DE102004022065A1

DE102004022065A1 - Screeningverfahren für Hydantoinrazemasen

Info

Publication number: DE102004022065A1
Application number: DE102004022065A
Authority: DE
Inventors: Oliver Dr. May; Karlheinz Prof. Drauz; Stefan Dr. Buchholz
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2004-05-05
Publication date: 2005-03-17

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Screeningverfahren für Hydantoinrazemasen und neue Hydantoinrazemasen, die sie codierenden Nukleinsäuresequenzen und ein Verfahren zur Mutagenese. DOLLAR A Hydantoinrazemasen sind im Zusammenhang mit der Erzeugung von enantiomerenangereicherten Aminosäuren aus racemischen Hydantoinen von Interesse.

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Screeningverfahren zur Detektion verbesserter Hydantoinrazemasen, neue Hydantoinrazemasen selbst und deren Verwendung zur Herstellung von N-Carbamoyl-Aminosäuren gerichtet.
Diese optisch aktiven Verbindungen sind in der organischen Synthese zur Herstellung von z.B. bioaktiven Wirkstoffen häufig eingesetzte Verbindungen. Sie kommen auch in chiralen Auxiliaren z.B. in Form der Aminoalkohole (Evans-Reagenzien) vor.
Die enzymatische Hydrolyse von 5-substituierten Hydantoinen zu N-Carbamoyl-Aminosäuren und deren Weiterreaktion zu den entsprechenden enantiomerenangereicherten Aminosäuren ist eine Standardmethode in der organischen Chemie ("Enzyme Catalysis in Organic Synthesis", Eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1^st and 2^nd Ed.). Die Enantiodifferenzierung kann dabei entweder auf der Stufe der Hydantoinhydrolyse durch Hydantoinasen erfolgen oder aber wahlweise bei der Spaltung der N-Carbamoyl-Aminosäuren mittels enantioselektiver Carbamoylasen. Da die Enzyme nur jeweils eine optische Antipode der entsprechenden Verbindung umsetzen, wird versucht, die andere im Gemisch (in-situ) zu razemisieren, um den vollständigen Umsatz des razemisch leicht herstellbaren Hydantoins in die korrespondierende enantiomerenangereicherte Aminosäure zu gewährleisten. Die Razemisierung kann dabei entweder auf der Stufe der Hydantoine mittels chemischer (Base, Säure, erhöhte Temp.) oder enzymatischer Verfahren erfolgen oder aber auf der Stufe der N-Carbamoyl-Aminosäuren mittels z.B. Acetylaminosäurerazemasen ( DE 10050124 ) vonstatten gehen. Letztere Variante funktioniert erfolgreich naturgemäß nur bei Einsatz von enantioselektiven Carbamoylasen. Das nachfolgende Schema veranschaulicht diesen Sachverhalt.
Schema 1:
Für aromatische Substrate ist die Geschwindigkeit der chemischen Razemisierung der Hydantoine, wie in Tabelle 1 gezeigt, ausreichend hoch, um hohe Raum-Zeit-Ausbeuten für die Herstellung von Aminosäuren nach dem Hydantoinaseverfahren zu gewährleisten. Für aliphatische Hydantoine wie Isobutyl-, Methyl- und Isopropylhydantoin stellt die Razemisierung jedoch einen erheblichen Engpass bei der Synthese aliphatischer Aminosäuren dar.
Tabelle 1: Razemisierungskonstanten von Hydantoinen bei 40°C, pH 8.5 bestimmt durch Anfangsraten gem. einer Reaktion erster Ordnung (-k_rac = ln ([a]/[a₀]) aus: Hydrolysis and Formation of Hydantoins (Chpt. B 2.4). Syldatk, C. and Pietzsch, M. In: Enzyme catalysis in organic synthesis (Eds.: K. Drauz & H. Waldmann), VCH, 1^st and 2^nd Ed.).
Dieses Problem zeigt sich beispielsweise bei der in EP 759475 beschriebenen Herstellung von enantiomerenangereichertem tert-Butylhydantoin mittels des Hydantoinaseverfahrens. Hier wurden zur vollständigen Umsetzung von 32mM tert.-Butylhydantoin mit 1,5kU R-Hydantoinase 8 Tage bei pH 8,5 und 4 Tage bei pH 9,5 benötigt. Tatsächlich ist die geringe Raum-Zeit-Ausbeute durch die nur langsame chemische Razemisierung von tert-Butylhydantoin (k_rac = 0.009h^–1 bei 50°C und pH 8.5) bedingt.
Aus dem Stand der Technik sind Hydantoinrazemasen aus Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas, Mikrobacterium, Agrobacterium und Arthrobacter bekannt (Lit.: JP 04271784 ; EP 1188826 ; Cloning and characterization of genes from Agrobacterium sp. IP I-671 involved in hydantoin degradation. Hils, M.; Muench, P.; Altenbuchner, J.; Syldatk, C.; Mattes, R. Applied Microbiology and Biotechnology (2001), 57(5–6), 680–688; A new razemase for 5-monosubstituted hydantoins. Pietzsch, Markus; Syldatk, Christoph; Wagner, Fritz. Ann. N. Y. Acad. Sci. (1992) , 672 (Enzyme Engineering XI), 478–83 . Lickefett, Holger; Krohn, Karsten; Koenig, Wilfried A.; Gehrcke, Barbel; Syldatk, Christoph. Tetrahedron: Asymmetry (1993), 4(6), 1129–35; Purification and characterization of the hydantoin razemase of Pseudomonas sp. strain NS671 expressed in Escherichia coli. Watabe, Ken; Ishikawa, Takahiro; Mukohara, Yukuo; Nakamura, Hiroaki. J. Bacteriol. (1992), 174(24), 7989–95).
