JP2008148637A - 4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを減圧乾燥した後、前記ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。好ましくは、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを凍結処理した後、減圧乾燥を行う、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法である。
【選択図】 なし
Description
しかし、上記方法では、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを合成した後、反応液中に未反応の青酸が残存する。よって、次いでニトリルヒドラターゼにより、アミド化反応を実施する場合、残存している青酸により酵素が失活してしまうため、青酸を除去する必要がある。更に、青酸を例えば1ppm以下に除去しても、アミド化反応の反応速度が非常に遅く、反応速度を上昇させるためには大量の酵素を必要とする場合があった。
本発明では、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルは、エピハロヒドリン又は1,3−ジハロ−2−プロパノール、及び青酸又は青酸のアルカリ金属塩とから酵素触媒を用いて調製されたものを使用することが好ましい。
また前記溶媒に4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルが完全に溶解する必要は必ずしもない。
4−クロロ−3−ヒドロキシブチロニトリル(以下CHBNと略す)及び4−クロロ−3−ヒドロキシブチルアミド(以下CHBAと略す)の化学純度は、下記HPLC定量結果より算出した。
本発明において使用したHPLCはウォーターズ社製alliance2695もしくはアジレント社製HP1090である。詳細を以下に示す。
試料調製方法 : 反応液を移動相もしくは超純水に溶解
カラム : Capcell Pak C18 MGII(資生堂製)
2.0mm I.D.×100mm、 粒径3μm
カラムオーブン温度 : 40℃
移動相 : 0.05% ナノフルオロペンタン酸水溶液
流速 : 0.2mL/min
検出器 : 示差屈折計(SHODEX製RI SE−61)
CHBNの標品は、アズマックス株式会社製(化学純度98.9%)を用いた。CHBAの標品は、前記アズマックス株式会社製CHBNを原料とし、ニトリルヒドラターゼを用いて合成、酢酸エチルにより抽出後、シリカゲルカラムにより精製したCHBAを用いた。)
(R)−CHBN1μlにジクロロメタン20μl、ピリジン20μlを加えた後、(R)−α−メトキシ−α−(トリフルオロメチル)フェニルアセチルクロライド(MTPA)2μlを添加し、そのまま室温で5時間撹拌を行った。反応終了液にジイソプロピルエーテル300μlを添加し、続いて1N HCl水溶液350μlを用いて洗浄、有機層を回収した。さらに有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液350μlで洗浄し、有機層を減圧乾燥、残渣をイソプロパノールに溶解させ、これをHPLCで分析を行った。
本分析に用いたHPLCシステムは以下の通りである。
(R)−CHBN MTPAエステル
(S)−CHBN MTPAエステル
カラム : Partisil-5(GL Science)
4.6mm×250mm
カラムオーブン温度 : 40℃
移動相 : ヘキサン:イソプロパノール=99:1
流量 : 1ml/min
検出器 : UV 254nm
保持時間 : (R)−CHBN MTPAエステル:11.9min
(S)−CHBN MTPAエステル:13.0min
本発明で使用するニトリルヒドラターゼは、以下のようにして調製した。ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J−1(FERM BP-1478)を、30L容ジャーファーメンター(高杉製作所社製)にてグルコース2質量%、尿素1質量%、ペプトン0.5質量%、酵母エキス0.3質量%、塩化コバルト0.05質量%を含む、20Lの培地(pH7.0)に植菌し、温度30℃で好気的に60時間培養した。上記の方法により培養して得た菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液(pH 7.7)にて2回洗浄後、懸濁することで保存菌体液とした。
<実施例1>
乾燥後、30mMのリン酸バッファー(pH=7.9)を9g加えて再溶解し、試料溶液を再調製した。この再調製液に添加するJ−1菌菌体液を算出するために、再調製液および凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている各(R)−CHBN濃度を先に示したHPLC分析条件にて測定を行った。凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている(R)−CHBN濃度を1とした場合の再調製液に含まれている(R)−CHBN濃度の比を算出した。そして凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液1gに対して参考例1で調製したJ−1菌菌体液を1.5μL加えた場合と同じ割合となるように再調製液1gに参考例1で調製したJ−1菌菌体液を加え、10℃で反応を開始した。加えたJ−1菌菌体液量および反応結果は表1のようになった。
アヅマックス社製(R)−CHBN:20mg(0.167mmol)に30mMのリン酸バッファー(pH=7.9):980mgを加えた。10℃に冷却した後、参考例1で調製したJ−1菌希釈溶液を1.5μL加え、10℃で反応を開始した。反応結果は表1のようになった。
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌(Escherichia coli) JM109/pST111(FERM P-12065、特開平5-317066号参照)を、LB培地(1%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%NaCl、1mM IPTG、50μg/mlアンピシリン)を 100mL入れた500mL容三角フラスコに植菌し、37℃で20時間振盪培養した。前記培養菌体を遠心分離により集菌し、集菌した菌体を50mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)で洗浄し、50mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)で懸濁した。この菌体懸濁液0.25gを50mM トリス−硫酸緩衝液(pH 8.0)100mLに加え、さらに50mMとなるように1,3-ジクロロ-2-プロパノールを加え、20℃で10分間反応した。HPLCにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、11mMであった。
pH電極、ならびにpHコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した300mL4つ口フラスコに水127.55g、HCN4.41g(0.1632mol)を入れ、30%NaOH 0.65g(0.0049mol)で、pH7.5に調整した。1,3-ジクロロ-2-プロパノール10.00g(0.0775mol)を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
23時間後、4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリルを0.753mol/kg蓄積することができ、その光学純度は94.8%e.e.の(R)−体過剰であった。反応により消費された1,3-ジクロロ-2-プロパノールからの収率は96.3%であった。
この反応液を塩酸でpH=5.0に調節し、60℃、140torrで減圧して11時間HCNの除去を行い、反応系内のHCNを硝酸銀で滴定、1ppm以下であることを確認した。
上述の方法で合成した(R)−CHBNの反応終了水溶液1.5gを50mlのナスフラスコに採り、冷凍庫にて凍結処理した後、15時間かけて凍結乾燥を行った。乾燥後、30mMのリン酸バッファー(pH=7.9)を1.35g加えて再溶解し、試料溶液を再調製した。この再調製液に添加するJ−1菌菌体液を算出するために、再調製液および凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている各(R)−CHBN濃度を先に示したHPLC分析条件にて測定を行い、凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液に含まれている(R)−CHBN濃度を1とした場合の再調製液に含まれている(R)−CHBN濃度の比を算出した。そして凍結乾燥処理を実施する前の試料溶液1gに対して参考例1で調製したJ−1菌菌体液を1.5μL加えた場合と同じ割合となるように再調製液1gに参考例1で調製したJ−1菌菌体液を加え、10℃で反応を開始した。加えたJ−1菌菌体液量および反応結果は表2のようになった。
実施例2のi)〜ii)で合成した(R)−CHBNの反応終了水溶液1gを10℃に冷却した後、参考例1で調製したJ−1菌希釈溶液を1.5μL加え、10℃で反応を開始した。反応結果は表2のようになった。
Claims (2)
- 4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを減圧乾燥した後、前記ニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させる、4−ハロ−3−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
- 4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを凍結処理した後、減圧乾燥を行う、請求項1記載の方法。
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