DE102004014280A1

DE102004014280A1 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren mittels eines Ganzzellkatalysators

Info

Publication number: DE102004014280A1
Application number: DE102004014280A
Authority: DE
Inventors: Harald Dr. Gröger; Helge Werner; Josef Dr. Altenbuchner; Anne Menzel; Werner Prof. Dr. Hummel
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2004-03-22
Filing date: 2004-03-22
Publication date: 2005-10-27
Also published as: US8105806B2; CA2559186A1; CN1934264A; JP2007529234A; CA2559186C; WO2005093081A1; DE602005024776D1; ATE488597T1; EP1727908A1; US20090087885A1; CN1934264B; EP1727908B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von insbesondere enantiomerenangereicherten L-alpha-Aminosäuren, insbesondere solche der allgemeinen Formel (I). DOLLAR F1 Das erfindungsgemäße Verfahren geht dabei von 2-Ketocarbonsäuren aus, die durch einen Ganzzellkatalysator, aufweisend eine Aminosäuredehydrogenase und ein Cofaktor-regenerierendes Enzym, zu den gewünschten Produkten umgesetzt werden.

Description

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver L-α-Aminosäuren. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
worin R für Alkyl, insbesondere eine raumerfüllende, verzweigte, ein tertiäres C-Atom aufweisende Alkylgruppe mit 5-10 C-Atomen, beispielsweise tert-Butyl, und substituierte Alkyl steht, bzw. daraus abgeleiteter Salze.

Optisch aktive L-α-Aminosäuren werden zur Herstellung einer Reihe wertvoller Verbindungen eingesetzt. Beispielsweise fungieren diese Verbindungen als Intermediate bei der Herstellung von Pharmazeutika. Einen besonders wertvollen Vertreter dieser Produktklasse stellt L-tert-Leucin dar, das als Strukturelement in einer Reihe von Pharmawirkstoffen zu finden ist und demzufolge als Intermediat für die Synthese der entsprechenden Pharmawirkstoffe benötigt wird. Beispiele für Anwendungen von L-tert-Leucin als Baustein für Pharmawirkstoffe sind in A. S. Bommarius et al. (J. Mol. Cat. B: Enzymatic 1998, 5, 1-11) gegeben.

Die enzymatische Reduktion von 2-Ketocarbonsäuren mittels einer Leucindehydrogenase und einer Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii unter in situ-Cofaktorregenerierung stellt eine technisch etablierte Methode zur Herstellung optisch aktiver L-α-Aminosäuren dar. Insbesondere eignet sich dieser Weg zur Herstellung der nichtproteinogenen Aminosäure L-tert-Leucin, die im Tonnenmaßstab mit dieser biokatalytischen Methode produziert wird. Das Verfahren ist eingehend in der Literatur beschrieben ( EP 0692538 ; U. Kragl, D. Vasic-Racki, C. Wandrey, Bioprocess Engineering 1996, 14, 291-297; A. S. Bommarius, M. Schwarm, K. Drauz, J. Mol. Cat. B: Enzymatic 1998, 5, 1-11; G. Krix, A. S: Bommarius, K. Kottenhahn, M. Schwarm, M.-R. Kula, J. Biotechnol. 1997, 53, 29-39, A. Liese, C. Wandrey, A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 2000, S. 125f. und A. S. Bommarius, K. Drauz, W. Hummel, M.-R. Kula, C. Wandrey, Biocatalysis 1994, 10, 37-47. Eine allgemeine Übersicht ist zudem in A. S. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Hrsg.: K. Drauz, H. Waldmann), Band 2, 2. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2003, Kapitel 15.3, S. 1047f. gegeben).

Schema 1. Herstellung von L-tert-Leucin mit isolierten Enzymen und zugesetztem Cofaktor (am Beispiel einer NAD⁺-abhängigen Aminosäuredehydrogenase und einer Formiatdehydrogenase zur Cofaktorregenerierung)

Typische verwendete NAD⁺-Cofaktormengen, die zugesetzt werden müssen, sind beispielsweise in EP 0692538 beschrieben und liegen im Bereich von 0.0008 Äquivalenten bis 0.02 Äquivalenten. Zudem beschreiben G. Krix et al. (J. Biotechnol. 1997, 53, 29-39) die Herstellung von (S)- Neopentylglycin in technischen Ansatzgrößen unter Einsatz einer NAD⁺-Cofaktormenge von 0.003 Äquivalenten. Typische Substratkonzentrationen in EP 0692538 liegen bei 100 – 250 mM. In A. Liese et al. (Industrial Biotransformations, Wiley-VCH, Weinheim, 2000, S. 125f.) ist die Herstellung von L-tert-Leucin mit einer Substratkonzentration von 0.5M und einer Ausbeute von 74% beschrieben. Die Durchführung von reduktiven Aminierungen mit isolierten Leucindehydrogenase und Formiatdehydrogenase-Enzymen bei Substratkonzentrationen von 0.5 bis 1M ist ebenfalls in G. Krix et al. (J. Biotechnol. 1997, 53, 29-39) beschrieben.

Vorteilhaft bei diesem Verfahren sind die hohen Umsätze und hervorragenden Enantioselektivitäten, die bei >99% ee liegen und somit die strengen Qualitätsanforderungen an Pharmaintermediate erfüllen helfen. Auch kann bei hohen Substratkonzentrationen gearbeitet werden, was gerade aus technischer Sicht ein bedeutender Aspekt ist.

Nachteilig beim bisherigen Verfahren ist allerdings zum einen der Bedarf an isolierten Enzymen. Diese werden insbesondere in gereinigter Form eingesetzt, einhergehend mit einer Erhöhung des Biokatalysatorkostenanteils. Aufgrund der daraus resultierenden hohen Enzymkosten ist ein vielfaches Recycling der Enzyme notwendig, um eine günstige Prozessökonomie, insbesondere niedrige Enzymkosten, zu erhalten. Neben den langen Laufzeiten solcher Recyclingverfahren, die vorteilhaft in kontinuierlicher Form durchgeführt werden, sind auch die daraus resultierenden relativ kleinen Reaktionsvolumina pro Ansatz nachteilig.