Von den Hydantoinrazemasen aus Arthrobacter aurescens DSM 3745, Pseudomonas sp. NS671 und Microbacterium liquefaciens ist bekannt, dass diese Enzyme aliphatische Hydantoine wie beispielsweise Isopropylhydantoin oder Isobutylhydantoin nur schwach razemisieren. Darüber hinaus weiß man, dass die Hydantoinrazemasen aus Arthrobacter aurescens DSM 3747 aromatische Hydantoine wie Indolylmethylhydantoin oder Benzylhydantoin bevorzugt, wohingegen aliphatische Hydantoine wie Methylthioethylhydantoin vergleichsweise schwach oder im Fall von Isopropylhydantoin überhaupt nicht umgesetzt werden (A new razemase for 5-monosubstituted hydantoins. Pietzsch, Markus; Syldatk, Christoph; Wagner, Fritz. Ann. N. Y. Acad. Sci. (1992), 672(Enzyme Engineering XI), 478–83.).
Die niedrige Aktivität von Hydantoinrazemasen begrenzt daher häufig das wirtschaftliche Potential dieser Route.
Um in geeigneter Zeit möglichst viele Hydantoinrazemasen auf ihr Potential zur Razemisierung von aliphatischen Hydantoine prüfen zu können, lag die Aufgabe der vorliegenden Erfindung unter anderem in der Angabe eines geeigneten Screeningverfahrens für Hydantoinrazemasen. Darüber hinaus sollte das erfindungsgemäße Screeningverfahren als Bestandteil für ein Mutagenseverfahren zur Gewinnung neuer und verbesserter Hydantoinrazemasen einsetzbar sein. Ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfidnung war die Angabe neuer Hydantoinrazemasen, die den Hydantoinrazemasen des Standes der Technik zumindest in Selektivität und/oder Aktivität und/oder Stabilität überlegen sind.
Diese Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Anspruch 1 bezieht sich auf ein Screeningverfahren für Hydantoinrazemasen. Unteransprüche 2 bis 4 zeigen vorteilhafte Ausführungsformen des Screeningverfahrens auf. Anspruch 5 beschäftigt sich mit einem Mutageneseverfahren zur Herstellung neuer Hydantoinrazemasen unter Anwendung des erfindungsgemäßen Screeningverfahrens. Ansprüche 6 bis 11 beziehen sich auf neue Hydantoinrazemasen sowie die sie codierenden Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung. Ansprüche 12 bis 14 richten sich auf Vehikel, welche die erfindungsgemäßen Hydantoinrazemasen aufweisen, bzw. spezielle Primer für deren Herstellung.
Dadurch, dass man ein Screeningverfahren für Hydantoinrazemasen angibt, bei dem man

a) eine enantioselektive Hydantoinase und
b) die zu prüfende Hydantoinrazemase, welche eine verglichen mit der Hydantoinase unter a) langsamere Umsetzungsrate aufweist, auf
c) ein chirales Hydantoin einwirken lässt, welches in zur Selektivität der Hydantoinase entgegengesetzter enantiomerenangereicherter Form eingesetzt wird, und
d) die resultierende N-Carbamoyl-Aminosäure oder die freigesetzten Protonen zeitabhängig detektiert, gelangt

Durch Einsatz eines L-Enantiomers eines 5'-monosubstituierten Hydantoins und Verwendung einer D-selektiven Hydantoinase, welche aufgrund ihrer Enantioselektivität bevorzugt dass entstehende D-Enantiomer des Hydantoins schnell hydrolysiert, kann durch die Bildung der N-Carbamoyl-D-Aminosäure oder freiwerdende Protonen die Razemisierungsgeschwindigkeit und damit die Aktivität der Hydantoinrazemase auf einfache Weise gemessen werden. Die Quantifizierung der N-Carbamoyl-Aminosäure kann dabei durch dem Fachmann bekannte Methoden wie beispielsweise HPLC oder colorimetrische Methoden erfolgen. Die Quantifizierung über Protonen kann auf einfache Weise über pH Indikatoren, bevorzugt Cresol Rot, erfolgen. Es sei darauf hingewiessen, dass in dem Verfahren sowohl D- als auch L-Enantiomere von Hydantoinen mit unterschiedlichen ggf. aliphatischen 5'-Substituenten eingesetzt werden können. Beim Einsatz der D-Hydantoine sind dementsprechenden L-selektive Hydantoinasen im Screeningverfahren einzusetzen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden vorteilhaft aliphatische in 5'-Stellung substituierte Hydantoine. Unter aliphatisch substituierten Hydantoinen wird in diesem Zusammenhang ein System verstanden, welches in 5'-Stellung an dem Hydantoinheterozyklus einen Rest aufweist, der über ein C-Atom mit sp³-Hybridisierung an den Heterozyklus gebunden ist. Bevorzugte 5'-Substituenten sind dabei Methyl, Ethyl, Butyl, Propyl, tertiär-Butyl, Isopropyl und Isobutyl. Ganz besonders bevorzugt ist Ethyl-Hydantoin.
