CN111321193A - 一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备l-草铵膦的方法 - Google Patents

一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备l-草铵膦的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L‑草铵膦的方法，以D,L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L‑草铵膦中的D‑草铵膦催化为2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D‑氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L‑草铵膦的转氨酶，所述D‑氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D‑氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：(1)M213S；(2)M213S‑N54V‑F58E；(3)M213S‑N54V‑F58E‑D207A；(4)M213S‑N54V‑F58E‑D207A‑S60T。本发明D‑氨基酸氧化酶突变体具有更好的催化效率，以外消旋D,L‑草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO产率也大幅提升。

Description

一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法。
背景技术
草铵膦，又名草丁膦，英文名为Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产。草铵膦属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。
众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。
草铵膦由两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。
目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。
化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。
生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：
(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。
(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。
(3)以D,L-草铵膦为原料，经D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦得到L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)，再经转氨酶催化得到L-草铵膦。
早在研究草铵膦在土壤微生物的代谢途径中就已经发现L-草铵膦在酶的作用下会被分解成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。因此，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，经酶法可逆催化生成L-草铵膦不失为一个好方法。
D-氨基酸氧化酶是一类特异选择性的将D-氨基酸及其衍生物催化生成α-酮酸的酶，反应由其本身自带的辅酶FAD催化完成，因其表现处的优良催化效率和选择性，D-氨基酸氧化酶被广泛用于生物拆分L-氨基酸和α酮酸的生产。例如，D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸。
转氨酶是磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶，属于转移酶类，催化氨基与酮基互换的过程。它广泛存在于自然界中并在细胞的氮代谢过程中发挥重要的氨基转移作用。转氨酶有很多优点，比如高对映体选择性和区域选择性，高反应速率和稳定性等。转氨作用是一个可逆反应，2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸可在转氨酶的催化作用下通过逆反应生成L-草铵膦。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种全新的拆分消旋混合物制备L-草铵膦的方法。同时提供一种D-氨基酸氧化酶突变体，具有较高的催化D-草铵膦反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的活性。
一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法，以D,L-草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的转氨酶，
所述D-氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：
(1)M213S；
(2)M213S-N54V-F58E；
(3)M213S-N54V-F58E-D207A；
(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。
具体原理为：采用一锅法的多酶催化体系，以外消旋D,L-草铵膦为底物，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，同时，加入的过氧化氢酶用于去除副产物过氧化氢，因为过氧化氢积累会对催化剂有毒害作用，而L-草铵膦不参与反应而完全保留；然后，2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸被转氨酶催化还原为L-草铵膦，从而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化，得到光学纯的L-草铵膦。转氨酶在催化过程中需要磷酸吡哆醛为辅酶，以氨基供体为辅底物。
本申请中转氨酶可以采用本领域常规的序列。优选的，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
在用于催化D-草铵膦反应生成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸时，可以使用表达后的粗酶液或表达纯化后的酶液，也可以直接使用能够表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌进行催化反应。相同的，转氨酶也可以直接加表达后的粗酶液、表达纯化后的纯酶液或直接加能够表达该转氨酶的基因工程菌。
更优选的，所述D-氨基酸氧化酶突变体通过在反应体系中加入表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌获得；
所述转氨酶通过在反应体系中加入表达所述转氨酶的基因工程菌获得，同时还加有辅酶磷酸吡哆醛。
更优选的，所用基因工程菌的宿主细胞均为E.coli BL21(DE3)。
更优选的，反应体系中D,L-草铵膦的终浓度为100～400mM，表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌添加量为20～40g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，表达所述转氨酶的基因工程菌添加量为30～50g/L，所述辅酶磷酸吡哆醛的浓度为1mM。反应的温度为30℃，时间为10h，反应的pH值为8。
