CN103966275B - 生物法制备高纯度l-叔亮氨酸 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物合成法制备L‑叔亮氨酸的方法。该方法是将表达亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因大肠杆菌种子液接入自诱导系统发酵培养基中发酵培养，离心得到粗菌体，加入缓冲溶液得到细胞悬浮液。然后加入底物三甲基丙酮酸和甲酸铵进行生物催化反应，获得L‑叔亮氨酸转化液。转化液离心，调节溶液pH，柱层析，解析，浓缩得到高纯度L‑叔亮氨酸产品。本发明充分利用酶的高效性、专一性和温和性，与传统化学合成方法相比，具有选择性高、条件温和、工艺简单、成本低和污染小等特点。

Description

生物法制备高纯度L-叔亮氨酸

技术领域

本发明涉及生物合成法制备L-叔亮氨酸的方法。

背景技术

L-叔亮氨酸是制备是生产阿扎那韦(抗HIV药物)、波普瑞韦(Boceprevir)(抗丙肝病毒药物)、特拉匹韦(Telaprevir)(抗丙肝病毒药物)等抗病毒药物中间体，同时由于叔丁基的空间位阻大，叔亮氨酸又作为金属的手性配体应用于不对称合成。

目前L-叔亮氨酸的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成法又主要有化学合成、化学拆分和手性合成三种方法。1993年，U.Groth等以2，5-二乙基吡嗪为原料(Liebigs Ann.Chem.1993，715-719)，经叔丁基化、水解合成叔亮氨酸乙酯，收率70％。由于所用试剂三乙基氧鎓四氟硼酸盐、N-氯代琥珀酰亚胺和叔丁基锂价格昂贵，因此成本高；另外，工业化规模制备易产生有害氧化物。1994年，Clive等以特戊醛为原料(Tetrahedron Lett.1994，35：2459～2462)，首先利用Wittig反应，经过加成，取代，水解，氢化，得到消旋的叔亮氨酸，总收率仅为25％。中国专利CN200710044378报道了消旋叔亮酰胺与光学纯酸性拆分剂(如扁桃酸、对甲基二苯甲酰酒石酸等)在拆分溶剂中反应成盐析出，再经酸水解得L-叔亮氨酸。美国专利US201224537(2012年)报道了利用D-(+)-二苯甲酰酒石酸与L-叔亮氨酸具有选择性沉淀反应生成D-(+)-二苯甲酰酒石酸-L-叔亮氨酸沉淀，经过滤、水解该沉淀物即可得到L-叔亮氨酸。选择性拆分D，L-叔亮氨酸，分别得到纯度到D-和L-叔亮氨酸。1992年，Ogura等以(R)-苯甘氨醇为手性诱导剂(Bull.Chem.Soc.Jpn，1992，69，2359-2365)与特戊醛发生不对称Strecker反应，引入手性中心，不对称合成了(S)-叔亮氨酸，总收率达56％，e.e值达100％。