Als Hydantoinasen können sämtliche in der Literatur bekannten Hydantoinasen eingesetzt werden, welche das über die Hydantoinrazemase gebildete Enantiomer des Hydantoins enantioselektiv hydrolysieren, wobei diese Hydrolyse schneller als die Razemisierungsgeschwindigkeit sein muss. Bevorzugte Hydantoinasen sind dabei die kommerziellen Hydantoinasen 1 & 2 von Roche, die Hydantoinasen der Gattungen Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium, Pasteurella, Microbacterium, Vigna, Ochrobactrum, Methanococcus, Burkholderia und Streptomyces.(Hils, M.; Muench, P.; Altenbuchner, J.; Syldatk, C.; Mattes, R. Cloning and characterization of genes from Agrobacterium sp. IP I-671 involved in hydantoin degradation. Applied Microbiology and Biotechnology (2001), 57(5–6), 680–688.Soong, C.-L.; Ogawa, J.; Shimizu, S. Cyclic ureide and imide metabolism in microorganisms producing a D-hydantoinase useful for D-amino acid production. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2001), 12(1–6), 61–70. Wiese, Anja; Wilms, Burkhard; Syldatk, Christoph; Mattes, Ralf; Altenbuchner, Josef. Cloning, nucleotide sequence and expression of a hydantoinase and carbamoylase gene from Arthrobacter aurescens DSM 3745 in Escherichia coli and comparison with the corresponding genes from Arthrobacter aurescens DSM 3747. Applied Microbiology and Biotechnology (2001), 55(6), 750–757. Yin, Bang-Ding; Chen, Yi-Chuan; Lin, Sung-Chyr; Hsu, Wen-Hwei. Production of D-amino acid precursors with permeabilized recombinant Escherichia coli with D-hydantoinase activity. Process Biochemistry (Oxford) (2000), 35(9), 915–921. Park, Joo-Ho; Kim, Geun-Joong; Lee, Seung-Goo; Lee, Dong-Cheol; Kim, Hak-Sung. Purification and characterization of thermostable D-hydantoinase from Bacillus thermocatenulatus GH-2. Applied Biochemistry and Biotechnology (1999), 81(1), 53–65; Pozo, C.; Rodelas, B.; de la Escalera, S.; Gonzalez-Lopez, J. D,L-Hydantoinase activity of an Ochrobactrum anthropi strain. Journal of Applied Microbiology (2002), 92(6), 1028–1034; Chung, Ji Hyung; Back, Jung Ho; Lim, Jae-Hwan; Park, Young In; Han, Ye Sun. Thermostable hydantoinase from a hyperthermophilic archaeon, Methanococcus jannaschii. Enzyme and Microbial Technology (2002), 30(7), 867–874; Xu, Zhen; Jiang, Weihong; Jiao, Ruishen; Yang, Yunliu. Cloning, sequencing and high expression in Escherichia coli of D-hydantoinase gene from Burkholderia pickettii. Shengwu Gongcheng Xuebao (2002), 18(2), 149–154; Las Heras-Vazquez, Francisco Javier; Martinez-Rodriguez, Sergio; Mingorance-Cazorla, Lydia; Clemente-Jimenez, Josefa Maria; Rodriguez-Vico, Felipe.
Overexpression and characterization of hydantoin racemase from Agrobacterium tumefaciens C58. Biochemical and Biophysical Research Communications (2003), 303(2), 541–547; DE 3535987 ; EP 1275723 ; US 6087136 ; WO 0281626; US 2002045238 ; DE 4328829 ; WO 9400577; WO 9321336; JP 04325093 ; NL 9001680 ; JP 2003024074 ; WO 0272841; WO 0119982; WO 9620275).
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung der Hydantoinase aus Arthrobacter crystallopoietes, insbesondere der aus DSM 20117.
Wie schon angedeutet sollte die Umsetzungsgeschwindigkeit der Hydantoinase die der Razemase übertreffen. Vorzugsweise liegt das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten der Hydantoinase zur Hydantoinrazemase (k_Hyd/k_Raz) bei > 2, besonders bevorzugt bei > 10 und ganz besonders bevorzugt bei > 50.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von verbesserten Hydantoinrazemasen, welches sich dadurch auszeichnet, dass man

a) die Nukleinsäuresequenz codierend für die Hydantoinrazemase einer Mutagenese unterwirft,
b) die aus a) erhältlichen Nukleinsäuresequenzen in einen geeigneten Vektor kloniert und diesen in ein geeignetes Expressionsystem transferiert und
c) die gebildeten Hydantoinrazemasen mit verbesserter

Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität mittels eines erfindungsgemäßen Screeningverfahrens detektiert und isoliert.
Als Ausgangsgene für die Mutagenese der Hydantoinrazemasen können sämtliche bekannten und in der angeführten Literatur erwähnten Hydantoinrazemasegene dienen. Bevorzugt sind dabei die Hydantoinrazemasegene von Arthobacter, Pseudomonas, Agrobacterium und Micrococcus (Wiese A; Pietzsch M; Syldatk C; Mattes R; Altenbuchner J Hydantoin racemase from Arthrobacter aurescens DSM 3747: heterologous expression, purification and characterization. JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY (2000 Jul 14), 80(3), 217–30; Watabe K; Ishikawa T; Mukohara Y; Nakamura H Purification and characterization of the hydantoin racemase of Pseudomonas sp. strain NS671 expressed in Escherichia coli. JOURNAL OF BACTERIOLOGY (1992 Dec), 174(24), 7989–95; Las Heras-Vazquez, Francisco Javier; Martinez-Rodriguez, Sergio; Mingorance-Cazorla, Lydia; Clemente-Jimenez, Josefa Maria; Rodriguez-Vico, Felipe. Overexpression and characterization of hydantoin racemase from Agrobacterium tumefaciens C58. Biochemical and Biophysical Research Communications (2003), 303(2), 541–547; EP 1188826 ). Ganz besonders bevorzugt ist das Hydantoinrazemasegen aus Arthrobacter aurescens welches für die Proteinsequenz in Seq.ID.Nr. 2 codiert.
