CN109988806B - 一种n-乙酰-草铵膦盐的消旋方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N‑乙酰‑草铵膦盐的消旋方法。所述消旋方法包括下述步骤：在N‑乙酰氨基酸消旋酶的存在下，将N‑乙酰‑草铵膦盐进行消旋反应，即可；所述的N‑乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种。制备L‑草铵膦时利用将该消旋方法能降低成本、简便操作方法、反应条件温和环保；转化率可达50％以上；减小了分离纯化N‑乙酰草铵膦和草铵膦的工作量；另外，本发明的N‑乙酰氨基消旋酶可以和脱乙酰酶“一锅法”进行原位异构化‑拆分，节省了化学异构化乙酰草铵膦的步骤以及相关的蒸馏除水工作。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种N-乙酰-草铵膦盐的消旋方法。
背景技术
草铵膦是由赫斯特公司80年代开发的广谱触杀型除草剂。目前世界上的三大除草剂是草甘膦、草铵膦、百草枯，相对于草甘膦和百草枯，草铵膦具有优异的除草性能及较小的副作用。草铵膦有两种光学异构体，分别为D-草铵膦和L-草铵膦，但是只有L-草铵膦具有除草活性，因此发展L-草铵膦的方法对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。
目前，制备L-草铵膦的方法主要有手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
手性拆分法如CN1053669C公开了利用奎宁生物碱作为拆分剂的方法，重结晶出L-草铵膦奎宁盐，然后用酸中和盐可以得到L-草铵膦。同时利用5-硝基水杨醛或3,5-二硝基水杨醛作为消旋化试剂消旋化未反应的D-草铵膦，得到DL-草铵膦，继续用于拆分反应(详见图8)。但是这种方法需要昂贵的手性拆分试剂，以及多步重结晶，操作繁琐，还不是一种理想的方法。
化学合成法如US6936444公开了钌催化剂不对称氢化2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁烯酸得到L-2-乙酰氨基-4-(羟甲基氧膦基)-2-丁酸，再经脱乙酰可以得到L-草铵膦。此方法需要昂贵的金属催化剂，成本较高，以及重金属残留，对环境污染严重。
相对于手性拆分法，化学合成法，生物催化法具有专一性强，反应条件温和等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。
目前有US4389488(A)记载的用N-苯乙酰-DL-草铵膦为底物，来源于大肠杆菌的青霉素-G-酰基转移酶为催化剂，得到L-草铵膦的方法，但是苯乙酰草铵膦的合成成本比较高，且反应结束后得到L-草铵膦，N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸的混合溶液，需要采用强酸阳离子交换树脂分离出L-草铵膦，操作比较复杂。
随后，US4922013对上述方法进行了改进，将未反应的N-苯乙酰-D-草铵膦采用醋酸酐消旋化，再进一步用于制备L-草铵膦。但是此方法需要高温反应，而且反应需要蒸馏除水步骤。
EP0382113A记载了利用酰基转移酶对N-乙酰-草铵膦的羧酸酯进行催化裂解得到L-草铵膦的方法，但是此方法中的酶对游离的N-乙酰-草铵膦没有特异性，因此必须对N-乙酰-草铵膦进行酯化，增加了反应的步骤，且相应的增加了生产成本。
US5221737A和EP0344683A记载了用谷氨酸作为氨基供体，自相应酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过来源于大肠杆菌的氨基转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，反应体系中需要等量或过量的氨基供体谷氨酸，使产物难以纯化，且酮酸以及谷氨酸成本较高。
CN1284858C对上述方法进行了改进，采用天冬氨酸作为氨基供体，自相应的酮酸4-(羟甲基氧膦基)-2-氧代丁酸通过天冬氨酸转氨酶作用得到L-草铵膦的方法，此方法中天冬氨酸转变为草酰乙酸，而草酰乙酸在含水介质中不稳定，并自发的脱羧为丙酮酸，丙酮酸可通过酶促反应除去，使得逆反应不能进行，反应只需要等摩尔的氨基供体和氨基受体。但是此反应中酮酸和天冬氨酸的成本仍然很高。
CN1175108C记载了马尿酸水解酶对N-乙酰-草铵膦进行选择性脱去N-乙酰-L-草铵膦的乙酰基得到L-草铵膦的方法，但是此方法需要将产物从未脱去乙酰基的N-乙酰-D-草铵膦和不完全脱去乙酰基的N-乙酰-L-草铵膦的混合物中分离，产物纯化比较复杂。
N-乙酰氨基酸消旋酶(N-acetyl amino acid racemase)已有相关报道，其中US6767725B2公开了来源于Amycolatopsis orientalis subspecies luridad的N-乙酰氨基酸消旋酶可以催化N-氨基甲酰氨基酸的消旋化，US9464306B2公开了来源于Geobacillus和Thermus的N-乙酰氨基酸消旋酶可以催化N-琥珀酰氨基酸的消旋化，但是没有任何关于N-乙酰氨基酸消旋酶用于N-乙酰草铵膦的消旋化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的制备L-草铵膦的方法原料成本高、转化率低、采用化学异构化酰基草铵膦时需要醋酸酐高温条件反应不利于环保等缺陷，因此本发明提供一种N-乙酰-草铵膦盐的消旋方法。所述的消旋方法包括下述步骤：
在N-乙酰氨基酸消旋酶的存在下，将N-乙酰-草铵膦盐
进行消旋反应，即可；所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.Ts-1-60)和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种(Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida)。该消旋方法可被应用于L-草铵膦的制备，利用该消旋方法制备L-草铵膦成本低、操作方法简便、反应条件温和环保；转化率可达50％以上；减小了分离纯化N-乙酰草铵膦和草铵膦的工作量；另外，本发明的N-乙酰氨基消旋酶可以和脱乙酰酶“一锅法”进行原位异构化-拆分，节省了化学异构化乙酰草铵膦的步骤以及相关的蒸馏除水工作。
