DE10251184A1 - Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren - Google Patents

Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren Download PDF

Info

Publication number
DE10251184A1
DE10251184A1 DE10251184A DE10251184A DE10251184A1 DE 10251184 A1 DE10251184 A1 DE 10251184A1 DE 10251184 A DE10251184 A DE 10251184A DE 10251184 A DE10251184 A DE 10251184A DE 10251184 A1 DE10251184 A1 DE 10251184A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
amino acid
amino acids
inactivated
coli
recombinant microorganism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10251184A
Other languages
English (en)
Inventor
Oliver Dr. May
Stefan Dr. Buchholz
Michael Dr. Schwarm
Karlheinz Prof. Drauz
Robert J. Dr. Aurora Turner
Ian Dr. Fotheringham
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa GmbH filed Critical Degussa GmbH
Priority to DE10251184A priority Critical patent/DE10251184A1/de
Priority to EP03775186A priority patent/EP1558727B1/de
Priority to CA002511751A priority patent/CA2511751A1/en
Priority to PCT/EP2003/011432 priority patent/WO2004042047A1/en
Priority to AT03775186T priority patent/ATE439430T1/de
Priority to US10/527,061 priority patent/US20060228787A1/en
Priority to CNB2003801024249A priority patent/CN100510052C/zh
Priority to JP2004548747A priority patent/JP2006504428A/ja
Priority to DE60328813T priority patent/DE60328813D1/de
Priority to AU2003283269A priority patent/AU2003283269A1/en
Publication of DE10251184A1 publication Critical patent/DE10251184A1/de
Priority to US12/357,218 priority patent/US9194009B2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/009—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving hydantoins or carbamoylamino compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf spezielle E. coli Mutanten, die für die Synthese von D-Aminosäuren verwendet werden können sowie auf ein solches Verfahren. DOLLAR A Die Mutanten zeichnen sich durch Difizienzen in bestimmten D-aminosäureabbauenden Enzymen aus.

