购于邦泰生物工程(深圳)有限公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

下列实施例中高效液相色谱的检测方法如下：

高效液相色谱(HPLC)检测底物PPO浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：将50mM磷酸二氢胺溶于800mL超纯水中，加入10mL四丁基氢氧化铵(10％)用水稀释并定容至1000mL，用磷酸调pH到3.8，与乙腈以体积比88∶12混合。检测波长为232nm，流速：1.0mL/min。柱温：40℃，2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸(PPO)出峰时间为：10.3分钟(图1)。

产物的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：

(1)色谱条件：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相：50mM乙酸铵溶液∶甲醇＝10∶1。荧光检测波长：λ_ex＝340nm，λ_em＝455nm。流速：1mL/min。柱温：30℃，L-PPT出峰时间为11min，D-PPT出峰时间为13.4min(图2)。

(2)衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12g N-乙酰-L-半胱氨酸，用10mL乙醇助溶，再加入40mL 0.1moL/L硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。

(3)衍生化反应与HPLC测定：以超纯水补足至1mL，即反应液稀释10倍，稀释后的样品先经过衍生化处理，取200μL稀释后的反应液加400μL衍生化试剂30℃衍生化5min，再加400μL超纯水补足至1mL，12000转/分钟离心1分钟，取上清，过0.22μM微滤膜，作为液相样品，HPLC检测PPO、L-PPT、D-PPT及e.e.值。

实施例1

草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶或者甲酸脱氢酶偶联表达载体和工程菌的构建。

构建表达载体：以下所述的草铵膦脱氢酶，葡萄糖脱氢酶和甲酸脱氢酶基因合成工作均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。将来源于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的草铵膦脱氢酶基因(NCBI登录号为WP_150701510.1)通过PCR无缝克隆到pETDuet-1载体的第一个多克隆位点的SacI和NotI之间，将来源于Exiguobacteriumsibiricum的葡萄糖脱氢酶基因(NCBI登录号：KM817194.1)或者来源于Lactobacillusbuchneri的(NCBI登录号为WP_013726924.1)的甲酸脱氢酶，通过PCR无缝克隆到pETDuet-1载体的第二个多克隆位点的Bg1II和PacI之间，获得带有草铵膦脱氢酶的表达载体pETDuet-PPTDH-EsGDH(图3)或者pETDuet-PPTDH-LbFDH。PCR程序的操作如下：95℃预变性3分钟；95℃变性15s，53-58℃退火15s，72℃延伸1.5分钟，共25个循环；然后以72℃延伸10分钟。

感受态细胞的制备方法为：从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5mL的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；从试管中取200μL菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD₆₀₀至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，取100μL重悬细胞分装至灭菌的1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。

构建工程菌文库：将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内分别加入5μL的带有草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的表达载体pETDuet-1-PPTDH-EsGDH，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50μg/ml氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTDH-EsGDH或者pETDuet-PPTDH-LbFDH工程菌。

实施例2

草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶/甲酸脱氢酶双酶偶联基因文库的构建和筛选。

一)高通量筛选方法的建立

配制50mL工作液(衍生化试剂)：邻苯二甲醛0.013g，N-乙酰-L-半胱氨酸0.032g，用pH＝9.8硼酸缓冲液溶解定容到50mL，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)，作为高通量工作液，也叫做衍生化试剂。吸取50μL样品反应液加入50μL工作液震荡反应30s，再加入100μL ddH2O，在λ_ex＝340nm，λ_em＝455nm条件下测定荧光值。

二)一锅法多酶同步定向进化

对比例：，使用多酶分步定向进化方法，对PPTDH和EsGDH分别进行定向进化，在筛选2万个克隆后，未获得活力明显提高的PPTDH(PfGluDH)和EsGDH。利用PPTDH(PfGluDH)和EsGDH的野生型冻干大肠杆菌细胞作为生物催化剂，在12小时后(未添加外源NADP⁺)，100mMPPO到L-PPT的转化率为37.3％。当PPO浓度增加到300和500mM时，转化率分别降低到11.5％和7.7％(不添加外源NADP⁺)，e.e.值达到99％以上。因此，需要提高用于L-PPT合成的多酶催化反应的效率。