Ein weiterer Nachteil ist der Bedarf an Cofaktor, der bei der Reaktion zugesetzt wird. Solche Cofaktoren werden zwar nur katalytisch eingesetzt in Größenordungen von ca. 0.001 Äquivalenten, stellen trotzdem aber aufgrund ihres hohen Preises selbst bei katalytischen Mengen einen erheblichen Kostenfaktor dar.

Wünschenswert wäre deshalb ein Verfahren, bei dem die Notwendigkeit des Einsatzes von isolierten Enzymen sowie des Zusatzes an Cofaktor entfällt bzw. der Zusatz an Cofaktor minimiert ist und die Synthese nichtsdestotrotz mit hoher Umsatzrate, hoher Enantioselektivität und hoher volumetrischer Produktivität verläuft. Auf diesem Wege könnten die Enzymkosten in nennenswerter Weise gesenkt, Cofaktorkosten eingespart und somit die Prozessökonomie gesteigert werden.

Soda et al. beschreiben die Verwendung eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Leucindehydrogenase und eine bakterielle Formiatdehydrogenase, in der reduktiven Aminierung von unter anderem verzweigtkettige α-Ketocarbonsäuren wie L-tert-Leucin (Appl. Environm. Microbiology 1997, 63, 4651-4656.). Es wird explizit in dieser Veröffentlichung darauf hingewiesen, dass die bei der reduktiven Aminierung benötigten Enzyme in Form eines diese Enzyme aufweisenden Ganzzellkatalysators, insbesondere E. coli, als lebende oder "resting cells" eingesetzt werden können. Sofern man jedoch den intrazellularen Pool in E. coli an NAD⁺ zwecks Vermeidung dessen Zugabe sich zunutze machen möchte, ist man auf eine finale Konzentration an Produkt von etwa 0,3M beschränkt. Dies ist für technische Anwendungen nicht ausreichend genug.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Angabe eines weiteren enzymatisch arbeitenden Verfahrens zur Herstellung von L-α-Aminosäuren, welches vorteilhafterweise in technischem Maßstab durchgeführt werden kann. Es sollte insbesondere in den eben geschilderten Aspekten den Verfahren des Standes der Technik überlegen sein und es erlauben, die gewünschten Produkte unter prozessökonomischen Gesichtspunkten (insbesondere Raumzeitausbeute) vorteilhaft herzustellen.

Diese und weitere nicht näher spezifizierte sich jedoch aus dem Stand der Technik in naheliegender Weise ergebende Aufgaben werden durch ein verfahren mit den Merkmalen des vorliegenden Anspruchs 1 gelöst. Ansprüche 2 bis 9 sind auf bevorzugte Ausführungsformen des gegenständlichen Verfahrens gerichtet.

Dadurch, dass man in einem Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten L-α-Aminosäuren oder deren Salzen durch Umsetzen der entsprechenden 2-Ketocarbonsäure mit einem Ammoniumionen-Donor in Gegenwart eines Ganzzellkatalysators aufweisend ein kloniertes Gen kodierend für eine Cofaktor-abhängige Aminosäuredehydrogenase und ein kloniertes Gen kodierend für ein den Cofaktor regenerierendes Enzym bei einer Gesamteinsatzmenge an Substrat pro Reaktionsvolumen von ≥ 500 mM die Zugabe des Substrats so dosiert, dass die stationäre Konzentration an 2-Ketocarbonsäure unter 500 mM liegt und die externe Zugabe an Cofaktor bezogen auf die Gesamteinsatzmenge an Substrat < 0,0001 Äquivalenten entspricht, gelangt man in äußerst eleganter und überraschender dafür aber nicht minder vorteilhafter Art und Weise zur Lösung der gestellten Aufgabe.

Überraschenderweise gelingt es beispielsweise durch den Einsatz des Ganzzellkatalysators bei gleichzeitiger Dosierung des Substrats auf einen Zusatz des teuren Cofaktors zu verzichten bzw. durch minimale externe Zugabe (<0.0001 Äquivalenten) dessen Konzentrationen in einem geringen Bereich zu halten, was Prozesseinsatzkosten sparen hilft. Im Gegensatz dazu gelingt ohne diese Dosiertechnologie bei Vorlage von Substratmengen pro Reaktionsvolumina von >500 mM die reduktive Aminierung mit dem Ganzzellkatalysator nur, wenn größere Mengen des Cofaktors NAD+ zugesetzt werden. In dessen Abwesenheit verläuft die Konzentration nur unbefriedigend (siehe Vergleichsbeispiel „Synthesebeispiel 1" Anfangssubstratmenge pro Reaktionsvolumina 900 mM – Endumsatz 25%). Erst durch das erfindungsgemäße Verfahren (siehe Synthesebeispiel 2 bis 4) gelingt es somit, auf den externen Zusatz des Cofaktors auch bei der Durchführung der Synthese mit höheren Gesamtumsatzmengen pro Reaktionsvolumina und damit bei prozessökonomisch sinnvollen Bedingungen fast vollständig verzichten zu können.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird demnach der teure Cofaktor nur in solchen Mengen zugegeben, dass eine Konzentration von vorzugsweise <0,00005 Äquivalenten, äußerst bevorzugt <0,00001 Äquivalenten bezogen auf das Substrat eingehalten wird. Ganz besonders bevorzugt ist ein Ausführungsform bei der man keinen Cofaktor extern zur Reaktionsmischung hinzufügt. Hier kann also der Zusatz der Cofaktoren (z.B. NAD(H)) zur Gänze unterbleiben, was so aus dem Stand der Technik in naheliegender Weise nicht herleitbar war.

Der Fachmann ist im Rahmen der ins Auge gefassten Reaktion frei in der Wahl der Gene kodierend für eine Cofaktorabhängige Aminosäuredehydrogenase und für ein den Cofaktor regenerierendes Enzyms, die durch den Ganzzellkatalysator als Wirtsorganismus exprimiert werden sollen. Er wird sich an Enzymen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, orientieren.