本发明主要是通过以下技术手段解决上述技术问题的。
本发明提供一种N-乙酰-草铵膦盐的消旋方法，其包括下述步骤：在N-乙酰氨基酸消旋酶的存在下，将N-乙酰-草铵膦盐
进行消旋反应，即可；所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.Ts-1-60)和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种(Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida)。
在所述的消旋方法中，所述的N-乙酰-草铵膦盐中与氨基相连的碳原子为手性碳原子。
在所述的消旋方法中，所述的N-乙酰-草铵膦盐可为D型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐(即其中D型对映体的含量＞50％，乃至于纯D型对映体)或L型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐(即其中L型对映体的含量＞50％，乃至于纯L型对映体)。
在所述的消旋方法中，所述的N-乙酰-草铵膦盐可由N-乙酰-草铵膦或其单盐与碱反应制得。
在所述的消旋方法中，所述的N-乙酰-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如钠离子和/或钾离子。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的消旋方法中，反应体系的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用缓冲液和碱调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液；所述的磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为20-200mM；更佳地为50mM。所述的碱较佳地为碳酸钠或者碳酸氢钠。
在所述的消旋方法中，所述消旋反应开始时所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.02-2U/mL，较佳地为0.35 -1.6U/mL，更佳地为0.8U/ml。
在所述的消旋方法中，反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。
本发明还提供一种L-草铵膦盐的制备方法，其包括下述步骤：
(1)按照上述的消旋方法，制得物质；
(2)在脱乙酰酶的存在下，将步骤(1)制得的N-乙酰-草铵膦盐外消旋体进行脱乙酰反应，得到L-草铵膦盐即可。
所述的脱乙酰酶可为本领域常规的脱乙酰酶，较佳地为马尿酸脱乙酰酶或者链霉菌(S.viridochromogenes)脱乙酰酶；所述的马尿酸脱乙酰酶较佳地来源于食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)。
本发明还提供一种L-草铵膦盐的制备方法，其包括下述步骤：在N-乙酰氨基酸消旋酶和脱乙酰酶的，存在下，将N-乙酰-草铵膦盐
进行消旋反应和脱乙酰反应，即可；所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.Ts-1-60)和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种(Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida)。
在所述的制备方法中，所述的N-乙酰-草铵膦盐中与氨基相连的碳原子为手性碳原子。
在所述的制备方法中，所述的N-乙酰-草铵膦盐可为N-乙酰-草铵膦盐外消旋体、D型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐(即其中D型对映体的含量＞50％，乃至于纯D型对映体)或L型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐(即其中L型对映体的含量＞50％，乃至于纯L型对映体)。
在所述的制备方法中，所述的N-乙酰-草铵膦盐的阳离子可为本领域常规的阳离子，例如钠离子和/或钾离子。又可为所使用的缓冲液的阳离子。
在所述的制备方法中，反应体系的pH较佳地为7-9，更佳地为8。所述的pH可通过使用缓冲液来实现。所述的pH还可通过使用缓冲液和碱调节来实现。所述的缓冲液较佳地为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液较佳地为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液；所述的磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为20-200mM；更佳地为50mM。所述的碱较佳地为碳酸钠或者碳酸氢钠。
在所述的制备方法中，反应体系的温度为20-50℃，较佳地为37℃。当不在该温度范围时，反应不能正常进行或者反应效率低。
在所述的制备方法中，在所述的消旋反应和脱乙酰反应开始之前，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度较佳地为0.02-2U/mL，更佳地为0.35-1.6U/mL，进一步更佳地为0.8U/ml。所述的酶活单位“U/mL”的测定所用底物为N-乙酰-D-蛋氨酸；所述的脱乙酰酶的终浓度较佳地为0.05-0.4U/mL，较佳地为0.2U/mL；所述的N-乙酰-草铵膦的终浓度较佳地为20-100mM，更佳地为50mM。当所述的N-乙酰氨基酸消旋酶、所述的脱乙酰酶以及所述的N-乙酰-草铵膦的用量低于上述范围内时，反应不能正常进行或者效率极低；而浓度过高，则存在成本过大的情况。