本发明采用的策略是将实例1获取的获得含有表达重组质粒pETDuet-1-PPTDH-EsGDH为出发质粒，对草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶以及之间的基因表达调控元件同时进行易错PCR，筛选活力提高菌株。易错PCR存在两轮PCR过程，第一轮PCR过程中，对目的基因进行易错PCR，选择添加的Mn²⁺的浓度为0.15mM；。第二轮PCR过程中，采用的大引物方法将第一轮易错PCR产物克隆到表达载体pETDuet-1上，获得带有易错目的基因的重组质粒(Miyazaki K,Takenouchi M.2002.Creating Random Mutagenesis Libraries UsingMegaprimer PCR of Whole Plasmid.BioTechniques 33:1033-1038.)。将经过DpnI消化过的第二轮PCR产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达和筛选。

配置反应液：终浓度300mM底物PPO(2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)，750mM的硫酸铵，360mM的葡萄糖，pH＝7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。

待平板中长出菌落后，从平板中挑出单个菌落，并接种到96孔板中，每个孔中含有1.0mL LB培养基(含135μM氨苄青霉素)。在37℃下培养8小时后，取出200μL菌液转移到另一个含有800μL LB培养基(含135μM氨苄青霉素和0.1mM IPTG)的96孔板中，并在22℃，200rpm条件下培养16小时。将培养好的菌液以4000rpm离心10分钟，倒掉上清液，收集菌体于孔底。接下来进行催化反应验证，96深孔板每孔加入500μL的反应液，同时用移液枪反复吹打，将96孔板收集的菌体重悬，然后将96深孔板放入40℃、200rpm的摇床上反应1h后，离心取上清，进行高通量筛选。

初筛：吸取50μL样品反应上清液加入50μL工作液震荡反应30s，再加入100μLddH₂O，在λ_ex＝340nm，λ_em＝455nm条件下测定荧光值。筛选荧光值高于pETDuet-1-PPTDH-EsGDH野生型反应液的菌株，找到相对应的保藏菌种，划线培养，然后吸取高浓度菌液和30％甘油以1∶1的比例加入甘油管中，最后放到-80℃冰箱中保藏。

通过高通量筛选方法初筛以及液相复筛了大约8000多突变体，最后筛选到四个活力提高突变株，使L-PPT的产率至少提高了三倍以上。其中三个突变体是来自草铵膦脱氢酶的A164G，R205K和T332A突变体，第四个突变体是来自第二个克隆位点RBS到葡萄糖脱氢酶之间碱基的缺失造成活力提升，分析原因是因为碱基的缺失造成葡萄糖脱氢酶的表达量提升，提高了辅酶循环效率。

实施例3

多酶偶联反应体系中草铵膦脱氢酶定点饱和突变。

为了进一步筛选潜在活力提升菌株，先将实施例2中得到的草铵膦脱氢酶的A164和R205两个有益突变位点进行定点饱和突变，做进一步的筛选，PCR引物设计如表1所示，PCR体系(50μL)为：2*Phanta Max缓冲液25μL，dNTPs 1μL，突变上下引物各1μL，模板(出发菌株)1μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，补ddH2O至50μL。PCR条件为：95℃预变性3min：95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸7min20s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经过DNA琼脂糖凝胶电泳验证，并通过DpnI消化模板后，将PCR产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化后的产物涂布于含50μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，对获得的突变体进行优势突变体的筛选，将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司进行测序确认，并保存。