反应完成后，终产物L-草铵膦分离提取的方法为预处理-离子交换法-结晶。
本发明又提供了一种D-氨基酸氧化酶突变体，由野生菌Rhodotorulataiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：
(1)M213S；
(2)M213S-N54V-F58E；
(3)M213S-N54V-F58E-D207A；
(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。
本发明还提供了编码所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3～6中的一种。
本发明还提供了一种包含所述基因的基因工程菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明D-氨基酸氧化酶突变体具有更好的催化效率，以外消旋D,L-草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO产率也大幅提升。
(2)本发明以外消旋D,L-草铵膦为底物，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸又可以被转氨酶继续催化还原为L-草铵膦，进而实现D,L-草铵膦的原位去消旋化。而传统的氧化方法则需要将D-草铵膦和L-草铵膦都转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，造成了原料的浪费。
(3)本发明能够直接以D,L-草铵膦为底物进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤。
(4)本方法克服了化学法合成L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的缺陷，是一种绿色，环保，低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。
附图说明
图1为本发明方法采用的多酶体系拆分法生产L-草铵膦的反应式。
具体实施方式
上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-24a(+)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京GenStar有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)为实验室合成；D,L-草铵膦购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
D-草铵膦(简称D-PPT)的结构式如式(1)所示；L-草铵膦(简称L-PPT)的结构式如式(2)所示；2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称PPO)的结构式如式(3)所示。
Figure BDA0002416510340000041
(3)2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸
D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦产生2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸以及氨气和过氧化氢的反应式如图1所示。
本发明通过高效液相色谱(HPLC)检测反应的进行，并对产物进行分析。HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/30℃；流速/1mL/min；检测波长/205nm；流动相：50mM(NH4)2HPO4，加入1％的10％的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调pH至3.8，加入12％的乙腈。
通过手性HPLC分析方法检查草铵膦的两个构型含量，手性HPLC分析方法为：色谱柱/Pntulips QS-C18；流动相/50mM乙酸铵溶液：甲醇＝9∶1；检测波长/338nm；流速/1mL/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12gN-乙酰-L-半胱氨酸，用10ml乙醇助溶，在加入40ml 0.1M硼酸缓冲液(pH)9.8。振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过3天)。衍生化反应与测定：取200μL样品加入400μL衍生化试剂，混匀至30℃保温5min，加入400μL超纯水混合，进样10μL进行分析。
实施例1
D-氨基酸氧化酶突变体文库的构建及筛选。
一、基因工程菌的构建
将来源于红酵母(Rhodotorula taiwanensis)的D-氨基酸氧化酶(Gen Bank号：POY70719.1)的基因序列经密码子优化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-24a(+)上。重组质粒经测序验证无误后转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，用于后续重组D-氨基酸氧化酶的表达。密码子优化后的D-氨基酸氧化酶基因序列如SEQ ID No.2所示。
二、D-氨基酸氧化酶突变体库的构建
第一轮，以上述全基因合成所得密码子优化后的D-氨基酸氧化酶基因为模板，分别以表1中用于突变M213R和M213S的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌株为带有M213S突变的突变体，将该优势突变体的质粒命名为D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S。
第二轮以突变体pRtDAAO-M213S为模板，分别以表1中用于突变N54G、N54L、N54V和N54A的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌为带有M213S和N54V双突变的突变体，将该优势突变体的质粒命名为D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S-N54V。
第三轮以突变体pRtDAAO-M213R-N54V为模板，分别以表1中用于突变F58E、F58A、F58R、F58S的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌株为带有M213S、N54V和F58E三突变的突变体，将该优势突变体的质粒命名为D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58E。
第四轮以突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58E为模板，分别以表1中用于突变D207A、D207T、D207E的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌株为带有M213S、N54V、F58E和D207A四突变，将该优势突变体的质粒命名为D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213R-N54V-F58E-D207A，