本发明还提供一种L-草铵膦的制备方法，其包括下述步骤：
(1)按照上述的制备方法，制得L-草铵膦盐；
(2)将步骤(1)制得的L-草铵膦盐进行酸化反应，得到L-草铵膦即可。
本发明还提供一种N-乙酰氨基酸消旋酶在消旋N-乙酰-草铵膦中的应用，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.Ts-1-60)和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种(Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida)。较佳地，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶为NCBI登录号4A6G或CAC00653.1对应的酶。
所述的N-乙酰-草铵膦可为N-乙酰-草铵膦盐外消旋体、D型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐(即其中D型对映体的含量＞50％，乃至于纯D型对映体)或L型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐(即其中L型对映体的含量＞50％，乃至于纯L型对映体)。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
制备L-草铵膦时利用该消旋方法能降低成本、简便操作方法、反应条件温和环保；转化率可达50％以上；减小了分离纯化N-乙酰草铵膦和草铵膦的工作量；另外，本发明的N-乙酰氨基消旋酶可以和脱乙酰酶“一锅法”进行原位异构化-拆分，节省了化学异构化乙酰草铵膦的步骤以及相关的蒸馏除水工作。
附图说明
图1为实施例5制备所得产物中D-草铵膦与L-草铵膦的Marfey试剂柱前衍生HPLC分析结果。
图2为DL-草铵膦标准品的Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱，其中最后两个峰是Marfey试剂空白样的峰。
图3为实施例5制备所得产物中底物N-乙酰草铵膦与产物草铵膦的离子对HPLC分析结果。
图4为N-乙酰草铵膦标准品的离子对HPLC图谱。
图5为外消旋草铵膦标准品的离子对HPLC图谱。
图6为自制N-乙酰草铵膦的核磁标准氢谱(HNMR)。
图7为产品L-草铵膦的核磁氢谱(HNMR)。
图8为专利申请CN1053669C中利用手性拆分法获得L-草铵膦的过程。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
pET28a购买自Novagen公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，BL21感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
产物的手性分析通过柱前衍生化高效液相色谱进行，具体的分析方法为：
(1)色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，3.5μm，150*4.6mm。流动相A：0.1％TFA+H2O，流动相B：0.1％TFA+-ACN。梯度洗脱。检测波长：340nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃。
(2)衍生化试剂：Marfey试剂。准确称取50mg的N-α-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺，用乙腈溶解配置成25ml溶液，备用。
(3)衍生反应：取反应液稀释10倍，加等量的Marfey试剂衍生。进样10μl进行分析。
底物N-乙酰草铵膦与产物草铵膦通过离子对色谱分析，具体的分析方法为：
色谱条件：Ultimate AQ-C18，5μm，4.6*250mm；流动相：0.05mol/L磷酸氢二铵PH＝3.6:10％四丁基氢氧化铵水溶液：乙腈＝91:1:8；检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃。
转化率＝(反应物-剩余反应物)/反应物×100％(反应物：N-乙酰-D-草铵膦+N-乙酰-L-草铵膦)
实施例1N-乙酰氨基酸消旋酶基因的获取
从NCBI数据库中检索到Amycolatopsis sp.Ts-1-60和Amycolatopsisorientalis subsp.lurida微生物来源的N-乙酰氨基酸消旋酶，NCBI登录号分别为4A6G或CAC00653.1，全基因合成两种N-乙酰氨基酸消旋酶基因。
表1N-乙酰氨基酸消旋酶
| 编号 | 类型 | 来源 | NCBI登录号 |
| Enz.7 | AAR-AT | Amycolatopsis sp.Ts-1-60 | 4A6G |
| Enz.8 | AAR-AO | Amycolatopsis orientalis subsp.lurida | CAC00653.1 |
实施例2N-乙酰氨基酸消旋酶基因的表达
N-乙酰氨基酸消旋酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。将构建好的菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌。
实施例3N-乙酰氨基酸消旋酶菌体的培养与粗酶液的制备及酶活的测定
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将含有N-乙酰氨基酸消旋酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mLpH8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到含重组N-乙酰氨基酸消旋酶的粗酶液。
