DE10050124A1 - Verwendung der Acetylaminosäureracemase aus Amycolatopsis orientalis Racemisierung von Carbamoylaminosäuren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung der N-Acetylaminosäureracemase aus Amycolatopsis orientalis subspecies lurida zur Racemisierung von N-Carbamoylaminosäuren gerichtet. DOLLAR A Diese Verwendung erlaubt die 100%-ige Herstellung von optisch reinen Aminosäuren, ausgehend von racemischen Hydantoinen in einem enzymatischen Gesamtverfahren.

Description

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung einer N-Acetylaminosäureracemase (AAR) in einem Verfahren zur Racemisierung von N-Carbamoylaminosäuren.

Optisch reine Aminosäuren sind für die chemische Synthese sowie die parenterale Ernährung wichtige Ausgangsstoffe. Zur Herstellung optisch reiner Aminosäuren sind dem Fach­ mann viele Möglichkeiten bekannt. U. a. bieten sich diesbe­ züglich enzymatische Verfahren an, da sie zum einen kataly­ tisch arbeiten und zum anderen die Aminosäuren mit sehr ho­ hen Enantiomerenanreicherungen herzustellen gestatten.

Ein bekanntes enzymatisches Verfahren geht dabei von race­ mischen Hydantoinen aus, welche mittels Hydantoinasen in N- carbamoylgeschützte Aminosäuren transformiert werden. An­ schließend werden diese durch Carbamoylasen in die Amino­ säuren umgesetzt.

Vorzugsweise erfolgt die Trennung der in dieser Reaktions­ sequenz auftretenden Racemate auf der Basis der N- carbamoylgeschützten Aminosäuren, da sowohl L- als auch D- selektive Carbamoylasen zur Verfügung stehen (Park et al., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 564-570; May et al., Nat Bio­ technol. 2000, 18, 317-20; Pietzsch et al., J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2000, 737, 179-86; Chao et al., Bio­ technol. Prog. 1999, 15, 603-7; Wilms et al., J. Biotech­ nol. 1999, 68, 101-13; Batisse et al., Appl. Environ. Mic­ robiol. 1997, 63, 763-6; Buson et al., FEMS Microbiol. Lett. 1996, 145, 55-62).

Um einen vollständigen Umsatz der eingesetzten Hydantoine in optisch reine Aminosäuren zu gewährleisten, geschieht die dazu notwendige Racemisierung bisher auf der Basis der Hydantoine in chemischer oder enzymatischer Art und Weise (EP 745678; EP 542098; Schema 1).

Schema 1

Aus Streptomyces atratus Y-53 (Tokuyama et al., Appl. Mic­ robiol. Biotechnol. 1994, 40, 835-840) und Amycolatopis sp. TS-1-60 (Tokuyama et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995a, 42, 853-859) sowie Amycolatopsis orientalis sp. lu­ rida (DE 199 35 268) sind N-Acetylaminosäureracemasen (AARs) bekannt. Von der TS-1-60 ist eine allerdings sehr geringe Aktivität bei N-carbamoylgeschützten Aminosäuren feststell­ bar. Darüberhinaus besitzt dieses Enzym den Nachteil einer sehr hohen Metallionenabhängigkeit, was für den Einsatz dieses Enzyms in einem großtechnischen Prozeß nachteilig erscheint.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, die Ver­ wendung einer N-Acetylaminosäureracemase zur gegenüber dem Stand der Technik verbesserten Racemisierung von N- Carbamoylaminosäuren anzugeben. Diese Racemase sollte in einem Verfahren zur Herstellung von optisch reinen Amino­ säure ausgehend von racemischen Hydantoinen großtechnisch vorteilhaft einsetzbar sein.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verwendung der AAR ge­ mäß Anspruch 1. Ansprüche 2 und 3 richten sich auf bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Racemisierungs­ verfahrens.

Dadurch, daß man in einem Verfahren zur Racemisierung von N-Carbamoylaminosäuren eine N-Acetylaminosäureracemasen (AAR) aus Amycolatopsis orientalis subspecies lurida (Seq. 2) verwendet, erhält man aufgrund der überraschend erhöhten Aktivität der erfindungsgemäß eingesetzten AAR gegenüber der TS-1-60 im Hinblick auf die Racemisierung von N- Carbamoylaminosäuren die Möglichkeit, in einem verbesserten Verfahren die Äquilibrierung optischer Antipoden von N- carbamoylgeschützten Aminosäuren zu vollziehen.

Dies ist vor dem Hintergund besonders vorteilhaft, daß man somit einen weiteren enzymatischen Schritt in einem Verfah­ ren zur Herstellung von optisch reinen Aminosäuren etablie­ ren kann, welches von Hydantoinen ausgeht (Schema 2).

Schema 2

Gegenüber den literaturbekannten enzymatischen Verfahren, welche über eine enzymatische oder ggf. stressende chemi­ sche Racemisierung der Hydantoine prozessieren (Schema 1), hat man somit eine weitere vorteilhafte Möglichkeit ge­ schaffen, aus racemischen Hydantoinen optisch reine Amino­ säuren zu generieren.