第五轮以突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58E-D207A为模板，分别以表1中用于突变S60A、S60E和S60T的引物，经定点突变PCR，转化，涂平板，通过筛选获得优势菌株为带有M213S、N54V、F58E、D207A和S60T五突变，将该优势突变体的质粒命名为D-氨基酸氧化酶突变体pRtDAAO-M213S-N54V-F58E-D207A-S60T，后期实验中的优势单突变体均由同样方法构建。
其中，PCR反应体系如下：
2×Phanta Max缓冲液：25μL；
dNTPs：1μL；
上游引物：1μL；
下游引物：1μL；
模板：1μL；
Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：0.5μL；
ddH2O：20.5μL。
PCR反应条件：预变性95℃5min；变性95℃15s，退火56℃30s，延伸72℃6min，共循环30次；后延伸72℃10min；4℃保存。
PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为1300bp左右。将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
表1
Figure BDA0002416510340000061
Figure BDA0002416510340000071
实施例2
表达转氨酶的基因工程菌的构建
一、目的基因转氨酶的扩增
从假单胞杆菌基因组中克隆转氨酶基因，根据相应基因组DNA序列(GenBank登录号为WP_076423369.1)设计相应的PCR上游引物和下游引物。
上游引物：ATGAACACCAACAACGCTC
下游引物：TTAAGCCTGTTTAGCTTC
PCR扩增体系：
2×Phanta Max缓冲液：25μL；
dNTPs：1μL；
上游引物：1μL；
下游引物：1μL；
模板：1μL；
Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：0.5μL；
ddH2O：20.5μL。
PCR反应条件：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃6min，共循环30次；后延伸72℃10min；4℃保存。
PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为1300bp左右。将PCR产物进行Dpn I酶消化模板，用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
二、表达载体和工程菌的构建
表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4 DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)，构建表达载体pET-28a(+)-gabT，将构建的表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50mg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选含有表达重组质粒pET-28a(+)-gabT的重组大肠杆菌BL21(DE)/pET-28a(+)-gabT。
实施例3
微生物的培养
一、菌体的培养
将含有D-氨基酸氧化酶基因和转氨酶基因的工程菌分别经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的10mL LB液体培养基中，37℃震荡培养10h。按2％的接种量转接至50mL同样含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃下震荡培养12h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
二、粗酶液的制备
将培养结束后收集的菌体用pH 8的磷酸盐缓冲液(50mM)洗涤两次，之后，将菌体加入pH＝8的PBS(50mM)重悬细胞，在超声破碎30次，破碎条件：功率为400W，破碎2s，间歇5s。将此细胞破碎液于4℃8000rpm离心10min，去除沉淀，得到的上清即为粗酶液。
三、酶的纯化
将粗酶液与经上样缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含500mM NaCl、20mM咪唑)平衡过的Ni亲和层析树脂结合后，再用冲洗缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含50mM咪唑、500mM NaCl)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液，其中包含200mM咪唑、500mM NaCl)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液)透析24h，取截留液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为2.7mg/mL，将酶液稀释至终浓度为0.5mg/mL分装，冻存于-80℃，即获得重组纯酶。
各D-氨基酸氧化酶突变体也按上述方法制备。
实施例4
D-氨基酸氧化酶活力的测定。
酶活定义：1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(30℃)下，在1分钟内转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中的1微摩尔的有关基团的酶量。
D-氨基酸氧化酶的酶活测定：取溶于50mM的磷酸盐缓冲液的底物溶液(50mM D,L-草铵膦)400μl，置于金属浴振荡器中，30℃保温10min，加入50μl纯酶，0.25μl的过氧化氢酶(Sigma-Aldrich，货号60634)，开始计时，30℃反应10min，加入5μl 6M的盐酸，取出震荡混匀，反应终止，12000rpm离心3min，取上清，用去离子水稀释2倍，进行HPLC检测。根据HPLC测得的2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸浓度，计算酶活。结果如表2所示。
表2酶活测定结果
编号 突变类型 酶活(U/L)
对照1 未突变 0.23
E1 M213S 0.78
E2 M213S-N54V-F58E 3.21
E3 M213S-N54V-F58E-D207A 3.89
E4 M213S-N54V-F58E-D207A-S60T 4.63
转氨酶的酶活测定：取溶于50mM的磷酸盐缓冲液的底物溶液(50mM 2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)400μl，置于金属浴振荡器中，30℃保温10min，加入50μl纯酶，1mM的PLP，80mM L-丙氨酸，开始计时，30℃反应10min，加入5μl 6M的盐酸，取出震荡混匀，反应终止，12000rpm离心3min，取上清，用去离子水稀释2倍，进行HPLC检测。根据HPLC测得的L-草铵膦浓度，计算酶活。
实施例4
菌体的大规模制备。
因生产L-草铵膦的过程中，需要大量的生物催化剂，因此需要菌体大规模制备。所用培养基为LB培养基。
将保藏有重组D-氨基酸氧化酶工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的50mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至1L同样含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃下震荡培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。
实施例5
选取D-氨基酸氧化酶突变体(E1)及转氨酶制备L-草铵膦。
