CN110055289A - 一种l-草铵膦的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑草铵膦的制备方法。该制备方法包括：在L‑氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下，将2‑氧代‑4‑(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，再将制得的L‑草铵膦盐进行酸化反应即可；所述的L‑氨基酸脱氢酶来为源于嗜热脂肪芽孢杆菌的L‑氨基酸脱氢酶和/或来源于中间型高温放线菌的L‑氨基酸脱氢酶。本发明的L‑草铵膦的制备方法操作简单，不使用成本昂贵的还原性辅酶NADPH，采用辅酶NADH即可，降低了反应的成本；利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-草铵膦的制备方法。
背景技术
草铵膦是由赫斯特公司80年代开发的广谱触杀型除草剂。目前世界上的三大除草剂是草甘膦、草铵膦、百草枯，相对于草甘膦和百草枯，草铵膦具有优异的除草性能及较小的副作用。草铵膦有两种光学异构体，分别为D-草铵膦和L-草铵膦，但是只有L-草铵膦具有除草活性，因此发展L-草铵膦的方法对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
目前，制备L-草铵膦的方法主要有手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
手性拆分法如CN1053669C公开了利用奎宁生物碱作为拆分剂的方法，重结晶出L-草铵膦奎宁盐，然后用酸中和盐可以得到L-草铵膦。同时利用5-硝基水杨醛或3,5-二硝基水杨醛作为消旋化试剂消旋化未反应的D-草铵膦，得到DL-草铵膦，继续用于拆分反应。但是这种方法需要昂贵的手性拆分试剂，以及多步重结晶，操作繁琐，还不是一种理想的方法。
化学合成法如US6936444公开了钌催化剂不对称氢化2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁烯酸得到L-2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁酸，再经脱乙酰可以得到L-草铵膦。此方法需要昂贵的金属催化剂，成本较高，以及重金属残留，对环境污染严重。
相对于手性拆分法，化学合成法，生物催化法具有专一性强，反应条件温和等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。
目前有US4389488(A)记载的用N-苯乙酰-DL-草铵膦为底物，来源于大肠杆菌的青霉素-G-酰基转移酶为催化剂，得到L-草铵膦的方法，但是苯乙酰草铵膦的合成成本比较高，且反应结束后得到L-草胺膦，N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸的混合溶液，需要采用强酸阳离子交换树脂分离出L-草铵膦，操作比较复杂。
EP0382113A记载了利用酰基转移酶对N-乙酰-草铵膦的羧酸酯进行催化裂解得到L-草铵膦的方法，但是此方法中的酶对游离的N-乙酰-草铵膦没有特异性，因此必须对N-乙酰-草铵膦进行酯化，增加了反应的步骤，且相应的增加了生产成本。
另有一部分是采用2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经转氨酶催化制备L-草铵膦的方法，其中US5221737A和EP0344683A记载了用谷氨酸作为氨基供体，自相应酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过来源于大肠杆菌的氨基转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，反应体系中需要等量或过量的氨基供体谷氨酸，使产物难以纯化。CN1284858C对上述方法进行了改进，采用天冬氨酸作为氨基供体，自相应的酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过天冬氨酸转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，此方法中天冬氨酸转变为草酰乙酸，而草酰乙酸在含水介质中不稳定，并自发的脱羧为丙酮酸，丙酮酸可通过酶促反应除去，使得逆反应不能进行，反应只需要等摩尔的氨基供体和氨基受体。但是使用转氨酶的方法中所用的氨基供体多为氨基酸，成本较高。
另外还有采用2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸(PPO)为底物，经氨基酸脱氢酶催化，制备L-草铵膦的方法，如CN106978453A，其采用无机氨基供体，使得产物分离简单，成本降低。但是CN106978453A中效果较好的氨基酸脱氢酶都需要采用昂贵的NADPH作为辅酶，生产成本仍然较高
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的制备L-草铵膦的方法原料成本高等缺陷，因此本发明提供一种L-草铵膦的制备方法。利用本发明的制备方法制备L-草铵膦操作简单，可不使用成本昂贵的NADPH，采用辅酶NADH即可，降低了反应的成本；利于工业化生产。
本发明主要是通过以下技术手段解决上述技术问题的。