表1草铵膦脱氢酶定点饱和突变引物设计

引物名称	引物序列(5’-3’)
		PfGluDH-205-F	GGCAGTTTGATTNNKCCAGAAGCTACC
PfGluDH-205-R	GGTAGCTTCTGGMNNAATCAAACTGCC
		PfGluDH-164-F	GTCGATGTGCCANNKGGAGATATTGGCG
PfGluDH-164-R	ACGCCAATATCTCCMNNTGGCACATCGA

高通量筛选方法和测酶活反应体系同实施例2。

表2草铵膦脱氢酶定点饱和突变后多酶催化反应的转化率

N.D.：检测不到

通过表2可以看出，在未添加外源NADP⁺条件下，草铵膦脱氢酶突变体A164G，可以把300mM PPO的转化率从11.5％提高到了63.6％。但是，通过A164点饱和诱变和筛选，并没有筛选到其他活力提高的菌株。在未添加外源NADP⁺条件下，草铵膦脱氢酶R205K的突变体，使300mM PPO的转化率从从11.5％提高到21.3％，但是，通过R205点饱和诱变和筛选，也没有筛选到其他活力提高的菌株。然后将A164G和R205K两个突变点进行组合突变，发现活力进一步提高，300mM PPO的转化率达到68.1％。

除了利用易错PCR技术，还通过半理性设计，对草铵膦脱氢酶进行同源建模和分子对接，选择一些其他潜在活力提高的突变位点进行定点饱和突变。同源建模：通过在PDB数据库中找到与草铵膦脱氢酶同源性最高的蛋白晶体结构作为模板，利用Modeller 9.22进行同源建模，并利用autock vina进行分子对接，选择合适的突变位点，设计突变引物，进行定点饱和突变，并通过高通量方法进行筛选。

经过多次定点饱和突变和筛选后，最终筛选到活力提高突变体PPTDH-T332A，三酶突变体A164G_R205K_T332A活力较野生型进一步的提高，300mM PPO的转化率达到71.2％。因此，最终选择草铵膦突变体为A164G_R205K_T332A。

实施例4

多酶偶联反应体系中葡萄糖脱氢酶的过表达。

在双酶偶联表达载体pETDuet-1上，EsGDH蛋白表达量不高，造成辅酶循环效率较差，实施例2中筛选到活力提高菌株是因为第二个克隆位点RBS到葡萄糖脱氢酶之间碱基的缺失，因此推断GDH表达量与葡萄糖脱氢酶到RBS序列之间的碱基长度有关。因此对葡萄糖脱氢酶到RBS序列之间的碱基长度做了进一步的优化。引物设计如表3所示，实验结果如表4所示。

表3多酶催化反应中碱基数量优化引物设计

表4多酶催化反应中碱基数量优化后转化率汇总表

编号	连接序列(5’-3’)	连接长度(bp)	转化率(％)
				1	ATATACATCCAGAT	14	11.5
2	ATATACATCCAGA	13	35.1
				3	ATATACATCC	10	78.8
4	ATATACAT	8	99.1
				5	ATATAC	6	26.0
6	ATAT	4	4.3

从表4可知，当葡萄糖脱氢酶到RBS序列之间的碱基长度为8bp时，EsGDH基因表达有了较大提高，SDS-PAGE分析见附图5。双酶偶联催化效率有了较大提高，300mM PPO转化率达到了99.1％。

实施例5

PPO胺化总转换数[total turnover numbers(TTN)]测量和比较。

通过测定PPO胺化总转换数来具体反应草铵膦脱氢酶及突变体和PPTDH-EsGDH及突变体双酶偶联催化效率。当只有草铵膦脱氢酶及突变体时，反应体系为：100mM PPO，0.5mM NADPH，400mM NH₄ ⁺，0.5g/L干细胞。当有草铵膦脱氢酶和葡萄糖脱氢酶时，反应体系中还需要额外添加120mM的葡萄糖。反应5分钟后，取反应液样品进行处理，然后用HPLC测定L-PPT的浓度。

单酶或者多酶时TTN(μmol L-PPT/μmol催化剂)的计算公式为：

TTN＝(L-PPT(mol/L))/(PPTDH(g/L)·49060(mol/g))