在生物合成法中，专利EP0141223(1985)等发现用固定在苯酚树脂上的青霉素G酰化酶(PGA)可选择性水解N-苯乙酰-(R，S)-叔亮氨酸生成(S)-叔亮氨酸。去除酶后，将溶液酸化到pH3，再浓缩除去苯乙酸和N-苯乙酰-(R)-叔亮氨酸后，用乙醇和水萃取得到(S)-叔亮氨酸，收率达96％。专利DE 9529211.1报道了利用(RS)-5-叔丁基海因为底物，经(R)-海因酶作用开环生成中间体N-氨甲酰-(R)-叔亮氨酸，最后在硝酸溶液(pH0) 作用下脱去氨甲酰，生成R-叔亮氨酸，收率达85.5％，e.e99.5％。专利US6949658报道了消旋的叔亮氨酰胺，在水为溶剂、碱性条件下，经肠道菌酶拆分得到(S)-叔亮氨酸和(R)-叔亮氨酰胺，浓缩母液，向其加入适量有机溶剂(异丙醇或DMF)，搅拌冷却，不需分离即可直接得到结晶的(S)-叔亮氨酸，可达到92％的收率。黎舒婷等利用可以产生亮氨酸脱氢酶(LeuDH)的重组大肠杆菌作为催化剂(药物生物技术，2009，16(3)：202～206)，将底物三甲基丙酮酸转化为(S)-叔亮氨酸，并且在转化体系中加入可以产生甲酸脱氢酶(NAD⁺)的重组大肠杆菌，把这两种菌混合后进行全细胞转化，通过分批加入底物的方法，最终产物(S)-叔亮氨酸浓度为42mg/mL(42g/L)，转化率为82％。专利CN1934264A公开了德国Degussa公司利用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶全细胞得到(S)-叔亮氨酸，e.e.值为99％。该工艺初始底物浓度低于500mM(约65g/L)，总浓度为1.0M(130.1g/L)，加入外部辅因子的总量少于0.0001底物当量，转化率为96％。专利CN102352387A公开了尚科生物利用固定化全细胞催化剂制备非天然氨基酸的方法，该细胞为重组细胞，重组细胞中含有甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因。产物后处理采用溶剂萃取和重结晶的方法。

本发明利用高表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌，以三甲基丙酮酸为底物，一步转化得到L-叔亮氨酸。采用自诱导系统高密度培养发酵工艺，通过连续流加底物三甲基丙酮酸方法，使底物浓度大于130g/L，转化率达到90％以上。转化液经过交换树脂柱层析和重结晶，产品纯度大于99％。该方法选择性高、纯度高、条件温和、成本低和污染小，具有重要的经济和社会效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物合成法制备高纯度L-叔亮氨酸的方法。

本发明所提供的制备L-叔亮氨酸的方法，是将大肠杆菌种子液接入发酵培养基中发酵培养，得到粗菌体，加入缓冲溶液得到菌体液。然后加入底物三甲基丙酮酸和甲酸铵进行生物催化反应，获得L-叔亮氨酸转化液。离心，调节溶液pH，柱层析，解析，浓缩得到高纯度产品。

本发明所提供的生物合成法制备高纯度L-叔亮氨酸，包括以下步骤：

(1)分别构建含有亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的大肠杆菌重组细胞。分子生物学操作方法按照文献Organic Process Research & Development，2006，10，666-669。

(2)基因工程菌发酵培养。大肠杆菌发酵一般使用IPTG诱导表达系统大量表达目的 蛋白，但是IPTG价格昂贵，且IPTG诱导蛋白表达在操作上比较繁琐，特别是过量加入抑制菌体生长，发酵过程中易出现有毒蛋白表达、质粒不稳定等问题，这些严重阻碍了规模化生产。本发明采用外源基因自诱导表达方法，在培养基中添加一定量的葡萄糖，使大肠杆菌首先以葡萄糖为碳源支持生长至饱和，葡萄糖消耗完之后，培养基中添加的乳糖开始起作用，诱导蛋白表达的同时，乳糖的代谢产物葡萄糖也可继续作为细菌生长的碳源。因为过多量的葡萄糖会抑制后期乳糖对蛋白表达的诱导作用，所以在培养基中用0.5％的甘油代替葡萄糖给细菌提供碳源和能源，再另外添加0.05％葡萄糖和0.2％乳糖。此外，100μM Fe Cl₃对菌体的高密度生长和蛋白的高量表达起到支持作用。

(3)重组细胞悬浮液的制备：发酵液离心得粗菌体，用pH6.0-7.0磷酸缓冲液洗涤和悬浮，获得细胞悬浮液。

(4)生物合成反应：将上述两种重组细胞悬浮液按比例混合，直接加入部分的底物三甲基丙酮酸-氨水反应液和甲酸铵，置于30℃水浴锅中搅拌反应24-48h。离心，获得含有L-叔亮氨酸的溶液，溶液经HPLC检测，三甲基丙酮酸的转化率达90％以上。