本发明提供一种L-草铵膦盐的制备方法，其包括：在L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，得到L-草铵膦盐即可；所述的L-氨基酸脱氢酶为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的L-氨基酸脱氢酶和/或来源于中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的L-氨基酸脱氢酶；
在所述的氨化反应中，所述的L-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如钠离子和/或钾离子。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如钠离子和/或钾离子。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氨化反应中，较佳地，所述的L-氨基酸脱氢酶为NCBI登录号为AMF65993.1，Q60030.1和P22823.1对应的酶中的一种或多种。
在所述的氨化反应中，所述的L-氨基酸脱氢酶的用量可为本领域常规，所述的L-氨基酸脱氢酶的浓度较佳地为0.05-0.3U/ml，更佳地为0.13-0.2U/ml，进一步更佳地为0.15U/ml。
在所述的氨化反应中，较佳地，所述的无机氨基供体为氨气(其使用形式可为氨水)、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵和碳酸氢铵中的一种或多种。
在所述的氨化反应中，所述的无机氨基供体的用量可为本领域常规，所述的无机氨基供体的浓度较佳地为50-500mM，更佳地为200mM。
在所述的氨化反应中，在所述反应体系中，所述的还原型辅酶NADH的用量可为本领域常规，较佳地，所述还原型辅酶NADH与所述2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的摩尔比较佳地为为1:100-1:10，更佳地为1:80-1:20，进一步更佳地为1:50-1:30。
在所述的氨化反应中，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的用量可为本领域常规，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的浓度较佳地为20-100mM，更佳地为50mM。
在所述的氨化反应中，所述反应的温度可为本领域常规，为了保证所述的L-氨基酸脱氢酶的催化效率，进行所述氨化反应的温度较佳地为20-50℃，更佳地为37℃，当所述氨化反应的温度低于20℃时，氨化反应较慢；当所述氨化反应的温度高于50℃时，酶将不可逆变性失活。
在所述的氨化反应中，所述的反应在水中进行。
在所述的制备方法中，进行所述氨化反应的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。所述的碱溶液较佳地为氨水。
所述的L-草铵膦盐的制备方法还可进一步包括：在脱氢酶(例如葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶)以及供氢体(葡萄糖、异丙醇或甲酸盐)的存在下，将氧化型辅酶NAD+进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADH即可。
在所述的还原反应中，所述的脱氢酶与所述的供氢体一一对应，例如：
当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；
当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；
当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。
在所述的还原反应中，所述的脱氢酶的浓度可为本领域常规，较佳地为0.5-5U/mL，更佳地为2U/mL。
在所述的还原反应中，所述的供氢体的浓度可为本领域常规，较佳地为20-250mM，更佳地为75mM。
在所述的还原反应中，所述的氧化型辅酶NAD+的浓度可为本领域常规。
在所述的还原反应中，进行所述还原反应的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。所述的碱溶液较佳地为氨水。
在所述的还原反应中，所述反应体系的温度可为本领域常规，较佳地为20-50℃，更佳地为37℃。
所述的还原反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如：在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、氧化型辅酶NAD+、L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应(同时存在着的NAD+的还原反应)，得到L-草铵膦盐即可。
当所述的还原反应和所述的氨化反应同时进行时，所述的氨化反应所用的NADH可通过所述的还原反应循环生成。所述的氧化型辅酶NAD+的浓度可为本领域常规，为保证所述反应能够正常进行，较佳地为0.5-5mM，更佳地为2mM。
所述的L-草铵膦盐的制备方法还可进一步包括：在D-氨基酸氧化酶(DAAO)的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐即可。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如钠离子和/或钾离子。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的氧化反应中，所述的D-草铵膦盐可单独存在、或、与L-草铵膦盐共同存在(此时L-草铵膦盐可不发生反应)，例如：D型富集的草铵膦盐(即其中D型对映体的含量＞50％，乃至于纯D-草铵膦盐)、L型富集的草铵膦盐(即其中L-草铵膦的含量＞50％，不包括纯L-草铵膦盐的情况)或消旋体草铵膦盐。