In Bezug auf die Aminosäuredehydrogenase kommen insbesondere Enzyme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Leucindehydrogenasen ( US 5854035 ) und Phenylalanindehydrogenasen ( US 5416019 ) in Frage. Als Aminosäuredehydrogenasen haben sich insbesondere die Leucindehydrogenasen als geeignet erwiesen, wobei die Leucindehydrogenasen aus Bacillus-Stämmen und hier insbesondere aus Bacillus sphaericus, Bacillus cereus (Seq. ID No. 5) und Bacillus stearothermophilus im besonderen Maße geeignet sind.

Als den Cofaktor regenerierendes Enzym können solche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Formiatdehydrogenasen ( EP 1295937 ), Malatdehydrogenasen (PCT/EP/03/08631), Lactatdehydrogenasen, Glucosedehydrogenasen (letztere in A. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Hrsg.: K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Kapitel 15.3) ins Auge gefasst werden. Als ganz besonders bevorzugt hat sich die Verwendung einer Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii bzw. daraus resultierender Mutanten ( EP 1295937 ; Seq. ID No. 7) unter Einsatz einer Formiathaltigen Komponente als Substrat erwiesen.

In besonderer Weise ist dabei ein Ganzzellkatalysator, der eine Leucindehydrogenase sowie eine Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii oder daraus abgeleitete Mutanten enthält, geeignet.

Je nach eingesetzter Aminosäuredehydrogenase ist das Substratsspektrum, welches durch den Ganzzellkatalysator umgesetzt wird, unterschiedlich. Während die Leucindehydrogenase mehr für lineare und verzweigte aliphatisch substituierte 2-Ketocarbonsäuren in Frage kommt, wird die Phenylalanindehydrogenase bevorzugt auf aromatische substituierte Substrate angewandt. Im Hinblick auf den Einsatz von Leucindehydrogenase im Ganzzellkatalysator können bevorzugt Substrate der allgemeinen Formel (II) mit aliphatischem Rest R

eingesetzt und umgesetzt werden. Insbesondere kommen solche in Frage, die sperrige aliphatische Reste als R aufweisen. Es sind dies vorrangig solche Reste R ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1-Adamantyl, Neopentyl und tert-Butyl. Daher ist ein Verfahren bevorzugt, bei dem man 2-Ketocarbonsäuren oder daraus resultierende Salze einsetzt, die Aminosäuren der allgemeinen Formel (I)

worin R für Alkyl, insbesondere eine raumerfüllende, verzweigte, ein tertiäres C-Atom aufweisende Alkylgruppe mit 5-10 C-Atomen, beispielsweise tert-Butyl, und substituierte Alkyl steht, liefern.

Prinzipiell ist der Fachmann frei in der Art und Weise, wie er den erfindungsgemäßen Prozess durchführt. Er wird sich dabei an Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, orientieren. Diese Verfahren können kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Natur sein. Vorteilhaft ist die dosierte Zugabe des Substrats nach einem so genannten Fedbatch-Prozess [siehe beispielsweise Synthesebeispiel 2 und 4] oder durch kontinuierliche Zugabe [siehe beispielsweise Synthesebeispiel 3]. Bei beiden Verfahrensvarianten erfolgt die Substratzugabe so, dass die stationäre Konzentration an Substrat unter 500 mM liegt.

Als vorteilhaft hat sich herausgestellt, wenn man die als Substrat eingesetzte 2-Ketocarbonsäure in einer maximalen stationären Konzentration von unter 450 mM und ganz besonders bevorzugt von unter 400 mM während der Reaktion einsetzt.

Beim Fedbatch-Verfahren erfolgt die Zugabe von Substrat, vorzugsweise als Substratlösung, portionsweise nach bestimmten Zeiteinheiten. Die Anzahl der zugegebenen Substratportionen liegt vorzugsweise zwischen 3 und 15, ganz bevorzugt zwischen 5 und 9. Die Konzentration der zugegebenen Substratlösung ist vorzugsweise so hoch einzustellen, dass eine möglichst hohe Gesamteinsatzmenge an Substrat pro Reaktionsvolumen erzielt wird. Beispiele für diese Verfahrensvariante des Fedbacth-Prozesses geben das Synthesebeispiel 2 und 4. Bei der kontinuierlichen Verfahrensvariante erfolgt die Substratzugabe kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum, vorzugsweise mit einer konstanten Dosiergeschwindigkeit, wobei das Substrat vorzugsweise in Form einer Substratlösung zugegeben wird. Ein Beispiel für diese kontinuierliche Verfahrensvariante gibt Synthesebeispiel 3.

Für den Ganzzellkatalysator, enthaltend eine Aminosäuredehydrogenase und ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym, eignen sich sämtliche bekannte Zellen. Als Mikroorganismen sind diesbezüglich Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen oder Pflanzenzellen zu nennen. Die Verfahren zur Klonierung sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP10-, HB101, BL21 codon plus, BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21 (DE3), MM294. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (s.a. PCT/EP03/07148; s.u.).

Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Plasmide, mit denen die die ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen aufweisenden Genkonstrukte in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden können, sind oder basieren auf: pUC18/19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen).

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Ganzzellkatalysator vorzugsweise vor dessen Einsatz so vorbehandelt, dass die Permeabilität der Zellmembran für die Substrate und Produkte gegenüber dem intakten System gesteigert ist. Besonders bevorzugt ist dabei ein Verfahren, bei dem der Ganzzellkatalysator beispielsweise durch Einfrieren und/oder Behandlung mit Toluol vorbehandelt wird. Die Grundzüge des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in Schema 2 dargestellt.