表5三种不同的酶的野生型和突变体A164G_R205K_T332A对应的TTN值

从表5中数据可知，当只有PPTDH时，没有NAPDH再生系统(EsGDH)，TTN保持在较低水平，PPTDH_WT的TTN和变体PPTDH_A164G_R205K_T332A的TTN值均低于200。PPTDH_A164G_R205K_T332A和低表达量的EsGDH偶联催化反应时，TTN增加到5846，当PPTDH_A164G_R205K_T332和高表达的EsGDH偶联催化反应时TTN达到最大值33950，这表明PPTDH_A164G_R205K_T332A和高表达的EsGDH偶联催化反应制备L-PPT达到了最佳偶联效率。

实施例6

多酶偶联反应体系中甲酸脱氢酶的定点饱和突变。

首先，通过基因挖掘获得来源于Lactobacillus buchneri的NADP⁺依赖型甲酸脱氢酶，但原始酶活较低，因此利用同源建模与分子对接半理性设计来选择合适的突变位点，通过定点饱和突变来筛选活力提高突变株，确定的突变位点为S148、Q222、R223、H224、M334、T338、K380和T383。

建立了NADPH高通量筛选方法，由于在340nm处NADPH的摩尔消光系数(ε)较大，始终恒为6220L mol^-1cm^-1，故OD₃₄₀和NADPH浓度成正比关系，因此可以利用测定反应液中OD₃₄₀的值来反应酶的活力大小。测定酶活反应体系为1ml，包含100mM甲酸铵，1mM NADP⁺，100mM磷酸缓冲液(pH＝7)，以及适量的菌体，反应温度为30℃。

表6多酶偶联反应体系中甲酸脱氢酶的定点饱和突变引物设计表

引物名称	引物序列
		FDH-S148-F	GAAGTGACCTATAGCAATNNKGTTAGTGTTGC
FDH-S148-R	CTGCTTCTGCAACACTAACMNNATTGCTATAG
		FDH-Q222-F	CGTTAAACTGGTGTATAATNNKCGCCATCAGC
FDH-Q222-R	CCGGCAGCTGATGGCGMNNATTATACACC
		FDH-R223-F	CTGGTGTATAATCAGNNKCATCAGCTGCCG
FDH-R223-R	CTTCATCCGGCAGCTGATGMNNCTGATTATAC
		FDH-H224-F	GGTGTATAATCAGCGCNNKCAGCTGCCGG
FDH-H224-R	CAACTTCATCCGGCAGCTGMNNGCGCTGATTA
		FDH-M334-F	GAAGCAATGACCCCGCATNNKAGTGGCACC
FDH-M334-R	CTCAGGGTGGTGCCACTMNNATGCGGGGTC
		FDH-T338-F	CCCGCATATGAGTGGCACCNNKCTGAGTGCC
FDH-T338-R	GCGTGCCTGGGCACTCAGMNNGGTGCCACTC
		FDH-K380-F	GGCCGGTACCGGTGCCNNKAGTTATACCG
FDH-K380-R	CCTTTTTTCACGGTATAACTMNNGGCACCGG
		FDH-T383-F	CGGTGCCAAAAGTTATNNKGTGAAAAAAGG
FDH-T383-R	GGTTTCTTCGCCTTTTTTCACMNNATAACTTT

通过高通量筛选方法进行筛选，结果显示大部分突变体是无义突变，，仅有H224Q为有益突变位点，甲酸脱氢酶的相对酶活提高了23％。

实施例7

草铵膦脱氢酶的表达和纯化。

1、含草铵膦脱氢酶基因-葡萄糖脱氢酶基因的湿菌体：分别将实施例1获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-PPTGDH-EsGDH、接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，22℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，即获得含草铵膦脱氢酶-葡萄糖脱氢酶重组菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-PPTGDH-EsGDH的湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