在所述的氧化反应中，所述的D氨基酸氧化酶(DAAO)的浓度可为本领域常规，较佳地为0.2-5U/mL，更佳地为1U/mL。
在所述的氧化反应中，所述D-草铵膦盐的浓度可为本领域常规，较佳地为20-100mM，更佳地为50mM。
所述的氧化反应还可在过氧化氢酶的存在下进行。
所述的氧化反应还可在通气的条件下进行。所述通气的速率较佳地为0.5VVM。当所述的氧化反应还可在通气的条件下进行时，所述的氧化反应还可在消泡剂的存在下进行。
在所述的氧化反应中，所述反应体系的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用碱(或碱溶液)调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。所述的碱溶液较佳地为氨水。
在所述的氧化反应中，所述反应体系的温度可为本领域常规，较佳地为20-50℃，更佳地为37℃。
所述的氧化反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如：在D氨基酸氧化酶(DAAO)、L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶NADH的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应，得到L-草铵膦盐即可。
所述的还原反应、所述的氧化反应和所述的氨化反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。所述的同时进行例如：在D氨基酸氧化酶(DAAO)、脱氢酶、氢供体、氧化型辅酶NAD+、L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应(同时存在着的NAD+的还原反应)，得到L-草铵膦盐即可。
当所述的还原反应、所述的氧化反应和所述的氨化反应同时进行时，所述的氨化反应所用的NADH可通过所述的还原反应循环生成。所述的氧化型辅酶NAD+的浓度可为本领域常规，为保证所述反应能够正常进行，较佳地为0.5-5mM，更佳地为2mM。
本发明还提供一种L-草铵膦的制备方法，其包括下述步骤：
(1)按照上述的L-草铵膦盐的制备方法，制得L-草铵膦盐；
(2)将步骤(1)制得的L-草铵膦盐进行酸化反应，得到L-草铵膦。
本发明还提供一种L-氨基酸脱氢酶在制备L-草铵膦盐中的应用。所述的应用可包括：在L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行反应，即可；所述的L-氨基酸脱氢酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)和/或中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)。较佳地，所述的L-氨基酸脱氢酶为NCBI登录号为AMF65993.1，Q60030.1和P22823.1对应的酶中的一种或多种。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的L-草铵膦的制备方法操作简单，不使用成本昂贵的还原性辅酶NADPH，采用辅酶NADH即可，降低了反应的成本；利于工业化生产。
附图说明
图1为实施例9制备所得产物中D-草铵膦与L-草铵膦的柱前衍生HPLC分析结果。
图2为外消旋草铵膦标准品的Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱，其中最后两个峰是Marfey试剂空白样的峰。
图3为实施例9制备所得PPO的HPLC分析结果。
图4为PPO标准品的离子对HPLC图谱。
图5为外消旋草铵膦标准品的离子对HPLC图谱。
图6为PPO的质谱图。
图7为产品L-草铵膦的核磁氢谱(HNMR)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
Pet28a购买自Novagen公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，BL21感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；过氧化氢酶购买自山东丰泰生物科技有限公司。
产物的手性分析及浓度分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，3.5μm，150*4.6mm。流动相A：0.1％TFA+H2O，流动相B：0.1％TFA+ACN。梯度洗脱。检测波长：340nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃。
(2)衍生化试剂：Marfey试剂。准确称取50mg的N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺，用乙腈溶解配置成25ml溶液，备用。
(3)衍生反应：取反应液稀释10倍，加等量的Marfey试剂衍生。进样10μl进行分析。
转化率＝(反应物-剩余反应物)/反应物×100％