Zur Mutagenese der Hydantoinrazemase können sämtliche in der Literatur bekannten Methoden wie beispielsweise Zufallsmutagenese, Sättigungsmutagenes, Kassetten-Mutagenese oder Rekombinationsmethoden verwendet werden (May, Oliver; Voigt, Christopher A.; Arnold, Frances H. Enzyme engineering by directed evolution. Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (2nd Edition) (2002), 1 95–138; Bio/Technology 1991, 9, 1073–1077; Horwitz, M. und Loeb, L., Promoters Selected From Random DNA-Sequences, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7405–7409; Dube, D. und L. Loeb, Mutants Generated By The Insertion Of Random Oligonucleotides Into The Active-Site Of The Beta-Lactamase Gene, Biochemistry 1989, 28, 5703–5707; Stemmer, P.C., Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 1994, 370, 389–391 und Stemmer, P.C., DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci USA 91, 1994, 10747–10751).
Die Klonierung und Expression kann wie in der weiter unten angegebenen Literatur durchgeführt werden. Das Verfahren kann mehrmals hintereinander ggf. mit wechselnden Mutagenesestrategien durchgeführt werden.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls rec-Polypeptide oder die diese codierende Nukleinsäuresequenzen, welche nach dem eben genannten Mutageneseverfahren erhältlich sind.
Ebenso ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der so hergestellten Polypeptide zur Herstellung von chiralen enantiomerenangereicherten N-Carbamoyl-Aminosäuren oder Aminosäuren. Die erfindungsgemäß hergestellten Nukleinsäuresequenzen können zur Herstellung von Ganzzellkatalysatoren dienen.
Einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden auch Hydantoinrazemasen, welche in Position 79 einen Aminosäureaustausch mit einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y oder V aufweisen. Interessant ist, dass die Aminosäuren, welche diese Position umgeben, für viele Hydantoinrazemasen vollständig konserviert sind. Die Konsensussequenz lautet: FX₁DX₂GL (Seq.ID.Nr. 1), wobei X₂ P oder T darstellt und X₁ W oder G darstellt. Bevorzugte Mutanten weisen daher die oben genannte Konsensussequenz auf, wobei X₁ vorzugsweise eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y oder V darstellt. X₁ entspricht dabei der Position 79. Bevorzugte Mutanten sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2:
Weitere äußerst vorteilhafte Kombinationen von X₁ und X₂ Hydantoinrazemasen sind in folgender Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Vorteilhafte Kombinationen von X₁ und X₂ in dem Konsensusmotiv FX₁DX₂GL
Von besonderem Vorteil ist es, wenn die Hydantoinrazemasen die oben angegebene Konsensusregion und zusätzlich eine Homologie von > 40% zur Hydantoinrazemase aus DSM 20117 aufweisen.
Weiterhin Gegenstand der Erfindung sind isolierte Nukleinsäuresequenzen codierend für eine Hydantoinrazemase ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz codierend für eine erfindungsgemäße Hydantoinrazemase,
b) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz codierend für eine erfindungsgemäße Hydantoinrazemase oder der dazu komplementären Sequenz hybridisiert,
c) einer Nukleinsäuresequenz gemäß den Seq.ID.Nr. 3, 5, 7 oder 9 oder solchen mit einer Homologie von > 80% zu diesen,
d) einer Nukleinsäuresequenz aufweisend 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenzen Seq.ID.Nr. 3, 5, 7 oder 9.

In Bezug auf Punkt d) ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz 20, mehr bevorzugt 25, weiter bevorzugt 30, 31, 32, 33, 34 und äußerst bevorzugt mehr als 34 identische konsekutive Nukleinsäuren der Sequenzen Seq.ID.Nr. 3, 5, 7 oder 9 aufweist.
Wie gesagt sind von der Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen mitumfasst, welche unter stringenten Bedingungen mit den erfindungsgemäßen einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen oder deren komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren (b) oder solche, die sich in Sequenzabschnitten gleichen (d). Als solche sind z.B. spezielle Gensonden oder die für eine PCR notwendigen Primer anzusehen.
Eine Kopplung von Hydantoinrazemase und Hydantoinase und ggf. Carbamoylase kann dabei durch Zusammengeben der freien bzw. immobilisierten Enzyme erfolgen. Bevorzugt ist jedoch, wenn die Hydantoinase gemeinsam mit der Hydantoinrazemase und/oder der Carbamoylase in der selben Zelle exprimiert wird (Ganzzellkatalysator).
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können daher als Bestandteil eines Gens in analoger Weise wie in DE 10234764 und dort zitierter Literatur in einen Ganzzellkatalysator kloniert werden.
Sofern dieser dann auch Gene für eine Hydantoinase und/oder Carbamoylase aufweist, ist er im Stande racemische Hydantoine zur Gänze in enantiomerenangereicherte Aminosäuren umzuwandeln. Ohne ein kloniertes Carbamoylasegen stoppt die Reaktion auf der Stufe der N-Carbamoyl-Aminosäuren.
Vorzugsweise wird ein Organismus wie in der DE 10155928 genannt als Wirtsorganismus eingesetzt. Der Vorteil eines derartigen Organismus ist die gleichzeitige Expression aller beteiligten Enzyme, womit nur noch ein rec-Organismus für die Gesamtreaktion angezogen werden muss.