粗酶液通过4℃、12000转/分钟离心20min，取上清。使用Ni亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用5倍柱体积的结合缓冲液(含0.3MNaCl的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)平衡Ni柱，至基线稳定；②样品上样，流速1mL/min，上样量在25-40mg/mL蛋白，使目标蛋白吸附于Ni柱上；③用6倍柱体积的缓冲液A(含0.3M NaCl、30mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)冲洗杂蛋白，流速1mL/min，至基线稳定；④用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 8.0、50mM磷酸钠缓冲液)洗脱，流速1mL/min，收集目的蛋白。将目的蛋白置于pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液中透析过夜，获得纯化酶，电泳图见图6所示。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.4。

LB平板：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，18g/L琼脂，溶剂为蒸馏水，pH 7.4。

实施例8

草铵膦脱氢酶野生型及其突变体动力学参数测定

反应体系:底物PPO浓度2-30mM，50mM的硫酸铵，1～15mM的NADPH和一定量的纯化酶，反应介质为100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，反应温度为40℃。将获得的初始速度数据拟合到下面的方程式：

其中[A]和[B]是NADPH和PPO的浓度，Km^A和Km^B是对NADPH和PPO的表观底物亲和力。Vmax是底物达到饱和时酶的最大反应速率，Ks^A表示草铵膦脱氢酶和NADPH之间的解离常数。

表7草铵膦脱氢酶野生型及其突变体(A164G_R205K_T332A)动力学参数

从表7数据可知，草铵膦脱氢酶突变体A164G_R205K_T332A的催化常数(k_cat)有了很大的提高，从7.47s^–1(WT)增加到951.85s^–1(A164G_R205K_T332A)，草铵膦脱氢酶突变体A164G_R205K_T332A的底物亲和力比WT略有提高(K_m值：5.35mM对6.12mM)。高k_cat和适度的底物亲和力导致对PPO有非常高的催化效率(k_cat/K_m)，从1.22s^-1mM^-1(WT)显着提高到177.92s^-1mM^-1(A164G_R205K_T332A)，草铵膦脱氢酶突变体A164G_R205K_T332A催化效率相对于野生型提高了145.83倍。

实施例9

用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTDH_A164G_R205K_T332A-EsGDH/LbFDH_H224Q不对称还原胺化合成L-PPT。

反应体系100mM-1M PPO，120mM-1.2M葡萄糖，150mM-1M硫酸铵，0.5mM NADP⁺，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTDH_A164G_R205K_T332A-EsGDH(高表达量)(0.5g/L干细胞)。反应条件：恒温水浴40℃，转速500rpm。在整个反应过程中，通过流加NH₃·H₂O控制反应液pH值保持在7.5。在固定的时间间隔取样品(100μl)，加入5μL 6M浓盐酸终止反应，然后处理样品，通过使用HPLC测量L-PPT浓度来确定转化率，反应进程曲线如图7所示。

当PPO底物浓度为100mM时，使用0.5g·L^–1催化剂可在5分钟内将底物完全转化为L-PPT(转化率>99％和e.e.>99％)。在相同的反应条件下，使用初始菌体(草铵膦脱氢酶WT和表达低的EsGDH)，转化率只能达到≈26％(3h后为25.68mM)。当PPO底物浓度增加到500mM(89.04g·L^–1)和1M(178.08g·L^–1)时，使用0.5g·L^–1催化剂可在在20分钟和40分钟后将底物完全转化，e.e.>99％。后者的时空产率(STY)达到7110g·L^-1·d^-1，比初始菌体(37g·L^-1·d^-1)高173倍。与酰胺酶和转氨酶催化的反应相比，草铵膦脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶仍然显示出最高的转化率和最短的反应时间，如表8所示。