Description

  • Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren gerichtet. Insbesondere werden diese enzymatisch über die sogenannte Hydantoinaseroute unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen gewonnen. Gleichfalls behandelt die vorliegende Erfindung derart modifizierte Mikroorganismen.
  • D-Aminosäuren sind in der organischen Synthese als Intermediate zur Herstellung von pharmazeutischen Wirkstoffen häufig eingesetzte Verbindungen.
  • Die enzymatische Hydrolyse von 5-substituierten Hydantoinen zu N-Carbamoyl-aminosäuren und deren Weiterreaktion zu den entsprechenden enantiomerenangereicherten Aminosäuren ist eine Standardmethode in der organischen Chemie ("Enzyme Catalysis in Organic Synthesis", Eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1st and 2nd Ed.). Die Enantiodifferenzierung kann dabei entweder auf der Stufe der Hydantoinhydrolyse durch Hydantoinasen erfolgen oder aber wahlweise bei der Spaltung der N-Carbamoyl-aminosäuren mittels enantioselektiver Carbamoylasen. Da die Enzyme nur jeweils eine optische Antipode der entsprechenden Verbindung umsetzen, wird versucht, die andere im Gemisch (in-situ) zu razemisieren, um den vollständigen Umsatz des razemischen leicht herstellbaren Hydantoins in die korrespondierende enantiomerenangereicherte Aminosäure zu gewährleisten. Die Razemisierung kann dabei entweder auf der Stufe der Hydantoine mittels chemischer (Base, Säure, erhöhte Temp.) oder enzymatischer Verfahren erfolgen oder aber auf der Stufe der N-Carbamoylaminosäuren mittels z.B. Acetylaminosäurerazemasen ( DE10050124 ) vonstatten gehen. Letztere Variante funktioniert erfolgreich naturgemäß nur bei Einsatz von enantioselektiven Carbamoylasen. Das nachfolgende Schema veranschaulicht diesen Sachverhalt.
  • Schema 1:
    Figure 00020001
  • Es hat sich herausgestellt, dass die Verwendung rekombinanter Mikroorgansimen, welche Hydantoinase-, Carbamoylase- und Razemaseaktivitäten besitzen, zur Herstellung unterschiedlicher D-Aminosäuren problematisch sind. In 1 wird die Umsetzung von Hydroxymethylhydantoin und Ethylhydantoin mit E.coli JM109 transformiert mit einer D-Carbamoylase und D-Hydantoinase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 (gem. Patentanmeldung DE10114999.9 und DE10130169.3 ) aufgezeigt. Die Reaktionsbedingungen sind entsprechend Beispiel 1 gewählt. Wie 1 beispielhaft zeigt, erfolgt bei der Umsetzung unterschiedlicher 5-monosubstituierter Hydantoine ein starker Abbau der gebildeten D-Aminosäuren. Dies reduziert die erreichbare Ausbeute und erschwert die Produktaufarbeitung.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass am Abbau von D-Aminosäuren unterschiedliche Enzyme wie D-Aminosäureoxidasen [EC 1.4.3.3], D-Aminosäuredehydrogenasen [EC 1.4.99.1], D-Aminosäureaminotransferasen [EC 2.6.1.21], D-Aminosäure-N-acetyltransferasen [EC 2.3.1.36], D-Hydroxyaminosäuredehydratasen [EC 4.2.1.14] und D-Aminosäurerazemasen [EC 5.1.1.10] beteiligt sein können. Ebenso sind dem Fachmann unterschiedliche Methoden bekannt, um diese Gene gezielt oder auch ungezielt zu inaktivieren [The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors for gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of Gram-negative bacteria. Alexeyev, Mikhail F. BioTechniques (1999), 26(5), 824-828; One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko, Kirill A. and Wanner, Barry L. PNA5 (2000), 97(12), 6640–6645; D-amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12: positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene, Wild, Jadwiga and Klopotowski, T. Mol.Gen.Genet. (1981), 181(3), 373–378.].
  • Leider unbekannt und unvorhersagbar ist jedoch der zu erwartende Effekt auf das Zellwachstum beim Inaktivieren der unterschiedlichen Enzyme. Ebenso kann nicht vorhergesagt werden, welches Enzym oder ob eine Kombination von unterschiedlichen Enzymen inaktiviert werden muss, um den Abbau einer bestimmten D-Aminosäure im gewünschten Ausmaß zu reduzieren.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der zur Produktion von D- Aminosäuren über die Carbamoylase-/Hydantoinaseroute befähigt ist und der eine höhere Ausbeute an produzierter D-Aminosäure ermöglichen hilft. Dieser sollte im technischen Maßstab unter ökonomischen wie ökologischen Gesichtspunkten vorteilhaft einsetzbar sein. Insbesondere sollte er ein sehr gutes Wachstumsverhalten unter normalen wirtschaftlich sinnvollen Bedingungen, sowie hinreichende genetische und physikalische Stabilität und eine hinreichend schnelle Umsetzungsgeschwindigkeit für Hydantoine besitzen.