PPO通过离子对色谱分析，具体的分析方法为：
色谱条件：Ultimate AQ-C18，5μm，4.6*250mm；流动相：0.05mol/L磷酸氢二铵PH＝3.6:10％四丁基氢氧化铵水溶液：乙腈＝91:1:8；检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃。
实施例1 D氨基酸氧化酶(DAAO)基因的获取
根据专利US9834802B2中记载的AC302DAAO酶的基因序列全合成DAAO酶。
实施例2 D氨基酸氧化酶(DAAO)基因的表达
将DAAO酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，加入IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌。菌株加入终浓度为25％的无菌甘油后，置于-80℃低温冰箱保藏备用。
实施例3 D氨基酸氧化酶(DAAO)菌株的培养与粗酶液的制备及酶活测定
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将含有DAAO酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH8.0的磷酸缓冲液中，超声破碎，破碎液离心去除沉淀，得到上清液含重组DAAO酶的粗酶液，酶活为10U/mL。
酶活检测方法：100μL pH 8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含D-草铵膦50mmol/L和过氧化物酶0.1mg/mL)，加入50μL显示剂(60μg/mL 2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸和1mg/mL 4-氨基安替比林)，50μL的DAAO酶，510nm处检测紫外吸收测定H2O2浓度，计算出PPO的浓度，并计算酶活。
单位酶活的定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟生成1μmol PPO所需要的酶量。
以下实施例中所用到的DAAO酶均为该实施例制备得到的DAAO酶。
实施例4 L-氨基酸脱氢酶基因的获取
从NCBI数据库中检索到不同微生物来源的L-氨基酸脱氢酶，NCBI登录号以及酶的编号和类型见表1，根据这些基因序列全合成L-氨基酸脱氢酶基因。L-氨基酸脱氢酶酶库信息如下：
表1 L-氨基酸脱氢酶酶库
实施例5 L-氨基酸脱氢酶基因的表达
将L-氨基酸脱氢酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，加入IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌。菌株加入终浓度为25％的无菌甘油后，编号，置于-80℃低温冰箱保藏备用。
实施例6 L-氨基酸脱氢酶菌株的培养与粗酶液的制备及酶活测定
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将含有L-氨基酸脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH8.0的磷酸缓冲液中，超声破碎，破碎液离心去除沉淀，得到上清液含重组L-氨基酸脱氢酶的粗酶液。将该粗酶液离心收集上清，用超滤管浓缩酶液后即得浓缩酶液。
酶活检测方法：25g/L菌体(超声波破碎)、10mM底物、20mM辅酶(NADH)、750mMNH4Cl，总体系为400μL，反应介质为pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。于30℃金属浴振荡反应器内反应6h，加入40μL 5M的NaOH终止反应后置于冰上保存。样品稀释一定倍数后利用柱前衍生化高效液相检测其L-草铵膦的浓度，并计算酶活。
单位酶活的定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟生成1μmol L-草铵膦所需要的酶量。
以下实施例中用到的L-氨基酸脱氢酶均为该实施例中制备得到的L-氨基酸脱氢酶。
表2所得粗酶液的酶活测定
实施例7葡萄糖脱氢酶基因的获取和表达
根据来源于枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因，全合成葡萄糖脱氢酶基因。
葡萄糖脱氢酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，加入IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌。菌株加入终浓度为25％的无菌甘油后，编号，置于-80℃低温冰箱保藏备用。
实施例8葡萄糖脱氢酶菌株的培养与粗酶液的制备及酶活测定
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH8.0的磷酸缓冲液中，超声破碎，破碎液离心去除沉淀，得到上清液含重组葡萄糖脱氢酶的粗酶液。
酶活检测方法：1mL反应体系，25℃条件下，先加980μL的pH7.0 50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含葡萄糖400mM)，再加10μL NAD(25mM)，最后加10μL适量的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值，计算出酶活为20U/mL。