Vorzugsweise wird für das Racemisierungsverfahren die re­ kombinant hergestellte Variante der AAR aus Amycolatopsis o. sp. lurida gemäß DE 199 35 268 eingesetzt. Aus der DE 199 35 268 ist bekannt, daß diese eine verhältnismäßig ge­ ringe Schwermetallionenabhängigkeit (insbesondere in Bezug auf Kobaltionen) und geringe Aminosäureinhibierung auf­ weist. Dort wird auch deren Generierung als rekombinantes Enzym erläutert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie gesagt in einem Ge­ samtprozeß zur Herstellung von enantiomer angereicherten Aminosäuren oder deren Derivaten ausgehend von Hydantoinen oder N-Carbamoylaminosäuren vorteilhaft eingesetzt. Man geht dabei im Falle der Hydantoine bevorzugt so vor, daß man racemische Hydantoine mittels Hydantoinasen in die kor­ respondierenden racemischen N-Carbamoylaminosäuren spaltet und diese anschließend durch L- oder D-spezifische Carba­ moylasen in die optisch aktiven L- oder D-Aminosäuren um­ wandelt. Damit sich nicht die nicht umgesetzte optische An­ tipode einer N-Carbamoylaminosäure im Reaktionsgemisch an­ reichert, setzt man die optischen Antipoden der N- Carbamoylaminosäuren durch Zugabe der AAR erfindungsgemäß ins Gleichgewicht und kann somit ebenfalls das racemische Hydantoin zur Gänze in optisch reine Aminosäuren umwandeln.

Vorzugsweise erfolgt dieser Prozeß in einem Enzym-Membran- Reaktor (DE 199 10 691.6).

Die genannten Enzyme können in freier Form als homogen auf­ gereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestellte Enzyme zusammen oder nacheinander verwendet werden. Weiter­ hin können die Enzyme auch als Bestandteil eines Gastorga­ nismus (Ganzzellkatalysator wie in US 09/407062) eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen Zellmas­ se des Wirtsorganismus. Möglich ist ebenfalls die Verwen­ dung der Enzyme in immobilisierter Form (Bhavender P. Shar­ ma, Lorraine F. Bailey and Ralph A. Messing, "Immobilisierte Biomaterialiern - Techniken und Anwendungen", Angew. Chem. 1982, 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Dordick et al. J. Am. Chem. Soc. 194, 116, 5009-5010; Okahata et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1971-1974; Adlercreutz et al. Biocatalysis 1992, 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophi­ lisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethy­ lenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono- cetylether) (Goto et al. Biotechnol. Techniques 1997, 11, 375-378.

Der Mikroorganismus Amycolatopsis orientalis subsp. lurida ist unter der Nummer DSM43134 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen hinterlegt.

Unter AAR wird im Rahmen der Erfindung sowohl das native wie auch das rekombinant hergestellte Enzym verstanden.

Der Begriff enantiomer angereichert bezeichnet das vorlie­ gen einer optischen Antipode im Gemisch mit der anderen in < 50%.

Unter Aminosäure wird im Rahmen der Erfindung eine natürli­ che oder unnatürliche α-Aminosäure verstanden, d. h. daß der am α-C-Atom der α-Aminosäure befindliche Rest sich von einer natürlichen Aminosäure, wie in Beyer-Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag Stuttgart, 22. Auflage, 1991, S. 822 f. dargestellt, ableiten kann oder da­ rüberhinaus auch von entsprechenden α-Resten unnatürlicher α-Aminosäuren, welche z. B. in DE 199 03 268.8 aufgeführt sind.

SEQUENZPROTOKOLL

Beispiele Nachweis der Racemaseaktivität des rekombinanten AAR-En­ zyms

Das Substratspektrum der N-Acetylaminosäureracemase aus A­ mycolatopsis orientalis subsp. lurida wurde mit dem unten beschriebenen Enzymassay getestet.

Der Assay setzte sich wie folgt zusammen:
Puffer Tris/HCl: 50 mM (pH 8,0)
Substrat: 25 mM
Cobaltchlorid: 6 mM
AAR: ca. 150 µg gereinigtes Protein
Endvolumen: 1 ml

Im Assay wurden enantiomerenreine Aminosäure-Derivate ein­ gesetzt und die Bildung des entsprechenden Racemats im Po­ larimeter (Perkin-Elmer 241) verfolgt. Die Inkubation er­ folgte bei 30°C (heizbare Küvette) für 3 bis 12 Stunden. Die Messungen erfolgten bei einer Wellenlänge von λ = 365 nm.

Tabelle 1

Auflistung der getesteten Substrate und der entsprechenden spezifischen Aktivität der AAR

Die N-Acylaminosäureracemase aus A. TS-1-60 besitzt mit N- Carbamoyl-D-Met als Substrat eine Aktivität von 100 mU/mg. Damit ist diese spezifische Aktivität um 35% niedriger, als die der Racemase aus A. orientalis subsp. lurida.

Claims (3)

1. Verwendung von N-Acetylaminosäureracemasen (AAR) aus Amycolatopsis orientalis subspecies lurida in einem Verfahren zur Racemisierung von N-Carbamoyl­ aminosäuren.

2. Verwendung nach Anspruch 1 in einem Prozeß zur Her­ stellung von enantiomer angereicherten Aminosäuren o­ der deren Derivaten ausgehend von Hydantoinen oder N- Carbamoylaminosäuren.

3. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den Prozeß in einem Enzym-Membran-Reaktor durch­ führt.