  • Diese Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Ansprüche 1 bis 5 beziehen sich auf bestimmte derart modifizierte Mikroorganiimen, während Ansprüche 6 und 7 ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren schützt.
  • Dadurch, dass man einen rekombinanten Mikroorganismus zur Herstellung von D-Aminosäuren ausgehend von N-Carbamoylaminosäuren oder 5'monosubstituierten Hydantoinen bereitstellt, bei dem durch Mutagenese das Gen kodierend für eine D-Aminosäureoxidase und/oder das Gen kodierend für eine D-Serindehydratase inaktiviert ist, gelangt man überraschend und dennoch vorteilhaft zur Lösung der genannten Aufgaben. Insbesondere ist es als überraschend zu werten, dass rekombinant hergestellte Mikroorganismen mit dem erfindungsgemäßen Genprofil tatsächlich stabil sind und D-Aminosäuren in für industrielle Größenordnungen ausreichendem Maße zu produzieren im Stande sind.
  • Als Mikroorganismen für rekombinante Ausführungsformen können im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck in Frage kommende Organismen wie Pilze z.B. Aspergillus sp., Streptomyces sp., Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, oder auch Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus sp. herangezogen werden.
  • Als bevorzugte erfindungsgemäße Mikroorganismen können solche der Gattung Escherichia coli angesehen werden. Ganz besonders bevorzugt sind: E. coli XL1 Blue, NM 522, JM101, JM109, JM105, BL21, W3110, RR1, DH5α, TOP 10– oder HB101. Die Herstellung derart modifizierter Organismen kann nach dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen. Dieser dient zur Vermehrung und Gewinnung einer ausreichenden Menge der rekombinanten Enzyme. Die Verfahren hierfür sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • Die besagten Nukleinsäuresequenzen werden also nach bekannten Methoden mit Plasmiden oder Vektoren in einen Wirtsorganismus kloniert und die so exprimierten Polypeptide können mit geeigneten Screening-Methoden detektiert werden. Zur Detektion sind grundlegend alle möglichen Nachweisreaktionen für die gebildeten Moleküle geeignet. Insbesondere eigenen sich grundlegend alle möglichen Nachweisreaktionen für Ammoniak bzw. Ammoniumionen wie Nessler-Reagenz (Vogel, A., I., (1989) Vogel's textbook of quantitative chemical analysis, John Wiley & Sons, Inc., 5th ed., 679–698, New York) die Indophenolreaktion auch Berthelot'sche Reaktion genannt (Wagner, R., (1969) Neue Aspekte zur Stickstoffanalytik in der Wasserchemie, Vom Wasser, VCH-Verlag, Bd. 36, 263–318, Weinheim) insbesondere die enzymatische Bestimmung mittels der Glutamat-Dehydrogenase (Bergmeyer, H.,U., und Beutler, H.-O. (1985) Ammonia, in: Methods of Enzymatic Analysis, VCH-Verlag, 3rd Edition, Vol. 8: 454-461, Weinheim) aber auch der Nachweis mit Ammonium-sensitiven Elektroden. Weiterhin dienen HPLC-Methoden zum Nachweis von Aminosäuren wie z.B. ein Derivativ-Verfahren auf der Basis von o-Pthaldialdehyd und N-Isobutyryl-Cystein zur Enantiomerentrennung von Aminosäuren (Brückner, H., Wittner R., und Godel H., (1991) Fully automated high-performance liquid chromatographic Separation of DL-amino acids derivatized with o-Phthaldialdehyde together with N-isopropyl-cysteine. Application to food Samples, Anal. Biochem. 144, 204-206).
  • Als Plasmide oder Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dunn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61–89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179–204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3–7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2na ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
  • Besonders bevorzugte Klonierungsvektoren von D-Carbamoylasen in E.coli sind beispielsweise Derivate von pBR322, pACYC184, pUC18 oder pSC101, welche konstitutive als auch induzierbare Promotoren zur Expressionskontrolle tragen können. Besonders bevorzugte Promotoren sind lac, tac, trp, trc, T3, T5, T7, rhaBAD, araBRD, λpL und phoA-Promotoren, welche dem Fachmann hinlänglich bekannt sind [Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli, Makrides S.C. Microbiol.Rev. 60(3), 512– 538].
  • Die Inaktivierung der D-Aminosäureoxidase (dadA) bzw. der D-Serindehydratase (dsdA) dieser Organismen erfolgt dabei nach dem Fachmann bekannten eingangs beschriebenen Methoden. Zur Erzeugung der rekombinanten Ausführungsarten der D-Serindehydratase bzw. D-Aminosäureoxidase defizienten Stämme mit D-Carbamoylaseaktivität sind dem Fachmann die grundlegenden molekularbiologischen Methoden also bekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Ebenso sind Gensequenzen unterschiedlicher D-Carbamoylasen z.B. aus Agrobacterium sp., Arthrobacter sp. oder Bacillus sp. und Ralstonia pickettii bekannt, die bevorzugt verwendet werden (u.a. aus US 5858759 , US 5807710 , US 6083752 , US 6083752 , US 6083752 , US 6083752 , US 6083752 ).