(5)产物的后期纯化：将上述转化溶液pH值调节至5-8，然后上样于层析柱中，依次用水溶液和氨水溶液进行洗脱，收集含产品的洗脱液。浓缩，结晶，既得产品。

其中，所述自诱导系统发酵培养基由下列重量份的物质组成：0.5-1.5％胰蛋白胨，0.1-1.0％酵母浸出物，10-50mM Na₂HPO₄，10-50mM KH₂PO₄，20-100mM NH₄Cl，1-10mM Na₂SO₄，1-10mM MgSO₄，0.1-1.0％甘油，0.01-0.1％葡萄糖，0.1-0.5％乳糖，50-120μM FeCl₃。

所述发酵培养的温度为30-42℃，优选为37-40℃；搅拌转速为120-250转/分钟，优选150-200转/分钟；pH值为6.0-7.5，优选6.5-7.0；发酵时间为12-24小时。

所述重组细胞悬浮液的制备方法为：发酵液离心得粗菌体，用pH6.0-7.0磷酸缓冲液洗涤和悬浮，获得细胞悬浮液。。

所述细胞悬浮液中菌体的质量百分含量为1％-20％，优选为15％。

所述底物中，三甲基丙酮酸初始加入浓度为60-80g/L，甲酸铵加入终浓度为100-130g/L。剩余的三甲基丙酮酸在反应时间内连续流加完毕。

所述生物合成反应条件是，反应温度25-35℃，pH值为8.5-9.5，反应时间24-48h，离心，获得含有L-叔亮氨酸的溶液，溶液经HPLC检测，三甲基丙酮酸的转化率达90％以上。

所述调节溶液pH是将pH值用稀盐酸调节至5-8，然后上样于所述层析柱中，依次用 水溶液和氨水溶液进行洗脱，收集含产品的洗脱液。浓缩，结晶，既得产品。

所述层析柱中的介质为离子交换树脂。所述离子交换树脂优选为强酸性阳离子型树脂。

本发明是生物合成法制备L-叔亮氨酸，充分利用酶的高效性、专一性和温和性，与传统化学合成方法相比，具有选择性高、条件温和、工艺简单、成本低和污染小等特点。

本发明的生物转化法制备L-叔亮氨酸，所用菌株为高表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的重组菌，采用自诱导系统发酵，通过离子交换树脂分离纯化，产物纯度可达到99％以上；本发明的生物转化法制备L-叔亮氨酸，产量可达130g/L以上，三甲基丙酮酸转化率可达90％以上。

附图说明

图1为含有亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET-LeuDH图谱

图2为含有甲酸脱氢酶基因的重组质粒pET-fdh图谱

具体实施方式

实施例1、含有亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的两种重组菌的构建

从蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)分别提取基因组DNA，通过PCR方法分别获得fdh(甲酸脱氢酶)目的基因片段，LeuDH(亮氨酸脱氢酶)目的基因片段；然后，通过质粒pETDuet-1表达fdh目的基因和LeuDH目的基因。详细的操作方法见Organic Process Research & Development，2006，10，666-669。

实施例2、基因工程菌自诱导发酵培养(两种重组菌培养方法相同)。将100μl的基因工程菌种子液接入含100μg/ml卡那霉素的10ml LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养。取400μl处于对数生长期的菌液接入含100μg/ml卡那霉素的40ml下述培养基中，在37℃，200rpm，培养12h。培养基组成为：1％胰蛋白胨，0.3％酵母浸出物，25mMNa₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄Cl，5mM Na₂SO₄，2mM MgSO₄，1.0％甘油，0.05％葡萄糖，0.25％乳糖，100μM FeCl₃。