Es lassen sich mit dem gegenständlichen Verfahren wie im Stand der Technik für den Einsatz der einzelnen Enzyme auch beschrieben die Substrate in außerordentlich hoher Konzentration einsetzen. Vorteilhaft ist hier der Einsatz der 2-Ketocarbonsäure in einer Konzentration von größer 500 mM. Weiter bevorzugt lässt sich das Substrat in Konzentrationen von größer 800 mM, bevorzugt größer 900 mM und ganz besonders bevorzugt von größer 1000 mM in die Reaktion einsetzen. Bei dieser Ausführungsform ist jedoch der Zusatz von Cofaktor zur Redaktionsmischung essenziell, um entsprechende Umsatzraten zu erreichen.

Will man allerdings trotz geforderter hoher Raumzeitausbeute den Ganzzellkatalysator dergestalt einsetzen, dass kein externer Zusatz oder ein äußerst geringer externer Zusatz von unter 0,0001 Äquivalenten des teuren Cofaktors notwendig wird, so kann der Fachmann dies überraschenderweise mit der erfindungsgemäßen Dosierung des Substrats erreichen.

Bei der gegenständlichen Reaktion geht man bevorzugt so vor, dass man den Ganzzellkatalysator und den Ammoniumionen-Donor in Wasser vorlegt. Als Ammoniumionen-Donor kann jede dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommende Verbindung eingesetzt werden. Insbesondere sind dies Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus typischen Ammoniumsalzen. Ganz besonders bevorzugt kommt Ammoniumformiat zum Einsatz, wenn eine Formiatdehydrogenase als Cofaktor-Regenerierungssystem gewählt wird. Die Reaktion lässt sich an folgendem Schema 2 sehr anschaulich darstellen.

Schema 2. Reaktionsprinzip des erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysatorverfahren (am Beispiel einer NAD+-abhängigen Aminosäuredehydrogenase und einer Formiatdehydrogenase zur Cofaktorregenerierung)

Werden statt der Leucindehydrogenase andere Dehydrogenasen eingesetzt, so können die Bedingungen unter denen das betreffende Enzym optimal funktioniert dem Stand der Technik entnommen werden. Im Hinblick auf den Einsatz einer Phenylalanindehydrogenase wird auf die US 5416019 und Galkin et al. (Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 4651) verwiesen.

Auf der Seite der Cofaktor-regenerierenden Enzyme und die einzustellenden Bedingungen kann auf die EP 1295937 (Formiatdehydrogenase), PCT/EP/03/08631 (Malatdehydrogenase) und auf Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Hrsg.: K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002 (Glucosedehydrogenase) und dort zitierte Literatur verwiesen werden.

Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren. Im Batch-Prozess kann die Biomasse durch Filtration oder Zentrifugation leicht vom Produkt abgetrennt werden. Die erhaltene Aminosäure kann dann nach gängigen Verfahren isoliert werden (Ionenaustauschchromatografie, Kristallisation).

Das gegenständliche Verfahren kann jedoch auch kontinuierlich durchgeführt werden. Dazu wird die Reaktion in einem so genannten Enzym-Membran-Reaktor durchgeführt, in dem hochmolekulare Stoffe – die Biomasse – hinter einer Ultrafiltrationmembran zurückgehalten werden und niedermolekulare Stoffe – wie die produzierten Aminosäuren – die Membran passieren können. Eine derartige Verfahrensweise wurde im Stand der Technik schon mehrfach beschrieben (Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI, S. 151ff; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684).

Das hier vorgestellte Verfahren zur Herstellung von insbesondere sperrigen Aminosäuren kann auf Grund seiner Vorteile sehr gut im kommerziellen Maßstab etabliert werden. Die überraschende Tatsache, dass der bei der ins Auge gefassten Reaktion notwendige Zusatz eines Cofaktors im erfindungsgemäßen Verfahren unterbleiben kann, sowie die Vorteile aus der leichten Handhabbarkeit der Ganzzellkatalysatoren machen die nicht naheliegende Überlegenheit der vorliegenden Erfindung gegenüber den Verfahren des Standes der Technik aus.

Des weiteren kann als Überraschung gelten, dass der Einfluss unerwünschter stoffwechselphysiologischer Funktionen bei Einsatz des Ganzzellkatalysators keine Rolle spielt. Beides hilft in außerordentlich umfassender Art und Weise die Prozesskosten zur Herstellung der L-α-Aminosäuren zu senken.

Überraschend ist weiterhin, dass trotz Permeabilisierung der Zellwand und der damit verbundenen Möglichkeit eines Austretens des in den Zellen befindlichen Cofaktors eine zu erwartende negative Beeinträchtigung der Reaktion, beispielsweise durch Verminderung des Umsatzes, nicht beobachtet wird.

Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten, enantiomerenreinen) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in >50 mol-% verstanden.

Unter einem Ganzzellkatalysator wird ein Mikroorganismus verstanden, der klonierte Gene enthält, die für Enzyme kodieren, welche mindestens zwei konsekutive Transformationsschritte für eine organisch-chemische Verbindung katalysieren können. Diesbezüglich und im Hinblick auf die allgemeinen Herstellungsverfahren (Abstimmung der Enzymexpression im Hinblick auf die Umsetzungsraten) wird auf die EP 1216304 verwiesen.

Unter Alkyl wird erfindungsgemäß ein (C₁-C₁₈)-Alkyl-Rest verstanden. Dieser umfasst lineare und beliebig verzweigte derartige Reste. Insbesondere sind mitumfasst Methyl-, Ethyl-, 1-Propyl-, 2-Propyl-, 1-n-Butyl-, 2-n-Butyl, 1- oder 2- Isobutyl, 1- oder 2- sec-Butyl-, tert-Butyl-, etc. Die Reste können einfach oder mehrfach mit (C₁-C₈)- Heteroalkylresten oder Resten wie OH, SH, Hal, NH₂ substituiert sein. Unter Heteroalkylresten wird insbesondere verstanden ein wie oben dargestellter Alkyl-Rest mit ein bis acht C-Atomen, der Heteroatome wie O, S, N in seiner Kette enthält, oder über diese Heteroatome an das ins Auge gefasste Molekül gebunden ist.