单位酶活定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟产生1μmol NADH所需要的酶量。
以下实施例中所用的葡萄糖脱氢酶粗酶液均为该实施例制备得到的葡萄糖脱氢酶粗酶液。
实施例9 L-氨基酸脱氢酶Enz.6催化制备L-草铵膦
称取PPO、NAD+、NH4Cl和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入20mL实施例6得到的L-氨基酸脱氢酶Enz.6浓缩酶液和5mL葡萄糖脱氢酶粗酶液，用50mM pH为8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使PPO的终浓度为50mM，L-氨基酸脱氢酶的终浓度为0.2U/mL，葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，葡萄糖终浓度为75mM，氯化铵终浓度为200mM，NAD+终浓度为2mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，37℃水浴磁力搅拌反应30h后利用HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量和ee值。
反应结束数据如下：PPO剩余7.4mM，PPO转化率85.2％。L-PPT的生成浓度为42.5mM，ee值达到99％以上。
产物中D-草铵膦与L-草铵膦的HPLC分析结果见图1，其中，保留时间为13.671min的为L-草铵膦，D-草铵膦几乎检测不到；外消旋草铵膦标准品(购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱如图2所示(L-草铵膦的保留时间为13.683min，D-草铵膦的保留时间为12.016min)。该实施例所制备得到的产物的成分与标准品中L-草铵膦的出峰时间基本一致；另外，对得到的产品经柱纯化，重结晶得到纯的产品，经HNMR核磁及旋光度鉴定为L-草铵膦。[a]D22＝+29.8°(C＝1,1N HCl)，HNMR图谱见图7(现有技术中US4389488已有L-草铵膦旋光度的记载)，说明该实施例制备得到L-草铵膦。
制备所得PPO的离子对HPLC分析结果见图3，其中，9.690min为PPO的出峰位置，3.815min为L-草铵膦的出峰位置。PPO标准品的离子对HPLC图谱如图4所示，其中，PPO标准品的保留时间为9.520min，PPO的质谱图详见图6。外消旋草铵膦(购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的离子对HPLC图谱如图5所示，其中，外消旋草铵膦标准品的保留时间为3.829min。可见，该实施例中PPO与产物草铵膦的出峰时间与各自标准品的出峰时间基本一致。
实施例10 L-氨基酸脱氢酶Enz.8催化制备L-草铵膦
称取PPO、NAD+、NH4Cl和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入20mL L-氨基酸脱氢酶Enz.8浓缩酶液和5mL葡萄糖脱氢酶粗酶液，用50mM pH为8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使PPO的终浓度为50mM，L-氨基酸脱氢酶的终浓度为0.15U/mL，葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，葡萄糖终浓度为75mM，氯化铵终浓度为200mM，NAD+终浓度为2mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，37℃水浴磁力搅拌反应30h后利用HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量和ee值。
反应结束数据如下：PPO剩余10.5mM，PPO转化率79％。L-PPT的生成浓度为39.3mM，ee值达到99％以上(对最终所得产品的纯化以及鉴定方法和数据同实施例9)。
实施例11 L-氨基酸脱氢酶Enz.13催化制备L-草铵膦
称取PPO、NAD+、NH4Cl和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入20mL L-氨基酸脱氢酶Enz.13浓缩酶液和5mL葡萄糖脱氢酶粗酶液，用50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使PPO的终浓度为50mM，L-氨基酸脱氢酶的终浓度为0.15U/mL，葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，葡萄糖终浓度为75mM，氯化铵终浓度为200mM，NAD+终浓度为2mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，37℃水浴磁力搅拌反应30h后利用HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量和ee值。
反应结束数据如下：PPO剩余13.3mM，PPO转化率73.4％。L-PPT的生成浓度为36.6mM，ee值达到99％以上(对最终所得产品的纯化以及鉴定方法和数据同实施例9)。
实施例12 DAAO酶和L-氨基酸脱氢酶Enz.6催化制备L-草铵膦