  • Für die Herstellung der Organismen, welche zusätzlich eine Hydantoinase und ggf. eine Hydantoin- oder Carbamoylracemase aufweisen, können gleiche Methoden angewandt werden. Als Hydantoinasen sind dabei bevorzugt solche aus Thermus sp., Bacillus sp., Mycobacterium sp., Corynebacterium sp., Agrobacterium sp., E.coli, Burkholderia sp., Pseudomonas sp., oder Arthrobacter sp. einzusetzen. Hydantoinrazemase können bevorzugt aus Pseudomonas sp., Arthrobacter sp., oder Agrobacterium sp., ggf. unter Zugabe von Hilfsstoffen, wie Metallionen, beispielsweise Mn2+-Ionen angewandt werden.
  • So konnten die erfolgreichen Mutanten Escherichia coli DSM 15181 und Escherichia coli DSM 15182 hergestellt werden. Diese bilden daher zusammen mit den aus ihnen ableitbaren weiteren Mutanten einen nächsten Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Im gleichfalls erfindungsgemäßen Verfahren wird z.B. ein Hydantoin in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Wasser, welches mit weiteren wasserlöslichen oder nicht wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln versetzt sein kann, bei pH-Werten zwischen 6,0 und 11, bevorzugt zwischen 7 und 10, und einer Temperatur zwischen 10°C und 100°C, bevorzugt zwischen 30°C und 70°C, besonders bevorzugt zwischen 37°C und 60°C mit den besagten Zellen oder Zellbestandteilen umgesetzt. Für die Anwendung können die betrachteten Enzyme auch in freier Form verwendet werden. Weiterhin können die Enzyme auch als Bestandteil eines intakten Gastorganismus eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen und beliebig hoch aufgereinigten Zellmasse des Wirtsorganismus.
  • Möglich ist ebenfalls die Verwendung der rekombinanten Zellen in geflockter, quervernetzter oder immobilisierter Form, beispielsweise unter Verwendung von Agar, Agarose, Carrageenan, Alginate, Pectine, Chitosan, Polyacrylamide und andere synthetische Träger (Chemical aspects of immobilized Systems in biotechnologies. Navratil, Marian; Sturdik, Ernest. Chemicke Listy (2000), 94(6), 380–388; Industrial applications of immobilized biocatalysts and biomaterials. Chibata, Ichiro. Advances in Molecular and Cell Biology (1996), 15A(Biochemical Technology), 151– 160; Immobilization of genetically engineered cells: a new strategy for higher stability. Kumar, P. K. R.; Schuegerl, K. Journal of Biotechnology (1990), 14(3–4), 255–72.).
  • Demgemäß bildet einen nächsten Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren mit einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus. Vorzugsweise werden D-Aminobuttersäure, D-Serin, D-Methionin, D- Tryptophan und D-Phenlyalanin hergestellt.
  • Bei diesem Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren werden bevorzugt Organismen mit D-carbamoylaseaktiven und hydantoinaseaktiven und dadA und/oder dsdA inaktivierten Zellen verwendet. Hierbei ist zu erwähnen, dass als Edukt sowohl L-, D- oder DL-Carbamoylaminosäuren als auch 5-monosubstituierte Hydantoine in Frage kommen, welche über hinlänglich bekannte Hydantoinasen in die entsprechenden Carbamoylaminosäuren überführt werden können ("Enzyme Catalysis in Organic Synthesis", Eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1st and 2na Ed.). Die verwendeten dadA und/oder dsdA defizienten Stämme können dabei die Carbamoylase und Hydantoinase, gegebenenfalls auch eine Hydantoinrazemase oder Carbamoylaminosäurerazemase koexprimieren und sowohl in freier oder auch immobilisierter Form eingesetzt werden (s.o ).
  • Wie sich nun gezeigt hat, ist die Inaktivierung unterschiedlicher Enzyme erforderlich, um für unterschiedliche D-Aminosäuren den Abbau in ausreichendem Maße (< 10% Abbau innerhalb von >10 Stunden) zu reduzieren (siehe 2). Für den Abbau von D-Serin zeigte sich überraschenderweise, dass die Inaktivierung des Gens der D-Aminosäureoxidase (dadA) nicht ausreicht, um deren Abbau effektiv zu reduzieren. Für eine effektive Reduzierung des Abbaus dieser Aminosäure musste zusätzlich die D-Serindehydratase inaktiviert werden. In der Literatur war im Gegensatz dazu berichtet worden, dass durch eine Inaktivierung von dadA ein > 3 fach reduzierter Abbau von D-Serin erreicht wird [D-Amino acid dehydrogenase of Escherichia coli K12: positive selection of mutants defective in enzyme activity and localization of the structural gene. Wild, J.; Klopotowski, T. Mol. Gen. Genet. (1981), 181(3), 373–378]. Ebenfalls im Gegensatz zu den dort beschriebenen Ergebnissen, zeigte sich überraschenderweise, dass D-Serin sehr viel schneller abgebaut wird als beispielsweise D-Methionin.