酶活测定方法如下，总反应体系为1mL。pH7.5，100mM Tris-HCl缓冲液(底物N-乙酰-D-蛋氨酸浓度50mM)，取上述缓冲液900μL。以此再加入加5μL MgCl2(终浓度1mM)和50μL脱乙酰酶。最后添加45μL N-乙酰氨基酸消旋酶，于30℃反应。在适当的时间，加1N的HCl终止反应。通过高效液相色谱确定L-蛋氨酸的含量，并计算出酶活。
酶活定义为：1分钟内催化N-乙酰-D-蛋氨酸产生1μmol N-乙酰-L-蛋氨酸所用的酶量为1个单位(U)。
表2酶活数值
实施例4脱乙酰酶基因的获取
根据CN1171993C的方法获得食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)来源的脱乙酰酶。
实施例5N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.7和实施例4制备得到的脱乙酰酶催化N-乙酰-D-草铵膦制备L-草铵膦
定量称取0.56gN-乙酰-D-草铵膦于反应瓶中，50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用30％的NaOH溶液调节pH至8.0，加入实施例3制备的10mL N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.7和10mL实施例4制备得到的脱乙酰酶，用pH 8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使反应体系中N-乙酰-D-草铵膦浓度为50mM、N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.7为1.6U/ml、脱乙酰酶为0.4U/ml，37℃搅拌反应，用饱和碳酸钠溶液控制pH为8.0。反应时间为48h后用高效液相离子对色谱法检测L-草铵膦的生成浓度和N-乙酰草铵膦的剩余浓度，同时利用marfey试剂进行柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的ee值(Enantionmericexcesses，对映体过量)。
反应结果如下：N-乙酰草铵膦剩余15.7mM，转化率68.6％。L-草铵膦的生成浓度为33.8mM，ee值达到99％以上。
所得产物中D-草铵膦与L-草铵膦的HPLC分析结果见图1(保留时间为11.883min的为D-草铵膦，保留时间为13.603min的为L-草铵膦)；DL-草铵膦标准品(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的Marfey试剂柱前衍生HPLC图谱见图2(L-草铵膦的保留时间为13.683min，D-草铵膦的保留时间为12.016min)。可见，该实施例所制备得到的产物的成分分别与标准品中D-草铵膦与L-草铵膦的出峰时间基本一致(受仪器和环境的影响，出峰时间的差值在0.5min以内是可以接受的)。另外，对最终得到的产品进行柱纯化，重结晶得到纯的产品，经HNMR核磁及旋光度鉴定为L-草铵膦。[a]D22＝+29.7°(C＝1,1N HCl)，HNMR图谱见图7(现有技术中US4389488已有L-草铵膦旋光度的记载)。
底物N-乙酰草铵膦与制备所得产物草铵膦的HPLC分析结果见图3(保留时间为3.768min的为草胺膦，保留时间为7.302min的为N-乙酰草铵膦)。N-乙酰草铵膦标准品的离子对HPLC图谱如图4所示，其中，N-乙酰草铵膦标准品的保留时间为7.449min(其中N-乙酰草铵膦为自行制备得到，其核磁鉴定图谱见图6)，外消旋草铵膦(购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)的离子对HPLC图谱如图5所示(其中，外消旋草铵膦标准品的保留时间为3.829min)。可见，该实施例中底物N-乙酰草铵膦与产物草铵膦的出峰时间与各自标准品的出峰时间基本一致。
实施例6N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.8和实施例4制备得到的脱乙酰酶催化N-乙酰-D-草铵膦制备L-草铵膦
称取0.56gN-乙酰-D-草铵膦于反应瓶中，50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用30％的NaOH溶液调节pH至8.0，加入10mL实施例3制备得到的N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.8和10mL实施例4制备得到的脱乙酰酶，用pH 8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使反应体系中N-乙酰-D-草铵膦浓度为50mM，N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.8反应体系中为0.7U/ml，脱乙酰酶反应体系中为0.4U/ml，37℃搅拌反应，用饱和碳酸钠溶液控制pH为8.0。反应时间为48h后用高效液相色谱检测L-草铵膦的生成浓度和N-乙酰草铵膦的剩余浓度，同时利用marfey试剂进行柱前衍生化高效液相离子对色谱法检测L-草铵膦的ee值。
反应结果如下：N-乙酰草铵膦剩余20.1mM，转化率59.8％。L-草铵膦的生成浓度为29.2mM，产率为58.4％，ee值达到99％以上(对最终所得产物的纯化以及鉴定的方法和数据同实施例5)。
实施例7N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.7或Enz.8和实施例4制备得到的脱乙酰酶催化N-乙酰-DL草铵膦制备L-草铵膦
称取0.56gN-乙酰-DL-草铵膦于反应瓶中，50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液完全溶解，用30％的NaOH溶液调节pH至8.0，分别加入10mL实施例3制备所得N-乙酰氨基酸消旋酶Enz.7/Enz.8和10mL实施例4制备得到的脱乙酰酶。用pH 8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液定容至50mL，使反应体系中N-乙酰-DL-草铵膦浓度为50mM、N-乙酰氨基酸消旋酶为Enz.7时终浓度为1.6U/ml；Enz.8时终浓度为0.7U/ml、脱乙酰酶为0.4U/ml。37℃搅拌反应，用饱和碳酸钠溶液控制pH为8.0，反应时间48小时。高效液相离子对色谱法检测L-草铵膦的生成浓度和N-乙酰草铵膦的剩余浓度，同时marfey试剂进行利用柱前衍生化高效液相色谱检测L-草铵膦的ee值。