按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E1)和转氨酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为100mM，D-氨基酸氧化酶(E1)菌体浓度为20g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，转氨酶菌体浓度为30g/L，400mM的L-丙氨酸和1mM PLP。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与L-PPT的增加量和ee值。
反应10小时结束，D-PPT剩余41.36mM，转化率7.33％(最大理论转化率为50％)，L-PPT的生成浓度为58.77mM(ee值达99％)。
实施例6
选取D-氨基酸氧化酶突变体(E2)及转氨酶制备L-草铵膦。
按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E2)和转氨酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为100mM，D-氨基酸氧化酶(E2)菌体浓度为20g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，转氨酶菌体浓度为30g/L，400mM的L-丙氨酸和1mM PLP。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与L-PPT的增加量和ee值。
反应10小时结束，D-PPT剩余30.26mM，转化率29％(其中，最大理论转化率为50％)，L-PPT的生成浓度为78.53mM(ee值达99％)，产率为28.5％，PPO的生成浓度小于0.05mM。
实施例7
选取D-氨基酸氧化酶突变体(E3)及转氨酶制备L-草铵膦。
按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E3)和转氨酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为100mM，D-氨基酸氧化酶(E3)菌体浓度为20g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，转氨酶菌体浓度为30g/L，400mM的L-丙氨酸和1mM PLP。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与L-PPT的增加量和ee值。
反应10小时结束，D-PPT剩余21.86mM，转化率37.33％(其中，最大理论转化率为50％)，L-PPT的生成浓度为85.47mM(产物ee值达99％)，产率为73％，PPO的残余浓度小于0.05mM。
实施例8
选取D-氨基酸氧化酶突变体(E4)及转氨酶制备L-草铵膦。
按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E4)和转氨酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为100mM，D-氨基酸氧化酶(E4)菌体浓度为20g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，转氨酶菌体浓度为30g/L，400mM的L-丙氨酸和1mM PLP。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与L-PPT的增加量和ee值。
反应10小时结束，D-PPT剩余0mM，即实现D-PPT的完全转化，L-PPT的生成浓度为97.79mM，即产率为94％，ee值达99％。PPO的残余浓度小于0.05mM。
实施例9
选取D-氨基酸氧化酶突变体(E4)及转氨酶制备高浓度L-草铵膦。
按照实施例4的方法培养能够表达D-氨基酸氧化酶(E4)和转氨酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取D,L-草铵膦到100mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为400mM，D-氨基酸氧化酶(E4)菌体浓度为40g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，转氨酶菌体浓度为50g/L，600mM的L-丙氨酸和1mM PLP。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与L-PPT的增加量和ee值。
反应10小时结束，D-PPT剩余0mM，即实现D-PPT的完全转化，L-PPT的生成浓度为386.79mM，产率为95％，产物ee值达99％。PPO的残余浓度小于0.05mM(0.9‰)。
实施例9
将实施例8中的D-氨基酸氧化酶突变体(E4)及转氨酶制备的L-草铵膦反应液调pH至5-6，以0.5BV/h的流速上001x7钠型或铵型强酸型阳离子交换树脂，丙氨酸会吸附于树脂上，上样完成后，用超纯水冲洗，L-草铵膦及其它杂质会随超纯水下来，收集L-草铵膦流出液，在50-65℃减压蒸馏，随后将反应液pH调至2-3.5，在0-45℃条件下缓慢搅拌结晶，搅拌时间为1-24h。处理后的L-草铵膦反应液调pH至1.2-2.5，然后将滤液上强酸型阳离子交换树脂以除去少量的有机物、D-型底物和大量无机离子，随后进行水洗和洗脱，收集L-草铵膦流出液；在50-65℃温度下对L-草铵膦流出液进行减压浓缩，将流出液浓缩至恒重，加入无水甲醇，在50-65℃温度条件下使L-草铵膦溶解，随后冰浴下缓慢搅拌使其结晶，搅拌12-24小时后，将其置于冷冻真空干燥机机内冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体，终产物L-草铵膦纯度达到98％以上，收率达到98％以上。
对比例1
按照实施例4的方法培养能够表达未突变D-氨基酸氧化酶和转氨酶的基因工程菌，离心收集菌体细胞。
定量称取D,L-草铵膦到50mM pH＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得D,L-草铵膦的终浓度为100mM，未突变D-氨基酸氧化酶菌体浓度为20g/L，过氧化氢酶浓度为0.1g/L，转氨酶菌体浓度为30g/L，400mM的L-丙氨酸和1mM PLP。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测PPO的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测D-PPT的减少量与ee值。
反应10小时结束，D-PPT剩余46.77mM，转化率2.16％(其中，最大理论转化率为50％)，L-PTT总浓度仅为53.58mM(ee值99％)，产率仅为51.67％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 372
<212> PRT
<213> 红酵母(Rhodotorula taiwanensis)
<400> 1
Met Ala Pro Ser Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Val Gly
1 5 10 15
Leu Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Gln Lys Gly Tyr Ser Val His Val
20 25 30
Val Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Thr Val Ala Gln Thr Phe Ala Ser
35 40 45