  • Der Abbau aromatischer und aliphatischer D-Aminosäuren, wie beispielsweise D-Phenylalanin, D-Methionin oder D-Aminobuttersäure, wird im Gegensatz zu D-Serin ausreichend durch eine Inaktivierung der D-Aminosäureoxidase erreicht. Für D-Phenylalanin zeigen jedoch überraschenderweise beide Deletionen (ΔdsdA & ΔdadA) einen positiven Effekt, wohingegen für D-Methionin die Deletion in dsdA keinen zusätzlichen Effekt zeigt. Diese Ergebnisse sind in 2 zusammengefasst (Abbau unterschiedlicher Aminosäuren mit unterschiedlichen Mutanten von E.coli BW25113. E.coli ET3 besitzt eine Deletion der D-Aminosäureoxidase (ΔdadA); E.coli ET4 besitzt zusätzlich eine Deletion der D-Serindehydratase (ΔdsdA). Reaktionsbedingungen siehe Beispiel 3).
  • Die in dieser Schrift genannten Literaturstellen gelten als von der Offenbarung mitumfasst.
  • Die Organismen DSM15181 (ET3) und DSM15182 (ET4) wurden durch die Degussa AG am 10.09.2002 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00110001
    Figure 00120001
    Figure 00130001
    Figure 00140001
    Figure 00150001
    Figure 00160001
    Figure 00170001
    Figure 00180001
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Produktion von D-Aminosäuren mittels rekombinanten E.coli Zellen
  • Chemisch kompetente E.coli JM109 (Promega) wurden mit pJAVI16 (siehe 3) transformiert. Dieses Plasmid trägt eine D-Carbamoylase und eine D-Hydantoinase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM20117. Die Sequenzen der D-Hydantoinase und D-Carbamoylase sind in Seq. 1 und 3 dargestellt (siehe auch DE10114999.9 bzw. DE10130169.3 )
  • Die mit pJAVIERI6 transformierten E.coli Zellen wurden auf LBamp-Platten (Ampicillinkonzentration: 100ug/ml) vereinzelt. 2,5 ml LBamp-Medium mit 1mM ZnC12 wurden mit einer einzelnen Kolonie beimpft und 30 Stunden bei 37°C und 250rpm inkubiert. Diese Kultur wurde in 100ml LBamp-Medium mit 1mM ZnCl2 und 2g/1 Rhamnose 1:50 verdünnt und 18h bei 30°C inkubiert. Die Kultur wurde 10 min bei 100008 zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Biomasse gewogen. Die Biomasse wurde mit unterschiedlichen Hydantoinderivaten, z.B. 100mM DL-Hydroxymethylhydantoin bzw. DL-Ethylhydantoin, pH 7.5, versetzt, so dass sich eine Biomassenkonzentration von 40g Biofeuchtmasse pro Liter ergibt. Die Reaktionslösung wurde bei 37°C inkubiert. Nach unterschiedlichen Zeiten wurden Proben genommen, zentrifugiert und die entstandenen Aminosäuren mittels HPLC quantifiziert.
  • Beispiel 2: Erzeugung DsdA und DadA defizienten E.coli Stämmen
  • DadA wurde in E.coli BW25113 (Bei CGSC unter der Nummer CGSC7636 hinterlegt) gemäß der von Datsenko & Wanner beschriebenen Methode deletiert (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko, Kirill A, and Wanner, Barry L. PNAS (2000), 97(12), 6640–6645). Hierzu wurden folgende Primer zur Amplifikation der Chloramphenicolresistenz aus pKD13 (Bei CGSC unter der Nummer CGSC7633 hinterlegt) verwendet:
    Figure 00200001
  • Eine Transformation des Amplifikats in E.coli BW25113 (pKD46) (hinterlegt bei CGSC unter der Nummer CGSC7630) und Selektion kanamycinresistenter Klone ermöglichte die Isolierung von E.coli ET2. Nach Entfernung der Chloramphenicolresistenz gemäß des Protokolls von Datsenko & Wanner konnte der Stamm E.coli ET3 isoliert werden. Zur Deletion von dsdA in E.coli ET3 wurde wiederum die Chloramphenicolresistenz aus pKD13 mit folgenden Primern amplifiziert:
    Figure 00200002
  • Eine Transformation des Amplifikats in E.coli ET3 (pKD46) und Selektion kanamycinresistenter Klone ermöglichte die Isolierung von E.coli ET4, welcher sowohl ein Deletion in dadA als auch in dsdA trägt.
  • Beispiel 3 Untersuchung des Abbaus von D-Aminosäuren
  • 2,5 ml LB-Medium wurden mit einer einzelnen Kolonie von E.coli BW25113, E.coli ET3 und E.coli ET4 beimpft und 18 Stunden bei 37°C und 250rpm inkubiert. Diese Kulturen wurden in 100ml LB-Medium 1:50 verdünnt und 18h bei 37°C inkubiert. Die Kulturen wurden 10 min bei 10000g zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Biomasse gewogen. Die Biomasse wurde mit unterschiedlichen 100mM D-Aminosäurelösungen, pH7,5 (z.B. D-Methionin, D-Phenylalanin, D-Aminobuttersäure, D-Serin) so versetzt, dass sich eine Biomassenkonzentration von 100g Biofeuchtmasse pro Liter ergibt. Diese Reaktionslösungen wurden bei 37°C inkubiert und nach 10 Stunden zentrifugiert. Der klare Überstand wurde mittels HPLC auf die verbleibende Aminosäurekonzentration untersucht. Die Angabe Abbau wurde aus dem Quotienten der Anfangskonzentration und Endkonzentration nach 10 Stunden Inkubation berechnet.