Um die Expression der Enzyme im Hinblick auf ihre Umsetzungsgeschwindigkeiten abzustimmen, können die entsprechenden codierenden Nukleinsäuresequenzen in unterschiedliche Plasmide mit unterschiedlichen Kopienzahlen kloniert und/oder unterschiedlich starke Promotoren für eine unterschiedlich starke Expression der Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Bei derart abgestimmten Enzymsystemen tritt vorteilhafterweise eine Akkumulation einer ggf. inhibierend wirkenden Zwischenverbindung nicht auf und die betrachtete Reaktion kann in einer optimalen Gesamtgeschwindigkeit ablaufen. Dies ist dem Fachmann jedoch hinlänglich bekannt (Gellissen, G.; Piontek, M.; Dahlems, U.; Jenzelewski, V.; Gavagan, J. W.; DiCosimo, R.; Anton, D. L.; Janowicz, Z. A. (1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst. Coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46–54; Farwick, M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A. W.; DE 19920712 ). Die Herstellung eines derartigen Ganzzellkatalysators ist dem Fachmann hinlänglich bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Balbas, P. und Bolivar, F. (1990), Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli, Methods Enzymol. 185, 14–37; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 205–225, Butterworth, Stoneham).
In einer nächsten Ausgestaltung bezieht sich die Erfindung auf Plasmide oder Vektoren aufweisend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen.
Als Plasmide oder Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61–89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I–III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden kann, sind Derivate von pUC18 und pUC19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen). Weiterebevorzugte Plasmide sind pBR322 (DSM3879), pACYC184 (DSM4439) und pSC101 (DSM6202), welche von der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany bezogen werden können.
Als bevorzugt anzusehende Plasmide Gleichfalls ist die Erfindung auf Mikroorganismen aufweisend eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen gerichtet.
Der Mikroorganismus, in den die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthaltenen Plasmide kloniert werden, dient zur Vermehrung und Gewinnung einer ausreichenden Menge des rekombinanten Enzyms. Die Verfahren hierfür sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Als Mikroorganismen können im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommenden Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen herangezogen werden. Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XLl Blue, W3110, DSM14459 (PCT/US00/08159), NM 522, JM101, JM109, JM105, RR1, DH5α, TOP 10^– oder HB101. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird, sind weiter oben angegeben.
Ein folgender Aspekt der Erfindung richtet sich auf Primer zur Herstellung der erfindungsgemäßen Gensequenzen mittels aller Arten von PCR. Mitumfasst sind die Sense- und Antisense-Primer codierend für die entsprechenden Aminosäuresequenzen, bzw. komplementären DNA-Sequenzen. Geeignete Primer können prinzipiell nach dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden. Das Auffinden der erfindungsgemäßen Primer erfolgt durch Vergleich mit bekannten DNA-Sequenzen oder durch Übersetzung der ins Auge gefaßten Aminosäuresequenzen in das bevorzugte Codon des betrachteten Organismus (z.B. für Streptomyces: Wright F. und Bibb M. J. (1992), Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome, Gene 113, 55–65). Gemeinsamkeiten in der Aminosäuresequenz von Proteinen von sogenannten Superfamilien sind hierfür ebenfalls von Nutzen (Firestine, S. M.; Nixon, A. E.; Benkovic, S. J. (1996), Threading your way to protein function, Chem. Biol. 3, 779–783). Weitere Informationen diesbezüglich können gefunden werden in Gait, M. J. (1984), Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press Ltd., Oxford; Innis, M. A.; Gelfound, D. H.; Sninsky, J. J. und White, T.J. (1990), PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press Inc., San Diego.
Bevorzugte Primer sind die der Seq.ID.Nr. 11 und 12.
Für die Anwendung können die betrachteten Enzyme (Hydantoinrazemase, Hydantoinasen und/oder Carbamoylasen) wie schon angedeutet in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant (rec-) hergestelltes Enzym verwendet werden. Weiterhin können die Enzyme auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch auf gereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.
Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Sharma B. P.; Bailey L. F. und Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biomaterialiern – Techniken und Anwendungen, Angew. Chem. 94, 836–852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Paradkar, V. M.; Dordick, J. S. (1994), Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents, J. Am. Chem. Soc. 116, 5009–5010; Mori, T.; Okahata, Y. (1997), A variety of lipicoated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents, Tetrahedron Lett. 38, 1971–1974; Otamiri, M.; Adlercreutz, P.; Matthiasson, B. (1992), Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solbilize the enzyme in active form in toluene, Biocatalysis 6, 291–305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono-cetylether) (Kamiya, N.; Okazaki, S.-Y.; Goto, M. (1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene, Biotechnol. Tech. 11, 375–378).
Äußerst bevorzugt ist die Immobilisierung an Eupergit^®, insbesondere Eupergit C^® und Eupergit 250L^® (Röhm) (Eupergit.RTM. C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential. Katchalski-Katzir, E.; Kraemer, D. M. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2000), 10(1–3), 157–176.)
Gleichfalls bevorzugt ist die Immobilisierung an Ni-NTA in Kombination mit dem His-Tag (Hexa-Histidin) ergänzten Polypeptid (Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Bornhorst, Joshua A.; Falke, Joseph J. Methods in Enzymology (2000), 326, 245–254). Die Verwendung als CLECs ist ebenfalls denkbar (St. Clair, N.; Wang, Y.-F.; Margolin, A. L. (2000), Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals (CLEC) of alcohol dehydrogenase, Angew. Chem. Int. Ed. 39, 380–383).