表8和其它文献报道过通过改造酶制备L-PPT的对比

注：[a]纯化后的酰胺酶作催化剂；[b]固定化转氨酶做催化剂；[c]干细胞做催化剂；[d]外消旋-4-[羟基(甲基)磷酰基]-2-(2-苯基乙酰胺基)丁酸。

反应体系：400mM的PPO，800mM的甲酸铵，重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-1-PPTDH_A164G_R205K_T332A-LbFDH_H224Q 25g·L^–1的催化剂，反应条件：恒温水浴45℃，转速600rpm下进行反应。通过高效液相方法检测反应过程中产物L-PPT的浓度和e.e.值的变化情况。

结果显示产物浓度随时间的推移而逐渐升高，3.5h内反应完成，底物转化率大于99％，产物e.e.值始终保持在99.5％以上。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Glu Ser Val Glu Ser Phe Leu Ala Arg Leu Lys Lys Arg Asp

1 5 10 15

Pro Asp Gln Pro Glu Phe His Gln Ala Val Glu Glu Val Leu Arg Ser

20 25 30

Leu Trp Pro Phe Leu Glu Ala Asn Pro His Tyr Leu Thr Ser Gly Ile

35 40 45

Leu Glu Arg Ile Cys Glu Pro Glu Arg Ala Val Val Phe Arg Val Ser

50 55 60

Trp Val Asp Asp His Gly Lys Val Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Ile

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His

85 90 95

Pro Ser Val Asn Leu Gly Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Thr

100 105 110

Phe Lys Asn Ser Leu Thr Ser Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly

115 120 125

Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe

130 135 140

Cys Gln Ala Phe Met Ser Glu Leu Tyr Arg His Ile Gly Ala Asp Val

145 150 155 160

Asp Val Pro Gly Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Gln Phe Thr Ser Val Leu

180 185 190

Thr Gly Lys Gly Pro Ser Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Lys Pro Glu Ala

195 200 205

Thr Gly Phe Gly Cys Val Tyr Phe Ala Glu Glu Met Leu Lys Arg Arg

210 215 220

Gly Glu Thr Val Glu Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asn

225 230 235 240

Val Ala Gln Tyr Ala Ala Arg Lys Val Met Asp Leu Gly Gly Lys Val

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Asp Ser Glu Gly Thr Leu Tyr Cys Glu Ser Gly Leu

260 265 270

Thr Glu Ala Gln Trp Gln Ala Val Leu Glu Leu Lys Asn Val Gln Arg

275 280 285

Gly Arg Ile Ser Glu Leu Ala Ala Arg Phe Gly Leu Glu Phe Arg Ala

290 295 300

Gly Gln His Pro Trp Gly Leu Ser Cys Asp Ile Ala Leu Pro Cys Ala

305 310 315 320

Thr Gln Asn Glu Leu Asp Ala Glu Ala Ala Arg Ala Leu Leu Arg Asn

325 330 335

Gly Cys Ile Cys Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr Leu Glu

340 345 350

Ala Val Asp Leu Phe Ile Glu Ala Gly Ile Leu Phe Ala Pro Gly Lys

355 360 365

Ala Ser Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln

370 375 380

Asn Ala Met Arg Leu Leu Trp Thr Gly Gly Glu Val Asp Ser Lys Leu

385 390 395 400

His Ala Ile Met Gln Ser Ile His His Ala Cys Val His Tyr Gly Glu

405 410 415

Glu Asn Gly Gln Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe

420 425 430

Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val

435 440 445

<210> 2

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgattgaga gcgtcgagtc tttcttggcc cgccttaaaa agcgcgaccc tgaccagccg 60