Claims (7)

  1. Rekombinanter Mikroorganismus zur Herstellung von D-Aminosäuren ausgehend von N-Carbamoylaminosäuren oder 5'monosubstituierten Hydantoinen bei dem durch Mutagenese das Gen kodierend für eine D-Aminosäureoxidase und/oder das Gen kodierend für eine D-Serindehydratase inaktiviert ist.
  2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Organismus der Gattung Escherichia coli handelt.
  3. Mikroorganismus nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass dieser ein D-Carbamoylasegen aus Agrobacterium sp., Arthrobacter sp. oder Bacillus sp. besitzt.
  4. Escherichia coli DSM 15181 und daraus abgeleitete Mutanten.
  5. Escherichia coli DSM 15182 und daraus abgeleitete Mutanten.
  6. Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren mit einem Mikroorganismus nach Anspruch 1–5.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man D-Aminobuttersäure, D-Serin, D-Methionin, D-Tryptophan und D-Phenlyalanin herstellt.
DE10251184A 2002-11-04 2002-11-04 Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren Withdrawn DE10251184A1 (de)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10251184A DE10251184A1 (de) 2002-11-04 2002-11-04 Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren
US10/527,061 US20060228787A1 (en) 2002-11-04 2003-10-15 Mutants for the preparation of d-amino acids
CA002511751A CA2511751A1 (en) 2002-11-04 2003-10-15 Mutants for the preparation of d-amino acids
PCT/EP2003/011432 WO2004042047A1 (en) 2002-11-04 2003-10-15 Mutants for the preparation of d-amino acids
AT03775186T ATE439430T1 (de) 2002-11-04 2003-10-15 Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren
EP03775186A EP1558727B1 (de) 2002-11-04 2003-10-15 Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren
CNB2003801024249A CN100510052C (zh) 2002-11-04 2003-10-15 用于制备d-氨基酸的突变株
JP2004548747A JP2006504428A (ja) 2002-11-04 2003-10-15 Ｄ−アミノ酸の製造のための突然変異株
DE60328813T DE60328813D1 (de) 2002-11-04 2003-10-15 Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren
AU2003283269A AU2003283269A1 (en) 2002-11-04 2003-10-15 Mutants for the preparation of d-amino acids
US12/357,218 US9194009B2 (en) 2002-11-04 2009-01-21 Mutants for the preparation of D-amino acids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10251184A DE10251184A1 (de) 2002-11-04 2002-11-04 Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10251184A1 true DE10251184A1 (de) 2004-05-13