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Ser Lys Glu Asp Gly
50 55 60
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Thr Ala Thr Phe Asn Gln Trp Val Asp
65 70 75 80
Leu Val Pro Gln Gly Leu Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Tyr
85 90 95
Ala Gln Asp Glu Ala Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Gln His Ile Thr
100 105 110
Pro Asn Tyr Arg Lys Leu Glu Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
115 120 125
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val Asn Ala Pro Lys Phe Cys Gln
130 135 140
Tyr Leu Gln Arg Glu Ala Gln Lys Leu Gly Val Thr Phe Glu Arg Arg
145 150 155 160
Leu Val Thr Ser Leu Glu Gln Ile Glu Gly Gly Phe Asp Leu Ile Val
165 170 175
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Val Glu Asp Gln
180 185 190
Glu Val Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Asp Cys
195 200 205
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Asn Ser Pro Ala Tyr Ile
210 215 220
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Leu Val
225 230 235 240
Gly Asn Tyr Asp Leu Ser Val Asp Pro Pro Thr Ile Asn Arg Ile Leu
245 250 255
Gln His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Ser Ile Ser Thr Asp Gly Thr Leu
260 265 270
Glu Gly Ile Glu Ile Val Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
275 280 285
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Val Glu Arg Val Ala Phe Pro Leu Glu
290 295 300
Arg Gly Lys Ser Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ala Arg Ala Asp Ser Ser
305 310 315 320
Lys Pro Arg Arg Glu Val Pro Val Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser
325 330 335
Ala Gly Tyr Gln Gln Gly Trp Gly Ala Ala Leu Glu Val Ala Glu Leu
340 345 350
Val Glu Gly Ala Ile Gly Ala Ala Pro Ala Arg Ser Ser His Arg Trp
355 360 365
Leu Ser Lys Leu
370
<210> 2
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ctgaccctgg cgcagaaagg ctacagcgtt cacgttgtgg cgcgtgacct gccggaagat 120
accgttgcgc aaacctttgc gagcccgtgg gcgggtgcga actggacccc gtttatgagc 180
aaggaagacg gtccgcgtca ggcgaaatgg gagaccgcga cctttaacca gtgggttgat 240
ctggtgccgc aaggtctggc gatgtggctg aagggcaccc gtcgttatgc gcaagatgag 300
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agcgaatgcc cgccgggtgc gattggtgtt acctacgata ccctgagcgt gaacgcgccg 420
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<210> 3
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<210> 6
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggcgccga gcaagcgtgt ggttgtgctg ggtagcggcg ttgttggtct gagcagcgcg 60
ctgaccctgg cgcagaaagg ctacagcgtt cacgttgtgg cgcgtgacct gccggaagat 120
accgttgcgc aaacctttgc gagcccgtgg gcgggtgcgg tttggacccc ggaaatgacc 180
aaggaagacg gtccgcgtca ggcgaaatgg gagaccgcga cctttaacca gtgggttgat 240
ctggtgccgc aaggtctggc gatgtggctg aagggcaccc gtcgttatgc gcaagatgag 300
gcgggtctgc tgggtcactg gtaccaacac atcaccccga actatcgtaa actggagagc 360
agcgaatgcc cgccgggtgc gattggtgtt acctacgata ccctgagcgt gaacgcgccg 420
aagttctgcc agtatctgca acgtgaagcg cagaaactgg gtgttacctt tgagcgtcgt 480
ctggtgacca gcctggagca aatcgaaggt ggcttcgacc tgattgttaa cgcgaccggt 540
ctgggtgcga agagcattgc gggtgttgaa gaccaggaag tggaaccgat tcgtggccaa 600
accgttctgg tgaagagcgc ttgcaaacgt tgcacctctg acagcagcga tccgaacagc 660
ccggcgtaca tcattccgcg tccgggtggc gaggtgatct gcggtggcac ctacctggtt 720
ggtaactatg acctgagcgt ggatccgccg accatcaacc gtattctgca gcactgcctg 780
cgtctggacc cgagcattag caccgatggt accctggagg gcatcgaaat tgttcgtcat 840