称取D,L-草铵膦、NAD+、NH4Cl、和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入5mLDAAO粗酶液，20mL L-氨基酸脱氢酶Enz.6浓缩酶液、5mL葡萄糖脱氢酶粗酶液和20mg 20万U/g的过氧化氢酶，用50mMpH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使D,L-草铵膦的终浓度为100mM，DAAO酶的终浓度为1U/mL，L-氨基酸脱氢酶的终浓度为0.2U/mL，葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，葡萄糖终浓度为75mM，氯化铵终浓度为200mM，NAD+终浓度为2mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，按照0.5VVM(每分钟通入0.5倍反应体积的空气)，加入200μL消泡剂防止起泡，37℃水浴磁力搅拌反应30h后利用HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量和ee值。
反应结束数据如下：无D-草铵膦，PPO 7mM(由50mM D-草铵膦生成，生成的PPO部分转化为L-草铵膦)，PPO转化率达到86％，L-草铵膦的ee值达到99％以上(对最终所得产品的纯化以及鉴定方法和数据同实施例9)。
实施例13 DAAO酶和L-氨基酸脱氢酶Enz.8催化制备L-草铵膦
称取D,L-草铵膦、NAD+、NH4Cl、和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入5mLDAAO粗酶液，20mL L-氨基酸脱氢酶Enz.8浓缩酶液、5mL葡萄糖脱氢酶粗酶液和20mg 20万U/g的过氧化氢酶，用50mMpH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使D,L-草铵膦的终浓度为100mM，DAAO酶的终浓度为1U/mL，L-氨基酸脱氢酶的终浓度为0.15U/mL，葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，葡萄糖终浓度为75mM，氯化铵终浓度为200mM，NAD+终浓度为2mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，按照0.5VVM(每分钟通入0.5倍反应体积的空气)，加入200μL消泡剂防止起泡，37℃水浴磁力搅拌反应30h后利用HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量和ee值。
反应结束数据如下：D-草铵膦全部反应完，产生的PPO剩余10.1mM，PPO转化率达到79.8％，L-草铵膦的ee值达到99％以上(对最终所得产品的纯化以及鉴定方法和数据同实施例9)。
实施例14 DAAO酶和L-氨基酸脱氢酶Enz.13催化制备L-草铵膦
称取D,L-草铵膦、NAD+、NH4Cl、和葡萄糖到反应瓶中，50mM pH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用25％浓氨水调pH至8.0，加入5mL DAAO粗酶液，20mL L-氨基酸脱氢酶Enz.13浓缩酶液、5mL葡萄糖脱氢酶粗酶液和20mg 20万U/g的过氧化氢酶，用50mMpH为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使D,L-草铵膦的终浓度为100mM，DAAO酶的终浓度为1U/mL，L-氨基酸脱氢酶的终浓度为0.13U/mL，葡萄糖脱氢酶的终浓度为2U/mL，葡萄糖终浓度为75mM，氯化铵终浓度为200mM，NAD+终浓度为2mM。反应过程中用氨水控制pH为8.0，按照0.5VVM(每分钟通入0.5倍反应体积的空气)，加入200μL消泡剂防止起泡，37℃水浴磁力搅拌反应30h后利用HPLC检测PPO的残余浓度，同时利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-PPT的生成量和ee值(对最终所得产品的纯化以及鉴定方法和数据同实施例9)。
反应结束数据如下：PPO剩余12.9mM，PPO转化率达到74.2％，L-草铵膦的ee值达到99％以上。
对比例
1、从NCBI数据库中检索到不同微生物来源的L-氨基酸脱氢酶。详见下表。
表3 L-氨基酸脱氢酶酶库
2、酶的表达、粗酶液的制备
酶的表达以及粗酶液的制备的方法同实施例5和6。分别使用表3中的L-氨基酸脱氢酶和实施例1制备得到的DAAO酶制备L-草铵膦，除L-氨基酸脱氢酶外，其他均与实施例12、13或14相同。
测定结果见下表：
表4酶活及ee值的测定结果
注：N.A为未检测。
Claims (12)
1.一种L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，其包括：在L-氨基酸脱氢酶、无机氨基供体和还原型辅酶NADH的存在下，将2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，即可；所述的L-氨基酸脱氢酶为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的L-氨基酸脱氢酶和/或来源于中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的L-氨基酸脱氢酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的L-氨基酸脱氢酶为NCBI登录号为AMF65993.1、Q60030.1和P22823.1对应的酶中的一种或多种；