Durch diese Maßnahmen kann es gelingen aus Polypeptiden, welche durch organische Solventien instabil werden, solche zu generieren, die in Gemischen von wässrigen und organischen Lösungsmitteln bzw. ganz in Organik stabil sind und arbeiten können.
Ganzzellkatalysatoren werden im Allgemeinen in Form freier oder immobilisierter Zellen eingesetzt. Hierzu wird die aktive Zellmasse in einer hydantoinhaltigen Lösung resuspendiert. Die Zellkonzentration beträgt dabei zwischen 1–100g/l. Die Konzentration des Hydantoins liegt zwischen 0,1 und 2 molar. Als Lösungsmittel wird bevorzugt H2O verwendet, wobei jedoch auch Mischungen von organischen Lösungsmitteln und H₂O einsetzbar sind. Der pH-Wert wird entweder nicht geregelt oder mittels gängiger Puffer bzw. durch kontinuierliche pH-Statisierung zwischen pH6 und pH10 konstant gehalten. Die Reaktionstemperatur liegt typischerweise zwischen 20°c und 90°C. In Abhängigkeit der verwendeten Hydantoinase werden zweiwertige Metall-Ionen in Konzentrationen von 0,1–5mM hinzugesetzt. Bevorzugte Metallionen sind dabei Mn²⁺, Zn²⁺ oder Co²⁺.
In Bezug auf den Einsatz der einzelnen Enzyme kann in äquvalenter Art und Weise verfahren werden.
Die durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Hydantoinrazemasen in wie z.B. oben beschriebener Weise hergestellten Produkte werden nach gängigen Verfahren aufgearbeitet. Vorteilhaft ist jedoch die Aufarbeitung durch Ionenaustauschchromatographie. Hierdurch wird das Produkt vom bei der Reaktion entstehenden Salzen befreit. Das Eluat wird ggf. mit Aktivkohle geklärt und die entstandene enantiomerenangereicherte Aminosäure oder N-Carbamoyl-Aminosäure durch Einengung des Lösungsmittels ausgefällt und getrocknet.
Die Kopplung einer enzymatischen Razemisierung mit einer enantioselektiven Hydrolyse zum Screenen von Hydantoinrazemaseaktivitäten wurde bisher nicht zur Erzeugung verbesserter Hydantoinrazemasen angewendet. Für eine besonders erfolgreiche Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollten mehrere Vorraussetzungen erfüllt sein:

1. Die chemische Razemisierungsgeschwindigkeit des im Screening verwendeten enantiomerenreinen Hydantoins muss sehr viel kleiner sein, als die Geschwindigkeit der enzymatisch katalysierten Reaktion.
2. Die enantioselektive enzymatische Hydrolyse mittels der Hydantoinase muss sehr viel schneller erfolgen als die enzymatische Razemisierung des Hydantoins.

Für aliphatisch substituierte Hydantoine ist, durch deren langsame chemische Razemisierung bedingt, Punkt 1 gegeben. Punkt 2 kann durch eine gezielte Auswahl von geeigneten Hydantoinasen (s. weiter vorne) erfüllt werden.
Mit den Aussagen des Standes der Technik wird die vorliegende Erfidnung nicht nahegelegt, da diesem keinerlei Hinweise auf die weiter oben genannten Voraussetzungen zu entnehmen sind.
Sämtliche der gezeigten Mutanten weisen an der Aminosäureposition 79 eine Mutation auf, was die Bedeutung dieser Position für die Enzymfunktion erstmalig aufzeigt. Interessant ist, dass die Aminosäuren, welche diese Position umgeben, für sämtliche bekannten Hydantoinrazemasen vollständig konserviert sind. Hieraus ergibt sich, dass für andere Hydantoinrazemasen welche das oben beschriebene Sequenzmotif enthalten und eine hohe Homologie (> 40% Sequenzidentität) aufweisen durch ortsspezifische Mutagenese an Pos. 79 verbesserte Enzymvarianten erzeugt werden können, was bisher aus dem Stand der Technik nicht herleitbar war.
Unter optisch angereicherten (enantiomerenangereicherten, enantiomer angereicherten) Verbindungen wird im Rahmen der Erfindung das Vorliegen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in > 50 mol-% verstanden.
Unter dem Begriff Nukleinsäuresequenzen werden alle Arten von einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA als auch RNA. oder Gemische derselben subsumiert.
Die Verbesserung der Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität bedeutet erfindungsgemäß, dass die Polypeptide aktiver und/oder selektiver bzw. weniger selektiv oder unter den verwendeten Reaktionsbedingungen stabiler sind. Während die Aktivität und die Stabilität der Enzyme für die technische Anwendung naturgemäß möglichst hoch sein sollte, ist in Bezug auf die Selektivität dann von einer Verbesserung die Rede, wenn entweder die Substratselektivität abnimmt, die Enantioselektivität der Enzyme jedoch gesteigert ist.
Von den beanspruchten Polypetiden und den Nukleinsäuresequenzen werden erfindungsgemäß auch solche Sequenzen umfaßt, die eine Homologie (exclusive der natürlichen Degeneration) größer als 70% (in Bezug auf die Nukleinsäuresequenz) bzw. > 40% oder 80% (in Bezug auf die Polypetide), bevorzugt größer als 90%, 91%, 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% zu einer dieser Sequenzen aufweisen, sofern die Wirkungsweise bzw. Zweck einer solchen Sequenz erhalten bleibt. Der Ausdruck "Homologie" (oder Identität) wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1 – V/X] × 100 definiert werden, worin H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen/Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequnezen, welche für Polypeptide codieren, alle Sequenzen umfaßt, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen.