aacgttggcc tgcgtccggc gcgtcgtggt ggcccgcgtg ttgaggtgga acgtgttgcg 900
tttccgctgg aacgtggcaa gagcaaactg agcctgggta ccgcgcgtgc ggatagcagc 960
aaaccgcgtc gtgaggtgcc ggttgtgcac gcgtacggtt tcagcagcgc gggttatcaa 1020
cagggttggg gcgcggcgct ggaagtggcg gaactggtgg agggtgcgat tggtgcggcg 1080
ccggcgcgta gcagccaccg ttggctgagc aaactg 1116
<210> 39
<211> 425
<212> PRT
<213> 假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)
<400> 39
Met Ser Lys Asn Glu Ser Leu Leu Gln Arg Arg Gln Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Arg Gly Val Ser Gln Ile His Pro Ile Val Ala Glu Arg Ala Glu Asn
20 25 30
Ala Thr Val Trp Asp Val Asp Gly Arg Glu Tyr Ile Asp Phe Ala Gly
35 40 45
Gly Ile Ala Val Leu Asn Thr Gly His Leu His Pro Lys Val Ile Ala
50 55 60
Ala Val Gln Glu Gln Leu Thr Lys Leu Thr His Thr Cys Phe Gln Val
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Glu Pro Tyr Ile Ala Leu Cys Glu Glu Ile Ala Lys Arg
85 90 95
Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Lys Thr Leu Leu Val Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Glu Ala Val Glu Asn Ala Val Lys Ile Ala Arg Ala Ala Thr Gly Arg
115 120 125
Ala Gly Val Ile Ala Phe Thr Gly Ala Tyr His Gly Arg Thr Met Met
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Thr Gly Lys Val Val Pro Tyr Ser Ala Gly Met Gly
145 150 155 160
Leu Met Pro Gly Gly Val Phe Arg Ala Leu Ala Pro Cys Pro Leu His
165 170 175
Gly Ile Ser Glu Asp Glu Ser Ile Ala Ser Ile Glu Arg Ile Phe Lys
180 185 190
Asn Asp Ala Gln Pro Arg Asp Ile Ala Ala Ile Ile Ile Glu Pro Val
195 200 205
Gln Gly Glu Gly Gly Phe Tyr Val Asn Ser Pro Ala Phe Met Lys Arg
210 215 220
Leu Arg Ala Leu Cys Asp Glu His Gly Ile Leu Leu Ile Ala Asp Glu
225 230 235 240
Val Gln Thr Gly Ala Gly Arg Thr Gly Thr Phe Phe Ala Thr Glu Gln
245 250 255
Leu Gly Ile Val Pro Asp Leu Thr Thr Phe Ala Lys Ser Val Gly Gly
260 265 270
Gly Phe Pro Ile Ser Gly Val Cys Gly Lys Ala Glu Ile Met Asp Ser
275 280 285
Ile Ala Pro Gly Gly Leu Gly Gly Thr Tyr Ala Gly Ser Pro Ile Ala
290 295 300
Cys Ala Ala Ala Leu Ala Val Met Glu Val Phe Glu Glu Glu Lys Leu
305 310 315 320
Leu Glu Arg Ser Gln Ala Leu Gly Glu Lys Leu Lys Ala Gly Leu Asn
325 330 335
Ala Ile Ala Ala Lys His Lys Val Ile Gly Asp Val Arg Gly Leu Gly
340 345 350
Ser Met Val Ala Ile Glu Leu Phe Glu Gly Gly Asp His Asn Lys Pro
355 360 365
Ala Ala Glu Leu Val Gly Lys Ile Val Ala Arg Ala Arg Glu Lys Gly
370 375 380
Leu Ile Leu Leu Ser Cys Gly Thr Tyr Tyr Asn Val Ile Arg Phe Leu
385 390 395 400
Met Pro Val Thr Ile Pro Asp Ala Gln Leu Glu Lys Gly Ile Ala Ile
405 410 415
Val Ala Glu Cys Phe Asp Glu Leu Ala
420 425
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgttgcacct ctgacagcag cgatccgaac 30
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgctgctgtc agaggtgcaa cgtttgca 28
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgttgcaccc gtgacagcag cgatccgaac 30
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgctgctgtc acgggtgcaa cgtttgca 28
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgggtgcggt ttggaccccg gaaatgagca aggaa 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atttccgggg tccaaaccgc acccgcccac gggct 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgggtgcggg ttggaccccg gaaatgagca aggaa 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atttccgggg tccaacccgc acccgcccac gggct 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgggtgcgct ttggaccccg gaaatgagca aggaa 35