反应结果如下：
表3利用Enz.7和Enz.8进行反应后的结果
| 编号 | N-乙酰草铵膦的剩余浓度 | 转化率 | L-草铵膦的生成浓度 | L-草铵膦ee值 |
| Enz.7 | 9mM | 82％ | 40mM | 99％ |
| Enz.8 | 10mM | 80％ | 39.5mM | 99％ |
(对最终所得产物的纯化以及鉴定的方法和数据同实施例5)。
对比例
1、从NCBI数据库中检索到Deinococcus radiodurans、Thermus thermophilus、Amycolatopsis azurea等微生物来源的N-乙酰氨基酸消旋酶，genebank登录号分别为1R0M、BAD70697.1、AAL71990.1等，全基因合成这些N-乙酰氨基酸消旋酶基因。详见表4。
表4N-乙酰氨基酸消旋酶酶库
2、酶的表达、粗酶液的制备以及酶活测定
酶的表达以及粗酶液的制备方法同实施例2～3。所测得的酶活数值见表5。
表5酶活数值
分别使用表4中的N-乙酰氨基酸消旋酶和实施例4制备所得脱乙酰酶催化N-乙酰-DL草铵膦制备L-草铵膦，除N-乙酰氨基酸消旋酶，其他均与实施例8相同。
表6利用不同的酶进行反应后所得转化率
注：N.D为未检测到草铵膦。
Claims (37)
1.一种N-乙酰-草铵膦盐的消旋方法，其特征在于，其包括下述步骤：在N-乙酰氨基酸消旋酶的存在下，将N-乙酰-草铵膦盐进行消旋反应，即可；所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.Ts-1-60和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida；
所述的N-乙酰-草铵膦盐为D型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐。
2.如权利要求1所述的消旋方法，其特征在于，所述的N-乙酰-草铵膦盐由N-乙酰-草铵膦或其单盐与碱反应制得；
和/或，反应体系的温度为20-50℃；
和/或，反应体系的pH为7-9；
和/或，所述的消旋反应开始时，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.02-2U/mL。
3.如权利要求2所述的消旋方法，其特征在于，反应体系的温度为37℃；
和/或，反应体系的pH为8；
和/或，所述的消旋反应开始时，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.35-1.6U/mL。
4.如权利要求3所述的消旋方法，其特征在于，所述的pH通过使用缓冲液和/或碱调节来实现；
和/或，所述的消旋反应开始时，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.8U/ml。
5.如权利要求4所述的消旋方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
6.如权利要求5所述的消旋方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。
7.如权利要求5所述的消旋方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为20-200mM。
8.如权利要求7所述的消旋方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50mM。
9.如权利要求4所述的消旋方法，其特征在于，所述的碱为碳酸钠或者碳酸氢钠。
10.如权利要求1所述的消旋方法，其特征在于，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶为NCBI登录号4A6G或CAC00653.1对应的酶。
11.一种L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)在N-乙酰氨基酸消旋酶的存在下，将N-乙酰-草铵膦盐进行消旋反应，制得产物，即可；所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.Ts-1-60和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida；所述的N-乙酰-草铵膦盐为D型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐；
(2)在脱乙酰酶的存在下，将步骤(1)制得的产物进行脱乙酰反应，得到L-草铵膦盐即可。
12.如权利要求11所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的N-乙酰-草铵膦盐由N-乙酰-草铵膦或其单盐与碱反应制得；
和/或，反应体系的温度为20-50℃；
和/或，反应体系的pH为7-9；
和/或，所述的消旋反应开始时，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.02-2U/mL。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，反应体系的温度为37℃；
和/或，反应体系的pH为8；
和/或，所述的消旋反应开始时，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.35-1.6U/mL。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述的pH通过使用缓冲液和/或碱调节来实现；