Family

ID=32103290

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10251184A Withdrawn DE10251184A1 (de) 2002-11-04 2002-11-04 Mutanten zur Herstellung von D-Aminosäuren
DE60328813T Expired - Lifetime DE60328813D1 (de) 2002-11-04 2003-10-15 Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60328813T Expired - Lifetime DE60328813D1 (de) 2002-11-04 2003-10-15 Mutanten für die herstellung von d-aminosäuren

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20060228787A1 (de)
EP (1) EP1558727B1 (de)
JP (1) JP2006504428A (de)
CN (1) CN100510052C (de)
AT (1) ATE439430T1 (de)
AU (1) AU2003283269A1 (de)
CA (1) CA2511751A1 (de)
DE (2) DE10251184A1 (de)
WO (1) WO2004042047A1 (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011109119A1 (en) 2010-01-08 2011-09-09 President And Fellows Of Harvard College Methods and coatings for treating biofilms
WO2012151554A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 President And Fellows Of Harvard College Polyamines for treating biofilms
JP6279478B2 (ja) 2011-11-16 2018-02-14 エボニック テクノヘミー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＥｖｏｎｉｋ Ｔｅｃｈｎｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ ヒダントイナーゼの突然変異体
CN107937377A (zh) * 2017-11-09 2018-04-20 江南大学 一种d‑n‑氨甲酰水解酶及应用
WO2019183344A1 (en) 2018-03-21 2019-09-26 Case Western Reserve University Thermoresponsive compositions and methods for preventing and disrupting biofilms
CN110699396B (zh) * 2019-11-15 2022-03-01 江南大学 一种级联反应制备d-芳香族氨基酸的方法
EP4105335A1 (de) 2021-06-16 2022-12-21 Evonik Operations GmbH Enzymatisches verfahren zur herstellung von l-glufosinat-p-alkylestern
WO2023174511A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Evonik Operations Gmbh Enzymatic method for the production of l-glufosinate p-esters
CN116926139A (zh) * 2022-04-12 2023-10-24 元素驱动(杭州)生物科技有限公司 一种n-乙酰-d-氨基酸、d-氨基酸、d-氨基酸衍生物的制备方法
WO2023232225A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Evonik Operations Gmbh Enzymatic method for the diastereoselective production of l-glufosinate p-esters