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atttccgggg tccaaagcgc acccgcccac gggct 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgggtgcggc ttggaccccg gaaatgagca aggaa 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atttccgggg tccaagccgc acccgcccac gggct 35
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaccccggaa atgagcaagg aagacgg 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttgctcatt tccggggtcc aaaccgc 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaccccggct atgagcaagg aagacgg 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttgctcata gccggggtcc aaaccgc 27
<210> 23
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaccccgcgt atgagcaagg aagacgg 27
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttgctcata cgcggggtcc aaaccgc 27
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gaccccgtcg atgagcaagg aagacgg 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttgctcatc gacggggtcc aaaccgc 27
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtgaagagcg cttgcaaacg ttgcacctct 30
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caacgtttgc aagcgctctt caccagaac 29
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtgaagagca cgtgcaaacg ttgcacctct 30
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caacgtttgc acgtgctctt caccagaac 29
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgaagagcg agtgcaaacg ttgcacctct 30
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caacgtttgc actcgctctt caccagaac 29
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ccggaaatga ctaaggaaga cggtccgcgt 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtcttcctta gtcatttccg gggtccaaac 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ccggaaatgg ctaaggaaga cggtccgcgt 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtcttcctta gccatttccg gggtccaaac 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ccggaaatgg agaaggaaga cggtccgcgt 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtcttccttc tccatttccg gggtccaaac 30
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atgaacacca acaacgctc 19
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttaagcctgt ttagcttc 18

Claims (10)

1.一种生物多酶偶联法氧化还原不对称制备L-草铵膦的方法，以为原料，经酶催化体系催化获得L-草铵膦，其特征在于，所述酶催化体系包括用于将D,L-草铵膦中的D-草铵膦催化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D-氨基酸氧化酶突变体、以及用于将2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L-草铵膦的转氨酶，
所述D-氨基酸氧化酶突变体由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：
(1)M213S；
(2)M213S-N54V-F58E；
(3)M213S-N54V-F58E-D207A；
(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶突变体通过在反应体系中加入表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌获得；
所述转氨酶通过在反应体系中加入表达所述转氨酶的基因工程菌获得，同时还加有辅酶磷酸吡哆醛。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所用基因工程菌的宿主细胞均为E.coliBL21(DE3)。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，反应体系中D,L-草铵膦的终浓度为100～400mM，表达所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因工程菌添加量为20～40g/L，表达所述转氨酶的基因工程菌添加量为30～50g/L，所述辅酶磷酸吡哆醛的浓度为1mM。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，反应的温度为30℃，时间为10h，反应的pH值为8。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应完成后，终产物L-草铵膦分离提取的方法为预处理-离子交换法-结晶。
8.一种D-氨基酸氧化酶突变体，其特征在于，由野生菌Rhodotorula taiwanensis中的D-氨基酸氧化酶突变所得，突变位点选自以下四种中的一种：
(1)M213S；
(2)M213S-N54V-F58E；
(3)M213S-N54V-F58E-D207A；
(4)M213S-N54V-F58E-D207A-S60T。
9.编码如权利要求8所述D-氨基酸氧化酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQID No.3～6中的一种。
10.一种包含如权利要求9所述基因的基因工程菌。
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