和/或，所述的消旋反应开始时，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.8U/ml。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。
17.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为20-200mM。
18.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50mM。
19.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的碱为碳酸钠或者碳酸氢钠。
20.如权利要求11-19任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的脱乙酰酶来源于食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)。
21.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶为NCBI登录号4A6G或CAC00653.1对应的酶。
22.一种L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：在N-乙酰氨基酸消旋酶和脱乙酰酶的存在下，将N-乙酰-草铵膦盐进行消旋反应和脱乙酰反应，即可；所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.Ts-1-60和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida。
23.如权利要求22所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的N-乙酰-草铵膦盐为N-乙酰-草铵膦盐外消旋体、D型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐或L型对映体富集的N-乙酰-草铵膦盐；
和/或，反应体系的温度为20-50℃；
和/或，反应体系的pH为7-9。
24.如权利要求23所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，反应体系的温度为37℃；
和/或，反应体系的pH为8。
25.如权利要求24所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的pH通过使用缓冲液和/或碱调节来实现。
26.如权利要求25所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
27.如权利要求26所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。
28.如权利要求27所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为20-200mM。
29.如权利要求28所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50mM。
30.如权利要求29所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的碱为碳酸钠或者碳酸氢钠。
31.如权利要求22所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，在所述的消旋反应和脱乙酰反应开始之前，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.02-2U/mL；
和/或，所述的脱乙酰酶的终浓度为0.05-0.4U/mL；
和/或，所述的N-乙酰-草铵膦的终浓度为20-100mM。
32.如权利要求31所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，在所述的消旋反应和脱乙酰反应开始之前，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.35-1.6U/mL；
和/或，所述的脱乙酰酶的终浓度为0.2U/mL；
和/或，所述的N-乙酰-草铵膦的终浓度为50mM。
33.如权利要求32所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，在所述的消旋反应和脱乙酰反应开始之前，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶的终浓度为0.8U/ml。
34.如权利要求22所述的L-草铵膦盐的制备方法，其特征在于，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶为NCBI登录号4A6G或CAC00653.1对应的酶。
35.一种L-草铵膦的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)按照权利要求11～33任一项所述的制备方法，制得L-草铵膦盐；
(2)将步骤(1)制得的L-草铵膦盐进行酸化反应，得到L-草铵膦即可。
36.一种N-乙酰氨基酸消旋酶在消旋N-乙酰-草铵膦中的应用，其特征在于，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶来源于拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.Ts-1-60和/或东方拟无枝酸菌苍黄亚种Amycolatopsis orientalis subsp.Lurida。
37.如权利要求36所述的应用，其特征在于，所述的N-乙酰氨基酸消旋酶为NCBI登录号4A6G或CAC00653.1对应的酶。
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