和/或，所述的L-氨基酸脱氢酶的浓度为0.05-0.3U/ml，较佳地为0.13-0.2U/ml，更佳地为0.15U/ml；
和/或，所述的无机氨基供体的浓度为50-500mM，较佳地为200mM；
和/或，所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的浓度为20-100mM，较佳地为50mM；
和/或，所述还原型辅酶NADH与所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐的摩尔比为1:100-1:10，较佳地为1:80-1:20，更佳地为1:50-1:30；
和/或，所述的无机氨基供体为氨气、硫酸铵、氯化铵、磷酸氢二铵、乙酸铵、甲酸铵和碳酸氢铵中的一种或多种，所述氨气的使用形式较佳地为氨水；
和/或，所述的氨化反应在水中进行；
和/或，所述氨化反应的反应体系的pH为7-9，较佳地为8；
和/或，所述氨化反应的反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括：在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NAD+进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADH即可。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；
和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐；
较佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的脱氢酶的浓度为0.5-5U/mL，较佳地为2U/mL；
和/或，所述的供氢体的浓度为20-250mM，较佳地为75mM；
和/或，所述的还原反应在水中进行；
和/或，所述还原反应的反应体系的pH为7-9，较佳地为8；
和/或，所述还原反应的反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：在所述葡萄糖脱氢酶、所述葡萄糖、所述氧化型辅酶NAD+、所述L-氨基酸脱氢酶、所述无机氨基供体的存在下，将所述2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐进行氨化反应，得到L-草铵膦盐即可；较佳地，所述的氧化型辅酶NAD+的浓度为0.5-5mM，更佳地为2mM。
7.如权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括：在D-氨基酸氧化酶的存在下，将D-草铵膦盐进行氧化反应，得到所述的2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸盐即可。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的D-草铵膦盐单独存在、或、与L-草铵膦盐共同存在；所述的与L-草铵膦盐共同存在的形式为D型富集的草铵膦盐、L型富集的草铵膦盐或消旋体草铵膦盐；
和/或，所述的D氨基酸氧化酶的浓度为0.2-5U/mL，较佳地为1U/mL；
和/或，所述的氧化反应在通气的条件下进行，所述通气的速率较佳地为0.5VVM；
和/或，所述的氧化反应在过氧化氢酶的存在下进行；
和/或，所述的D-草铵膦盐的浓度为20-100mM，较佳地为50mM；
和/或，所述的氧化反应在水中进行；
和/或，所述的氧化反应的反应体系的pH为7-9，较佳地为8；
和/或，所述的氧化反应的反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：在所述D氨基酸氧化酶、所述L-氨基酸脱氢酶、所述无机氨基供体和所述还原型辅酶NADH的存在下，将所述D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应，得到L-草铵膦盐即可。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：在所述D氨基酸氧化酶、所述脱氢酶、所述供氢体、所述氧化型辅酶NAD+、所述L-氨基酸脱氢酶、所述无机氨基供体的存在下，将所述D-草铵膦盐进行氧化反应和氨化反应，得到L-草铵膦盐即可；所述的氧化性辅酶NAD+的浓度较佳地为0.5-5mM，更佳地为2mM。
11.一种L-草铵膦的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)按照权利要求1～10任一项所述的制备方法，制得L-草铵膦盐；
(2)将步骤(1)制得的L-草铵膦进行酸化反应，得到L-草铵膦。
12.一种L-氨基酸脱氢酶在制备L-草铵膦盐中的应用，所述的L-氨基酸脱氢酶为如权利要求1或2中所述的L-氨基酸脱氢酶。
Applications Claiming Priority (2)
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| CN201810054031 | 2018-01-19 | ||
| CN2018100540313 | 2018-01-19 |
Publications (2)
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