gagtttcatc aggcagttga ggaagtctta cgctcattat ggccgttcct ggaagctaac 120

ccccattatt tgactagcgg cattcttgaa cgtatttgcg agccggaacg tgccgtcgtt 180

ttccgtgtga gctgggtaga cgaccatgga aaggtgcaag tgaaccgtgg cttccgcatc 240

cagatgaact cagctatcgg cccatataaa ggcgggttgc gttttcatcc aagcgttaat 300

ttgggtgtct taaaattctt agcgttcgag caaacattta aaaacagctt aacatcgtta 360

cccatgggtg gaggaaaggg tggtagtgac ttcgacccaa aggggaagag cgatgcggaa 420

gtcatgcgtt tctgccaggc attcatgtca gagctttacc gtcacatcgg ggcggacgtc 480

gatgtgccag ggggagatat tggcgtgggt gcgcgcgaga ttggattttt attcggtcag 540

tataagcgtc tgtctaacca gttcacctcg gtacttacgg gtaagggacc gtcatatggc 600

ggcagtttga ttaagccaga agctaccgga tttggttgtg tttattttgc cgaagaaatg 660

cttaagcgcc gtggagaaac cgtggaaggc aagcgtgttg ccattagtgg ctctgggaac 720

gtagcgcagt atgcggcccg caaggtgatg gatcttggcg gaaaagtcat ttctttatca 780

gacagcgagg gcacattata ctgcgaatcc ggtttgactg aagctcaatg gcaagcagtg 840

ttggaactga agaatgtaca acgtggccgt atttcagaat tagccgcacg ctttggtctt 900

gaatttcgag cgggccaaca cccctggggt ttatcttgcg atatcgccct tccttgcgcg 960

acgcagaacg agcttgacgc cgaagctgcg cgtgctttac ttcgtaatgg atgcatctgc 1020

gtcgctgaag gggcgaacat gccgacaacc cttgaggcgg ttgatctgtt tatcgaagcg 1080

ggtattctgt tcgctccagg taaagcctcg aatgctggcg gggttgcagt gtcgggttta 1140

gagatgtcgc aaaacgcaat gcgtttattg tggacagggg gcgaggttga ctcaaaattg 1200

catgctatca tgcagagcat ccatcatgct tgcgtacatt acggtgaaga gaacggtcag 1260

gtaaactacg taaagggggc gaatattgct ggattcgtga aggttgctga tgcaatgctg 1320

gcacaggggg tcgtctaa 1338

<210> 3

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaccaaag ttctggccgt gctgtatccg gatccggtgg atggttttcc gccgaaatat 60

gttcgtgatg atattccgaa aatcacccat tatccggatg gcagtaccgt tccgaccccg 120

gaaggcattg attttaaacc gggtgaactg ctgggtagcg ttagtggcgg tctgggcctg 180

aaaaaatatc tggaaagtaa aggtgtggaa tttgttgtta ccagtgataa agaaggcccg 240

gatagtgtgt ttgaaaaaga actgccgacc gccgatgtgg ttattagtca gccgttttgg 300

ccggcctatc tgaccgcaga tctgattgat aaagcaaaaa agctgaaact ggcaattacc 360

gccggtattg gcagcgatca tgtggatctg aatgccgcca atgaacataa tattaccgtt 420

gcagaagtga cctatagcaa tagtgttagt gttgcagaag cagaagtgat gcagctgctg 480

gccctggtgc gtaattttat tccggcacat gatattgtga aagccggtgg ctggaatatt 540

gcagatgcag ttagccgtgc ctatgatctg gaaggtatga ccgttggtgt gattggtgca 600

ggccgcattg gtcgtgccgt tctggaacgt ctgaaaccgt ttggcgttaa actggtgtat 660

aatcagcgcc aacagctgcc ggatgaagtt gaaaatgaac tgggcctgac ctattttccg 720

gatgttcatg aaatggtgaa agttgtggat gccgttgttc tggcagcacc gctgcatgca 780

cagacctatc atctgtttaa tgatgaagtt ctggccacca tgaaacgtgg cgcctatatt 840

gtgaataata gccgcggcga agaagttgat cgcgatgcaa ttgttcgcgc actgaatagc 900

ggtcagattg gcggttatag tggcgatgtt tggtatccgc agccggcacc gaaagatcat 960

ccgtggcgta ccatgccgaa tgaagcaatg accccgcata tgagtggcac caccctgagt 1020

gcccaggcac gctatgccgc aggtgcacgt gaaattctgg aagattttct ggaagataaa 1080

ccgattcgtc cggaatatct gattgcccag ggtggtagtc tggccggtac cggtgccaaa 1140

agttataccg tgaaaaaagg cgaagaaacc ccgggtagcg gcgaagcaga aaaataa 1197

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcagtttga ttnnkccaga agctacc 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtagcttct ggmnnaatca aactgcc 27