Der Ausdruck "unter stringenten Bedingungen" wird hierin wie bei Sambrook et al. (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) beschrieben, verstanden. Bevorzugt liegt eine stringente Hybridisierung gemäß der vorliegenden Erfindung vor, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7.0) und 0,1 % SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 50 °C, bevorzugt bei 55 °C, mehr bevorzugt bei 62 °C und am meisten bevorzugt bei 68 °C und mehr bevorzugt für 1 Stunde mit 0,2 × SSC und 0,1 % SDS bei 50 °C, bevorzugter bei 55 °C, mehr bevorzugt bei 62 °C und am meisten bevorzugt bei 68 °C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird.
Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen gelten als von der Offenbarung mitumfaßt.
Der Organismus Arthrobacter aurescens DSM3747 wurde durch die Rütgerswerke Aktiengesellschaft am 28.05.86 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig hinterlegt.
Beispiele
Beispiel 1: Erzeugung Hydantoinrazemasemutanten – Zufallsmutagenese
0,25ng des Vektors pOM21 (Plasmidkarte siehe 1; Sequenz siehe Seq.ID.Nr.13) (PCT/US00/08159) wurde als Template in einem 100μl PCR Reaktionsmix bestehend aus PCR-Puffer (10 mM Tris, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8.5), 200 μM dTTP, 200 μM dGTP, 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 50 pmol des jeweiligen Primers (siehe Seq.ID.Nr. 11 und 12) und 2,5 U Taq-Polymerase (Roche) eingesetzt. Nach 30 Zyklen wurde das Amplifikat mittels Gelextraktion (QiaexII Gel-Extraktionskit) aufgereinigt und in den Vektor pOM21 mittels den Restriktionsenzymen NdeI und PstI subkloniert. Das Ligationsprodukt wurde zur Transformation von hydantoinasepositiver Stämme verwendet (siehe Beispiel 2).
Beispiel 2: Herstellung von hydantoinasepositiven Stämmen und einer Mutantenbank
Chemisch kompetente E.coli JM109 (z.B. von Promega) wurden mit 10ng des Plasmids pDHYD (siehe 2; siehe Seq.ID.Nr. 15) (Herstellung?) transformiert, welches das D-Hydantoinasegen aus Arthrobacter crystallopoietes DSM20117 unter Kontrolle eines Rhamnose-Promotors trägt. Die vollständige Sequenz des Plasmids ist in Seq.ID.Nr. 15 angegeben. Der so erzeugte hydantoinasepositive Stamm wurde wiederum chemisch kompetent gemacht und zur Herstellung der Mutantenbank mit dem Ligationsprodukt der Hydantoinrazemase-Zufallsmutagenese aus Beispiel 1 transformiert. Die auf Ampicillin- und Chloramphenicolhaltigen Agarplatten ausgestrichenen Kolonien der Mutantenbank wurden anschliessend einem Screening unterworfen, welches in Beispiel 3 beschrieben wird.
Beispiel 3: Screening nach Hydantoinrazemasemutanten mit verbesserten Enzymeigenschaften
Einzelne Kolonien der Mutantenbank wurden in 96-Well-Platten überimpft, welche mit 100μ pro Well Rhamnose (2g/l) und ZnCl₂ (1mM) supplementiertem LB-Medium (5g/l Hefeextrakt, 10g/l Trypton, 10g/l NaCl) gefüllt waren. Die Platten wurden für 20 Stunden bei 30°C inkubiert. Anschliessen wurden 100μl Screening-Substrat (100mM L-Ethylhydantoin, 50mg/l Cresol Rot, pH 8.5) zu jedem Well zugegeben und die Platten für 4 Stunden bei 20°C inkubiert. Wells mit verbesserten Hydantoinrazemasemutanten konnten durch eine intensivere Gelbfärbung im Vergleich zum Wildtyp direkt per Auge, oder unter Verwendung eines Spektralphotometers bei 580nm identifiziert werden.
Beispiel 4: Charakterisierung von Hydantoinrazemasemutanten mit verbesserten Enzymeigenschaften
Die im Screening identifizierten Razemasemutanten wurden anschliessend mittels HPLC-Analyse auf ihre Aktivität im Vergleich zum Wildtyp untersucht und die entsprechenden Mutationen mittels Sequenzierung bestimmt. Hierzu wurde von einzelnen Kolonien der unterschiedlichen Klone Plasmide isoliert (Qiagen Mini-Prep Kit) und sequenziert. Die selben Klone wurden zur Herstellung aktiver Biomasse verwendet. Eine Übernachtkultur (OD₆₀₀ = 4) der jeweiligen Klone wurde hierzu 1:100 in 100ml Rhamnose (2g/l) und ZnCl₂ (1mM) supplementiertem LB-Medium (5g/l Hefeextrakt, 10g/l Trypton, 10g/l NaCl) verdünnt und 18 Stunden bei 30°C und 250UPM inkubiert. Die Biomasse wurde mittels Zentrifugation (10min, 10.000g) pelletiert und der Überstand verworfen. 2g aktive Biomasse wurde anschliessend in 50ml der Substratlösung (100mM L-Ethylhydantoin, pH 8.5) resuspendiert und bei 37°C inkubiert. Nach verschiedenen Zeiten wurden Proben genommen, die Biomasse durch Zentrifugation (5min, 13.000 UPM) abgetrennt und der Überstand mittels HPLC auf die Konzentration der entstandenen N-Carbamoyl-aminobuttersäure analysiert.