Unter externer Zusatz an Cofaktor ist gemeint, dass diese Menge an Cofaktor künstlich zur Reaktionsmischung hinzugegeben wird. Sie ist additiv zu der Menge an Cofaktor zu sehen, die schon inhärent durch den Ganzzellkatalysator in Reaktionsmischung eingetragen wird.

Es versteht sich von selbst, dass die zur Reaktion eingesetzte 2-Ketocarbonsäure in der Reaktionsmischung in dissoziierter Form vorliegt. Diese Form kann erhalten werden entweder durch Einsatz der Ketocarbonsäure und einstellen eines entsprechenden pH-Wertes oder durch Zugabe der Salze der Ketocarbonsäuren. Beide Formen sind sinngemäß und erfindungsgemäß hier mitumfasst.

Der Terminus Gesamtsubstratkonzentration steht für die Gesamteinsatzmenge an Substrat pro Reaktionsvolumen.

Abbildungen:

1 – pAM3.25 (Seq. ID No. 9):

Konstruktion von pJOE4580.2

Das Plasmid pJOE4580.2 entstand aus dem publizierten Plasmid pJOE3075 (T.Stumpp, B.Wilms und J. Altenbuchner (2000) Biospektrum 1/2000: 33-36) indem das malE Gen durch Schneiden mit den Restriktionsendonuclease NdeI/HindIII entfernt wurde und durch zwei Oligonucleotide ersetzt wurden, die die NdeI und HindIII Schnittstellen wieder komplementierten und dazu noch eine NheI, AatII und PstI Schnittstelle trugen. In die NheI Schnittstelle wurde nach Auffüllen mit Klenow Polymerase und dNTPs ein SmaI Fragment eingefügt aus dem Plasmid pJOE773 (J. Altenbuchner, P. Viell, I. Pelletier (1992) Positive selection vectors based on palindromic DNA sequences. Methods Enzymol 216: 457-466.), das das lacZalpha Gen aus E. coli trägt. E. coli JM109 mit diesem Plasmid zeigt auf LB-platten mit X-Gal und IPTG blaue Kolonnien. Dieses Plasmid wurde pJOE4580.2 genannt. In dieses wurde die FDH-Sequenz (Seq. ID No. 7) kloniert. Es wurde pAM3.25 genannt.

2 – pAM5.22

Konstruktion von pJOE4580.2

Das Plasmid pJOE4580.2 entstand aus dem publizierten Plasmid pJOE3075 (T.Stumpp, B.Wilms und J. Altenbuchner (2000) Biospektrum 1/2000: 33-36) indem das malE Gen durch Schneiden mit den Restriktionsendonuclease NdeI/HindIII entfernt wurde und durch zwei Oligonucleotide ersetzt wurden, die die NdeI und HindIII Schnittstellen wieder komplementierten und dazu noch eine NheI, AatII und PstI Schnittstelle trugen. In die NheI Schnittstelle wurde nach Auffüllen mit Klenow Polymerase und dNTPS ein SmaI Fragment eingefügt aus dem Plasmid pJOE773 (J. Altenbuchner, P. Viell, I. Pelletier (1992) Positive selection vectors based on palindromic DNA sequences. Methods Enzymol 216. 457-466.), das das lacZalpha Gen aus E. coli trägt. E. coli JM109 mit diesem Plasmid zeigt auf LB-platten mit X-Gal und IPTG blaue Kolonnien. Dieses Plasmid wurde pJOE4580.2 genannt. In dieses wurde die LeuDH-Sequenz (Seq. ID No 5) insertiert. Das neue Plasmid heißt pAM5.22.

3 – pAM8.21

Konstruktion von pHWG640.12 (Seq. ID No. 11)

Das Plasmid pHWG640.12 ist bisher nicht publiziert, so dass die Konstruktion nachfolgend beschrieben wird. Die Konstruktion dieses Plasmids pHWG640.12 erfolgt ausgehend vom publizierten Plasmid pAW229 in leicht nachvollziehbarer Weise. Das Plasmid pAW229 ist ein pACYC184 Derivat mit Rhamnosepromotor. Ausgehend von pAW229 (B. Wilms, A. Wiese, C. Syldatk, R. Mattes, J. Altenbuchner (2001) J. Biotechnol 86:19-30) wurde das hyuC-Gen mit NdeI/HindIII aus dem Plasmid ausgeschnitten und durch ein PCR Fragment ersetzt, das mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten war und das das sfcA Gen (malic enzyme) von E. coli K12 enthält. Das so entstandene Plasmid wurde als pHWG640.12 bezeichnet. In dieses wurde die LeuDH-Sequenz insertiert. Das neue Plasmid heißt pAM8.21.

4 – pAM10.1 (Seq. ID No. 10)

Im Plasmid pAM8.21 wurde das scfA-Gen (Seq. ID No 11) deletiert. Das neue Plasmid heißt pAM10.1

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Biokatalysators mit Darstellung des Verlaufs der spezifischen Aktivität an Leucindehydrogenase (LeuDH) und Formiatdehydrogenase (FDH) sowie der optischen Dichte in Abhängigkeit von der Induktionszeit; Zur Beschriebung der Fermentationsbedingungen im Detail, siehe Experimenteller Teil.