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgatgtgc cannkggaga tattggcg 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgccaatat ctccmnntgg cacatcga 28

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tataattcat atacatccat gggttataat tc 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattataac ccatggatgt atatgaatta ta 32

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tataattcat atacatatgg gttataattc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaattataac ccatatgtat atgaattata 30

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tataattcat atacatgggt tataattc 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaattataac ccatgtatat gaattata 28

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tataattcat atatgggtta taattc 26

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaattataac ccatatatga attata 26

<210> 16

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atatacatcc agat 14

<210> 17

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atatacatcc aga 13

<210> 18

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atatacatcc 10

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaagtgacct atagcaatnn kgttagtgtt gc 32

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgcttctgc aacactaacm nnattgctat ag 32

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgttaaactg gtgtataatn nkcgccatca gc 32

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccggcagctg atggcgmnna ttatacacc 29

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctggtgtata atcagnnkca tcagctgccg 30

<210> 24

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cttcatccgg cagctgatgm nnctgattat ac 32

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggtgtataat cagcgcnnkc agctgccgg 29

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

caacttcatc cggcagctgm nngcgctgat ta 32

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gaagcaatga ccccgcatnn kagtggcacc 30

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ctcagggtgg tgccactmnn atgcggggtc 30

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cccgcatatg agtggcaccn nkctgagtgc c 31

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gcgtgcctgg gcactcagmn nggtgccact c 31

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggccggtacc ggtgccnnka gttataccg 29

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccttttttca cggtataact mnnggcaccg g 31

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cggtgccaaa agttatnnkg tgaaaaaagg 30

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

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Claims

1.一种草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于，由来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的草铵膦脱氢酶第164位氨基酸由丙氨酸突变为甘氨酸，第205位精氨酸突变为赖氨酸，第332位苏氨酸突变为丙氨酸所得，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的基因。

3.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因包含如权利要求2所述的基因。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，目的基因还包括葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶突变体的编码基因，

使用双基因表达载体，所述草铵膦脱氢酶突变体的基因克隆到其中一个多克隆位点区域，葡萄糖脱氢酶的编码基因或甲酸脱氢酶突变体的编码基因克隆到第二个多克隆位点区域，

所述甲酸脱氢酶突变体的编码基因序列如SEQ ID No.3所示，甲酸脱氢酶突变体是将第224的组氨酸突变为谷氨酰胺。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因序列GenBank登录号为KM817194.1，所述葡萄糖脱氢酶的编码基因起始密码子与质粒上对应核糖体结合位点之间的连接碱基长度为8～10bp。

6.如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体、如权利要求2所述基因或如权利要求3～5任一所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

7.一种L-草铵膦的制备方法，其特征在于，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，葡萄糖或甲酸铵为辅助底物，在无机氨基供体和辅酶循环系统存在的条件下，利用催化剂催化底物反应获得L-草铵膦；

所述辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统或甲酸脱氢酶循环系统；所述催化剂为如权利要求4～5任一所述的基因工程菌、该基因工程菌的粗酶液或固定化的所述基因工程菌，

当所述基因工程菌中含有所述葡萄糖脱氢酶的编码基因时，辅助底物为葡萄糖，辅酶循环系统为葡萄糖脱氢酶循环系统；当所述基因工程菌中含有所述甲酸脱氢酶的编码基因时，辅助底物为甲酸铵，辅酶循环系统为甲酸脱氢酶循环系统。