Beispiel 5 Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Hydantoinrazemasen
Ein mit pOM21-BB5 und pOM22 3 (siehe Seq.ID.Nr.14) (PCT/US00/08159) transformierter Stamm von E.coli JM109 wurde bei 30°C in Ampicillin (100μg/l) und Chloramphenicol (50μg/l)-haltigem sowie mit 2g/l Rhamnose versetztem LB-Medium für 18 Stunden unter Schütteln (250 U/min) inkubiert. Die Biomasse wurde durch Zentrifugation pelletiert und mit einem entsprechenden Volumen von 100mM DL-Ethlyhydantoinlösung, pH 8,5 und 1mM CoCl₂ so resuspendiert, dass sich eine Zellkonzentration von 30g/l ergibt. Diese Reaktionslösung wurde für 10 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen durch Zentrifugation (30 min, 5000g) abgetrennt und der klare Überstand mittels HPLC auf die entstandene Aminosäure analysiert. Zur Aufarbeitung der enstandenen Aminosäure wurde das Volumen des Überstandes auf die Hälfte reduziert und 1:2 mit Methanol versetzt. Die ausgefällte Aminosäure wurde anschliessend filtriert und getrocknet. Die Gesamtausbeute der Aminosäure betrug > 60%.
Beispiel 6 Herstellung von D-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Hydantoinrazemasen
Ein mit pOM21-BB5 und pJAVIER16 4 (siehe Seq.ID.Nr.16) (Herstellung?) transformierter Stamm von E.coli JM109 wurde bei 30°C in Ampicillin (100μg/l) und Chloramphenicol (50μg/l-haltigem sowie mit 2g/l Rhamnose versetztem LB-Medium für 18 Stunden unter Schütteln (250 U/min) inkubiert. Die Biomasse wurde durch Zentrifugation pelletiert und mit einem entsprechenden Volumen von 100mM DL-Ethlyhydantoinlösung, pH 8,5 und 1mM CoCl2 so resuspendiert, dass sich eine Zellkonzentration von 30g/l ergibt. Diese Reaktionslösung wurde für 10 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen durch Zentrifugation (30 min, 5000g) abgetrennt und der klare Überstand mittels HPLC auf die entstandene Aminosäure analysiert. Zur Aufarbeitung der enstandenen Aminosäure wurde das Volumen des Überstandes auf die Hälfte reduziert und 1:2 mit Methanol versetzt. Die ausgefällte Aminosäure wurde anschliessend filtriert und getrocknet. Die Gesamtausbeute der Aminosäure betrug > 60%. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Screeningverfahren für Hydantoinrazemasen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine enantioselektive Hydantoinase und b) die zu prüfende Hydantoinrazemase, welche eine verglichen mit der Hydantoinase unter a) langsamere Umsetzungsrate aufweist, auf c) ein chirales Hydantoin einwirken lässt, welches in zur Selektivität der Hydantoinase entgegengesetzter enantiomerenangereicherten Form eingesetzt wird, und d) die resultierende N-Carbamoyl-Aminosäure oder die freigesetzten Protonen zeitabhängig detektiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein aliphatisch substituiertes Hydantoin einsetzt.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Hydantoinase aus Arthrobacter crystallopoietes einsetzt.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten der Hydantoinase zur Hydantoinrazemase (k_Hyd/k_Raz) > 2 ist.
Verfahren zur Herstellung von verbesserten Hydantoinrazemasen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Nukleinsäuresequenz codierend für die Hydantoinrazemase einer Mutagenese unterwirft, b) die aus a) erhältlichen Nukleinsäuresequenzen in einen geeigneten Vektor kloniert und diesen in ein geeignetes Expressionsystem transferiert und c) die gebildeten Hydantoinrazemasen mit verbesserter Aktivität und/oder Selektivität und/oder Stabilität mittels eines Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 detektiert und isoliert.
rec-Polypeptide oder diese codierende Nukleinsäuresequenzen erhältlich nach Anspruch 5.
Verwendung der Polypeptide gemäß Anspruch 6 zur Herstellung von enantiomerenangereicherten N-Carbamoyl-Aminosäure oder Aminosäuren.
Verwendung der Nukleinsäuresequenzen gemäß 6 zur Herstellung von Ganzzellkatalysatoren.
Hydantoinrazemase aufweisend in Position 79 einen Aminosäureaustausch mit einer Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y oder V.
Hydantoinrazemasen aufweisend die Konsensussequenz FX₁DX₂GL (Seq. 1) , wobei X₂ P oder T darstellt und X₁ in der Position 79 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe A, R, N, D, C, Q, E, H, I, L, K, M, F, P, S, T, Y oder V darstellt darstellt.
Isolierte Nukleinsäuresequenz codierend für eine Hydantoinrazemase ausgewählt aus der Gruppe: a) einer Nukleinsäuresequenz codierend für eine Hydantoinrazemase gemäß Anspruch 9 und/oder 10, b) einer Nukleinsäuresequenz, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz codierend für eine Hydantoinrazemase gemäß Anspruch 9 und/oder 10 oder der dazu komplementären Sequenz hybridisiert, c) einer Nukleinsäuresequenz gemäß den Seq.ID.Nr. 3, 5, 7 oder 9 oder solchen mit einer Homologie von > 80% zu diesen, d) einer Nukleinsäuresequenz aufweisend 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenzen Seq.ID.Nr. 3, 5, 7 oder 9.
Ganzzellkatalysator aufweisend ein kloniertes Gen für eine Hydantoinrazemase gemäß den Ansprüchen 9 und/oder 10.
Plasmide, Vektoren oder Mikroorganismen aufweisend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 9 und/oder 10.
Primer zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 9 und/oder 10 mittels PCR.