Experimentelle Beispiele
Herstellung des Ganzzellkatalysators
Genamplifikation und Klonierung
Zur Klonierung der Formiatdehydrogenase (FDH, fdh3 aus Candida boidinii, Mutante mit geringerer Oxidationsempfindlichkeit) und Leucindehydrogenase (LeuDH aus Bacillus cereus) für die Ganzzellkatalyse der Umsetzung von Trimethylpyruvat zu tert-Leucin mit Cofaktorregenerierung wurden die Gene beider Enzyme zunächst mit PCR aus chromosomaler DNA der oben genannten Stämme amplifiziert. Die verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 aufgelistet, die Zusammensetzung der PCR-Ansätze in Tabelle 2 und das PCR-Programm in Tabelle 3.
Tabelle 1: Oligonucleotide für die Genamplifikation von FDH und LeuDH
Mit den Oligonucleotiden wurden den Genen Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angehängt. Diese sind für s3713 – BfrI, für s3714 – PstI, für s3723 – NdeI und s3716 – AatII (siehe unterstrichene Bereiche).
Tabelle 2: PCR-Ansätze, Polymerase, Puffer und MgCl₂ stammen von der Firma Biomaster, die DNA-Ausgangskonzentration der Plasmid-DNA betrug 50μg/ml
Tabelle 3: PCR-Programm: die Schritte 2 bis 4 wurden 30mal wiederholt
Nach der Genamplifikation wurden die PCR-Fragmente mit den „DNA PCR and Gelband Purification Kit" der Firma GFX auf gereinigt und in die L-Rhamnose-induzierbaren Vektoren pJOE4580.2 (pBR322-Derivat; 1) bzw. pHWG640.12 (pACYC184-Derivat; 3; Seq. ID No. 11) mit Hilfe der unten genannten Restriktionsendonucleasen ligiert.
Restriktionsansätze wurden im allgemeinen mit circa 50μg/ml DNA im 10μl Standardansatz gemacht. Zugegeben wurde weiterhin 1μl des ersten Enzyms sowie 1μl des 10 × konzentrierten Enzympuffers. Die Ansätze wurden mit VE H20 auf das Endvolumen eingestellt. Die zu inserierende DNA wurde getrennt von der Plasmid-DNA mit den Restriktionsenzymen inkubiert. Nach der Restriktion mit dem ersten Enzym erfolgte ein Fällungsschritt, in dem die DNA mit Isopropanol gefällt und mit Ethanol gewaschen, getrocknet und in 8μl TE 10.01 aufgenommen wurde. Zu diesen Ansätzen wurde jeweils 1μl des zweiten Enzyms und 1μl des zweiten 10 × Enzympuffers gegeben und diese Ansätze erneut 1,5h bei 37°C inkubiert. Bei der Herstellung des Vektors pAM10.1 aus pAM8.21 folgte zudem eine Behandling mit Klenow-Polymerase. Dann wurde die DNA durch ein 1%iges Agarose-Gel (Seakem-Agarose mit 0,4μg/ml Ethidiumbromid) in ihre Fragmente aufgetrennt und die richtigen Banden mit einem Skalpell für die Weiterverwendung ausgeschnitten. Die DNA wurde aus den Gelblöckchen mit dem „EASY PURE Gel Purification Kit" der Firma Biozym nach Anleitung eluiert und in 15μl TE 10.01 aufgenommen.
Für die Ligation von Vektor und Insert wurden die Ansätze so gewählt, dass die Insert-DNA etwa die doppelte Konzentration des Zielvektors erreichte. Auch hier betrug die DNA-Konzentration circa 50 μg/ml. Endvolumen für die Ligationsansätze war 10μl, die neben dem Vektor-Insert-Gemisch auch 1μl Ligase und 1μl 10 × konzentrierten Ligasepuffer (beides von ROCHE) enthielten. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C. Die Ligationsansätze wurden in E. coli K12 JM109 transformiert, auf LB-Agar mit Antbiotika (100μg/ml Ampicillin (pAM3.25 [Seq. ID No. 9], pAM5.22) oder 25μg/ml Chloramphenicol (pAM8.21, pAM10.1 [Seq. ID No. 10]) selektiert und Klone nach Plasmidisolierung auf das zu erwartende Plasmid kontrolliert.
Da zu Anfang LeuDH (Seq. ID No. 6) mit Malic Enzyme (Seq. ID No. 12) gekoppelt werden sollte, wurde das LeuDH Gen zuerst in pJOE4625.1 inseriert, das bereits das Gen für Malic Enzyme (sfcA) enthielt (2). Anschliessend wurde das LeuDH Gen in pHGW640.12 (3) inseriert, einem pACYC184 Derivat, ebenfalls mit Rhamnosepromotor und sfcA Gen, das dann deletiert wurde. Die Umklonierung des LeuDH-Gens vom Plasmid pAM5.22 (2) auf das Zielplasmid pAM10.1 (4) war notwendig zur Erstellung eines Zweiplasmidsystems, dass zur Selektion zwei Resistenzmarker benötigt.
Tabelle 4: Klonierungsergebnisse
Fermentation des Ganzzellkatalysators
Nachdem die Kombination FDH/LeuDH (E. coli JM109/pAM3.25/pAM10.1) bei Versuchen im Miniaturmaßstab (1ml) im Thermoschüttler durch HPLC-Analyse die besseren Umsatzergebnisse von Trimethylpyruvat zu tert-Leucin als ein Vergleichsmodellsystem (Malic Enzyme/LeuDH auf pAM5.22) erreichte, wurden die Plasmide pAM3.25 und pAM10.1 in E. coli BW3110 transformiert, da dieser für Fermentationen geeigneter ist. Durch die Hochzelldichtefermentation sollte eine genügend große Biomasse für alle folgenden Untersuchungen mit dem Modellsystem hergestellt werden. Die Fermentation erfolgte ohne Antibiotikum, die Vorkulturen wurden mit Antibiotikum angezogen, in einem 30l-Fermentor mit 8l Endvolumen bei 30°C. Die Zellen wurden dazu zunächst als Batchkultur bei 30°C angezogen bis zu einer OD600=50 und einem vollständigen Verbrauch der Glucose (ca. 22h). dann erfolgte die Genexpressionsinduktion durch Zugabe von sterilfiltrierter Rhamnose mit einer Endkonzentration von 0,2% sowie der Start als Fedbatchkultur durch automatische Zugabe von Nährlösung und Mineralien (Feed I und Feed II). Ab der Induktion wurden alle zwei Stunden Proben genommen, von denen die OD und die Enzymaktivitäten mit den jeweiligen Aktivitätstests bestimmt wurden. In der 5 sind der Verlauf der OD sowie der Aktivitäten bis zum Fermentationsabbruch gegen die Zeit aufgetragen.
Die Fermentation wurde 22h nach der Rhamnoseinduktion abgebrochen, da die Aktivität der FDH trotz zunehmender Zelldichte stagniert war und die Ursache dafür vermutlich ein Plasmidverlust oder zu saures Reaktionsmilieu war. Letzteres machte sich bemerkbar bei den Ganzzellumsetzungen, bei denen der pH-Wert im Vergleich zu einer vorher pH-regulierten Lösung bei Zugabe der Biofeuchtmasse deutlich absank (ΔpHmax = 0,8). Die Aktivitäten der beiden Enzyme erreichten 0,565U/mg Gesamtprotein für die LeuDH und 0,123U/mg Gesamtprotein für die FDH. Die Volumenaktivitäten bezogen auf das Fermentationsmedium ergaben für die LeuDH 32,77U/ml und 7,14U/ml für die FDH. Die Zellausbeute nach dem Entfernen des Mediums in einem Separator ergab 1,4kg Biofeuchtmasse. Die Zellen wurden bei –20°C bis zum Einsatz als Ganzzellkatalysator zwischengelagert.
Fermentationsmedien
Vorkultur:
Vorkulturmedium:

2 × 200ml
cNa2SO4 × 10H2O=2g/l
c(NH4)2SO4 = 2,675g/l
cNH4Cl = 0,5g/l
cK2HPO4 = 14,625g/l
cNaH2PO4 × 2H2O = 3,6g/l
Autoklavieren in 90 vol% H2O
cGlucose=10g/l Endkonzentration
(Stocklösung, in H2O)
Getrennt autoklavieren
1M MgSO4-Lösung 2ml/l
TES 3ml/l
Thiamin-Stammlösung (10g/l in H2O) 1ml/l

Batchkultur:

Inokulum (380ml mit Cx = 12g/l) mit Glucose, MgSO4, TES und Thiamin in einem Animpfkolben zum autoklavierten Batchmedium zugeben

Batchmedium (Einwaage für 8l):

Na2SO4 × 10H2O	16 g
(NH4) 2S04	21,4 g
NH4Cl	45
K2HPO4	117 g
NaH2PO4 × 2H2O	28,8 g
(NH4)2H-Citrat in 7.5l H2O lösen und im 301-Fermenter sterilisieren	8 g
Glucose-Monohydrat in 500 ml H2O lösen und autoklavieren (25g/l)	220 g
1M MgSO4-Lösung	16 ml
TES	24 ml
Thiamin-Lösung (10g/l) (Thiamin sterilfitrieren, Rest autoklavieren) pH-Wert 7,2 mit H3PO4 und NH3	8 ml

Fedbatch-Feed:

I. Glucose-Monohydrat autoklavieren 2750g in 3,5l H2O

MgSO₄ × 7H2O autoklavieren 98,5g in 0,15l H2O

TES-Lösung 0,5l

autoklavieren
Thiamin sterilfiltrieren anschließend vereinigen in einem Zulaufkolben	2,5g in 0,05l H2O
II. (NH4)2HPO4 autoklavieren	396g in 1l H2O, pH7

Feed I und II werden mittels zwei getrennten Pumpen zugegeben
pH-Wert: 7.2 (titriert mit H3PO4 und NH3)
pO₂: ca. 50kPa (reguliert durch Rührerdrehzahl) Spurenelemente-Lösung (TES):