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1277125B1 (it) * 1995-12-21 1997-11-04 Eniricerche Spa Mutanti termostabili della d-n-alfa-carbamilasi
US5728555A (en) * 1996-09-30 1998-03-17 Monsanto Company Preparation of d-amino acids by direct fermentative means
JP4445668B2 (ja) * 1998-04-02 2010-04-07 エボニック デグサ ゲーエムベーハー アースロバクターアウレッセンスからの組み換えｌ−ｎ−カルバモイラーゼ、それによるｌ−アミノ酸の製造方法
DE10114999A1 (de) * 2001-03-26 2002-10-10 Degussa D-Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117

Also Published As

Publication number Publication date
JP2006504428A (ja) 2006-02-09
EP1558727B1 (de) 2009-08-12
DE60328813D1 (de) 2009-09-24
US20090203091A1 (en) 2009-08-13
ATE439430T1 (de) 2009-08-15
CA2511751A1 (en) 2004-05-21
CN100510052C (zh) 2009-07-08
CN1708583A (zh) 2005-12-14
EP1558727A1 (de) 2005-08-03
US20060228787A1 (en) 2006-10-12
US9194009B2 (en) 2015-11-24
WO2004042047A1 (en) 2004-05-21
AU2003283269A1 (en) 2004-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9194009B2 (en) Mutants for the preparation of D-amino acids
DE69333668T2 (de) Für eine decarbamylase mit verbesserter thermostabilität kodierende dna und ihre verwendung
Yamamoto et al. Production of S-(+)-ibuprofen from a nitrile compound by Acinetobacter sp. strain AK226
DE69131217T2 (de) Verfahren zur Herstellung von R(-)Mandelsäure und deren Derivaten
DE60313866T2 (de) Polypeptide mit alpha-h alpha amino acid amide racemase aktivitität und nukleinsäuren kodierend dafür
EP1950287B1 (de) Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
EP1247869B1 (de) Verfahren zur Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren
EP0625571A2 (de) Neue Mikroorganismen, deren Verwendung und Verfahren zur Herstellung von L-Alpha-Aminosäuren
DE3875953T2 (de) Verfahren zur herstellung von organischen chemischen verbindungen.
DE10129711B4 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pyruvat
EP1205542B1 (de) L-Aminosäure-Oxidase aus Rhodococcus-Arten
EP1318193B1 (de) D-Amidase aus Variovorax
EP1197563B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren
EP1200601B1 (de) Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren aus ihren racemischen n-acetyl-d,l-derivaten durch enzymatische racemat-spaltung mittels isolierter, rekombinanter enzyme
DE60211135T2 (de) D-carbamoylase aus arthrobacter crystallopoietes dsm 20117
EP1074628B1 (de) N-Acetylaminosäureracemase
DE60220797T2 (de) Nucleinsäuresequenzen kodierend für enantioselektive amidasen
US4906572A (en) Method of culturing amino acid racemase-producing microorganism of genus pseudomonas
EP0896617A1 (de) Verfahren zur herstellung von n-geschützten d-prolinderivaten
ATE518962T1 (de) Verfahren zur herstellung von d-serin
DE102004043748A1 (de) Biokatalysator zur Hydrolyse von Cyanid
EP1199369B1 (de) Verwendung der Acetylaminosäureracemase aus Amycolatopsis orientalis zur Racemisierung von Carbamoylaminosäuren
JP3129180B2 (ja) Ｄ−ヒスチジンの製法
EP0381997A1 (de) Mikrobiologisch hergestellte N-Acetyl-2,3-didehydroleucin-Acylase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung
DE4402127A1 (de) Carnitinracemase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: DEGUSSA GMBH, 40474 DUESSELDORF, DE

8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: EVONIK DEGUSSA GMBH, 40474 DUESSELDORF, DE

8141 Disposal/no request for examination