实施例3、重组细胞悬浮液的制备：发酵液离心(10000g，5分钟，4℃)得粗菌体，用pH6.0-7.0磷酸缓冲液洗涤和悬浮，用于下述实验或储存于-20℃待用。

实施例4、制备L-叔亮氨酸：将上述两种重组细胞悬浮液按1∶2(表达亮氨酸脱氢酶基因重组菌：表达甲酸脱氢酶基因重组菌)比例混合，菌体加入至50mMpH9.0磷酸缓冲 液中，菌体加入终浓度为120g/L.然后加入浓度为0.05g/L的NAD⁺，再加入底物三甲基丙酮酸-氨水溶液(140g三甲基丙酮酸用10％氨水调pH至9.0)和110g甲酸铵，置于30℃水浴锅中搅拌反应24h。反应液经HPLC检测，三甲基丙酮酸的转化率达42％，每升发酵液中含有L-叔亮氨酸58.8g/L。

实施例5、连续流加底物制备L-叔亮氨酸：将上述两种重组细胞悬浮液按1∶2(表达亮氨酸脱氢酶基因重组菌：表达甲酸脱氢酶基因重组菌)比例混合，菌体加入至50mMpH9.0磷酸缓冲液中，菌体加入终浓度为120g/L.然后加入浓度为0.05g/L的NAD⁺，再加入底物三甲基丙酮酸-氨水溶液(60g三甲基丙酮酸用10％氨水调pH至9.0)和110g甲酸铵，置于30℃水浴锅中搅拌反应10h。然后用恒流泵连续流加剩余的三甲基丙酮酸-氨水溶液(80g三甲基丙酮酸用10％氨水调pH至9.0)，继续反应14h，反应液经HPLC检测，三甲基丙酮酸的转化率达96％，每升发酵液中含有L-叔亮氨酸134.4g/L。

实施例6、L-叔亮氨酸的分离纯化

发酵液用1NHCl调节pH到中性，高速离心机离心20分钟得上清液，上清液过732阳离子交换树脂，用去离子水水洗到流出液为近无色，然后用0.8mol/L氨水从树脂上解吸L-叔亮氨酸，HPLC检测，收集L-叔亮氨酸含量在50％以上的解吸液，然后浓缩，低温重结晶得L-叔亮氨酸，收率为87％，纯度为99.2％。

Claims (1)

1.一种生物合成制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于：将表达亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因大肠杆菌种子液接入自诱导系统发酵培养基中发酵培养，离心得到粗菌体，加入缓冲溶液得到细胞悬浮液，然后加入底物三甲基丙酮酸和甲酸铵进行生物催化反应，获得L-叔亮氨酸转化液，转化液离心，调节溶液pH，柱层析，解析，浓缩得到高纯度产品；

其中，所述自诱导系统发酵培养基由下列重量份的物质组成：0.5-1.5％胰蛋白胨，0.1-1.0％酵母浸出物，10-50mM Na₂HPO₄，10-50mM KH₂PO₄，20-100mM NH₄Cl，1-10mM Na₂SO₄，1-10mM MgSO₄，0.1-1.0％甘油，0.01-0.1％葡萄糖，0.1-0.5％乳糖，50-120μM FeCl₃；

其中，所述发酵培养的温度为30-42℃，搅拌转速为120-250转/分钟，pH值为6.0-7.5，发酵时间为12-24小时；

其中，所述细胞悬浮液的制备方法为：发酵液离心得粗菌体，用pH6.0-7.0磷酸缓冲液洗涤和悬浮，获得细胞悬浮液；

其中，所述细胞悬浮液中菌体的质量百分含量为1％-20％；

其中，所述底物中，三甲基丙酮酸终浓度为160g/L，初始加入浓度为60-80g/L，剩余的三甲基丙酮酸在反应时间内连续流加完毕，甲酸铵加入浓度为100-130g/L；

其中，所述生物催化反应条件是，反应温度25-35℃，pH值为8.5-9.5，反应时间12-24h；

其中，所述调节溶液pH是将pH值用稀盐酸调节至5-8，然后上样于层析柱中，依次用水溶液和氨水溶液进行洗脱，收集含产品的洗脱液，浓缩，结晶，即得产品；

其中，所述层析柱中的介质为强酸性阳离子型树脂。