CaCl2 × 2H2O 0,5 g

ZnSO4 × 7H2O 0,18 g

MnSO4 × H2O 0,1 g

Di-Na-EDTA 20,1 g

FeCl3 × 6H2O 16,7 g

CuSO4 × 5H2O 0,16 g

CoCl2 × 6H2O 0,18 g

H2O ad 1l
Herstellung von L-tert-Leucin mit einem Ganzzellkatalysator bei 900 mM ohne Dosierung (Vergleichsbeispiel = Synthesebeispiel 1)
Es werden zu 5.85 g des Biokatalysators (Biomasse E. coli JM105(pAM 3.25_10.1)) und 7.95 g Ammoniumformiat (2.8 mol-Äquivalente) 50 mL einer 0.9M Trimethylbrenztraubensäurelösung (pH 7.0, eingestellt mit 32%-igem Ammoniak), die zugleich 1 mM Magnesiumchlorid und 1%(v/v) Toluol enthält, gegeben. Der pH-Wert wird zu Beginn der Reaktion auf pH7.0 nachgestellt und danach nicht weiter reguliert, so dass der pH-Wert während der Reaktion ansteigt. Die Reaktionstemperatur beträgt 30 °C. Nach 8 h Reaktionszeit wird ein Umsatz von 24.6 gemessen, der auch nach weiteren 15 h Rühren nicht mehr gesteigert werden kann.
Herstellung von L-tert-Leucin mit einem Ganzzellkatalysator bei ca. 0,9M mit Fedbatch-Dosierung (Synthesebeispiel 2)
Es werden zunächst in einem 250L-Dreihalskolben 23,84 g Ammoniumformiat (entsprechend 2.8 Äquivalenten bezogen auf die gesamte eingesetzte Substratmenge) und 17.55 g des Biokatalysators (Biomasse E. coli JM105(pAM 3.25_10.1) eingewogen und dazu 28.50 mL VE-Wasser sowie 150 μL einer 1M Magnesiumchloridlösung (entsprechend einer 1 mM Konzentration bezogen auf das Endvolumen) hinzugefügt. Bei Erreichen der Reaktionstemperatur von 30 °C wird durch Zugabe von 7,50 mL einer 1.8M Trimethylbrenztraubensäurelösung (pH 7.0, eingestellt mit 32%-igem Ammoniak) die Reaktion gestartet. Der pH-Wert wird anschließend durch Zugabe von 32%-igem Ammoniak auf pH 7.0 gestellt. Anschließend werden nach in definierten Zeitabständen zunächst zweimal jeweils 7.50 mL einer 1.8M Trimethylbrenztraubensäurelösung (pH 7.0, eingestellt mit 32%-igem Ammoniak), sowie anschließend fünfmal unterschiedliche Volumina einer 1.8M Trimethylbrenztraubensäurelösung (pH 7.0, eingestellt mit 32%-igem Ammoniak) zudosiert. Die Zeitabstände sowie die jeweils zudosierten Mengen sind in nachfolgender Dosiertabelle angegeben. Das Endvolumen beträgt 150 mL und die Gesamtkonzentration an eingesetztem Substrat beträgt 0.86M, entsprechend einer volumetrischen Menge an Trimethylbrenztraubensäure von 112.5 g/L. Nach 24 h Reaktionszeit wird ein vollständiger Umsatz (>98% gemäß HPLC) beobachtet.
Herstellung von L-tert-Leucin mit einem Ganzzellkatalysator bei 1M mit kontinuierlicher Dosierung (Synthesebeispiel 3)
Es werden zunächst in einem 250L-Dreihalskolben 26.48 g Ammoniumformiat (entsprechend 2.8 Äquivalenten bezogen auf die gesamte eingesetzte Substratmenge), 150 μL einer 1M Magnesiumchloridlösung (entsprechend einer 1 mM Konzentration bezogen auf das Endvolumen) und 19.49 g des Biokatalysators (Biomasse E. coli JM105(pAM 3.25_10.1) eingewogen und dazu 30 mL VE-Wasser hinzugefügt. Der pH-Wert wird anschließend durch Zugabe von 32%-igem Ammoniak auf pH 7.0 gestellt. Bei Erreichen der Reaktionstemperatur von 30 °C gibt man kontinuierlich mit einem Flow von 0.2 mL/min über einen Zeitraum von 10 Stunden insgesamt 120 mL einer 1.25M Trimethylbrenztraubensäurelösung (pH 7.0, eingestellt mit 32%-igem Ammoniak) zu. Das Endvolumen beträgt 150 mL und die Gesamtkonzentration an eingesetztem Substrat beträgt 1.0 M, entsprechend einer volumetrischen Menge an Trimethylbrenztraubensäure von 130.1 g/L. Nach 27 h Reaktionszeit wird ein Umsatz von 96% (gemäß HPLC) beobachtet.
Herstellung von L-tert-Leucin mit einem Ganzzellkatalysator bei 700 mM mit Fedbatch-Dosierung
In ein konisch geformtes 100ml Reaktionsgefäß eines STAT Titrino 718 werden zuerst 2,558 Natriumformiat (entspricht 2,5mol/l bezüglich Endvolumen) gegeben, 15μl einer 1M MgCl2-Lösung (entspricht 1mM Endkonzentration) zugesetzt und 4,5ml einer 1M TMP-Lösung (pH7 mit 25%igem Ammoniak eingestellt) sowie 1,5vol% Toluol (bezüglich Endvolumen) zugegeben. Das Volumen wird mit VE H2O auf 15ml aufgefüllt. Die Reaktionstemperatur von 30°C wird durch einen Wasserkreislauf stabil gehalten und kontrolliert. Vom Biokatalysator wurde 1g Biofeuchtmasse im Substratgemisch resuspendiert und der pH-Wert mit 25%igem Ammoniak auf pH6,9 bis pH7 eingestellt.
Nach Erreichen von pH7,5 werden wiederholt 4,5ml der 1M TMP-Lösung (pH7) zugegeben. Der pH-Wert sinkt dabei um ca. ΔpH = 0,3. Sobald pH7,5 erreicht wird, erfolgt erneut die Zugabe von 4,5ml 1M TMP-Lösung. Die Zugabe von TMP im genannten Volumen wird 10 × wiederholt bis der pH-Wert sich bei der Zugabe von TMP nicht mehr nach unten verändert. Bei der achten Zugabe von TMP erfolgt außerdem die Zugabe von 4ml 4M Natrium-Formiatlösung (entspricht ohne Berücksichtigung eines Umsatzes einer Konzentration von 973mM im Medium). Das Endvolumen beträgt 64ml mit einer volumetrischen Endkonzentration (ohne Berücksichtigung des Umsatzes) von Trimethylbrenztraubensäure von 774mM (100,6g/l). Natriumformiat liegt mit einer Endkonzentration von 836mM in der Lösung vor. Nach bereits 6h konnte durch HPLC ein Umsatz von Trimethylbrenztraubensäure von 92% beobachtet werden.
In der folgenden Tabelle 5 sind die Konzentrationen beider Substrate zu den verschiedenen Zugabepunkten aufgelistet.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten L-α-Aminosäuren oder deren Salzen durch Umsetzen der entsprechenden 2-Ketocarbonsäure mit einem Ammoniumionen-Donor in Gegenwart eines Ganzzellkatalysators aufweisend ein kloniertes Gen kodierend für eine Cofaktor-abhängige Aminosäuredehydrogenase und ein kloniertes Gen kodierend für ein den Cofaktor regenerierendes Enzym bei einer Gesamteinsatzmenge an Substrat pro Reaktionsvolumen von ≥ 500 mM, wobei die Zugabe des Substrats so dosiert wird, dass die stationäre Konzentration an 2-Ketocarbonsäure unter 500 mM liegt und die externe Zugabe an Cofaktor bezogen auf die Gesamteinsatzmenge an Substrat < 0,0001 Äquivalenten entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man keinen Cofaktor zur Reaktionsmischung zusetzt.
Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man solche 2-Ketocarbonsäuren einsetzt, die Aminosäuren der allgemeinen Formel (I)
worin R für Alkyl, insbesondere eine raumerfüllende, verzweigte, ein tertiäres C-Atom aufweisende Alkylgruppe mit 5-10 C-Atomen, beispielsweise tert-Butyl, und substituierte Alkyl steht, liefern.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zudosierung des Substrats nach einem Fedbatch-Verfahren erfolgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die 2-Ketocarbonsäure in einer maximalen stationären Konzentration von unter 450 mM, ganz bevorzugt von unter 400 mM hält.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man den Ganzzellkatalysator vor dessen Einsatz so vorbehandelt, dass die Permeabilität der Zellmembran für die Substrat und Produkte gegenüber dem intakten System gesteigert ist.