CN107937377A - 一种d‑n‑氨甲酰水解酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种D‑N‑氨甲酰水解酶及应用，属于生物工程技术领域。本发明的D‑N‑氨甲酰水解来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)JNU503，可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D‑色氨酸，其可溶性好，催化效率高(转化率99.9％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好，具有很好的应用开发前景。

Description

一种D-N-氨甲酰水解酶及应用

技术领域

本发明涉及一种D-N-氨甲酰水解酶及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-色氨酸(D-Trp)作为一种重要的手性化合物，常被用来合成一些医药中间体，还可以用作非营养型甜味剂，在食品行业倍受欢迎。

D-N-氨甲酰水解酶是属于腈水解酶超家族的第6类，它可以将D-N-氨甲酰氨基酸水解得到的D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯的D-氨基酸。

1998年Yamamoto等人，利用D-N-酰胺酶选择性地水解D-色氨酰胺之后通过化学水解得到D-Trp(Yamamoto et al.Method for producing D-tryptophan,1998,Europeanpatent,EP0853128A1)。类似于酰胺酶方法，1957年Greenstein，等人利用L-氨基酰化酶制备D-Trp，其中只有N-乙酰基-DL-色氨酰胺中的L-对映异构体被水解，剩余的对映异构体可通过化学法脱乙酰化形成D-Trp(Greenstein,J.P.,Methods In Enzymology,1957,3:554–570)。1995年，Yamamoto H等人报道可以D-色氨酸酶从DL-Trp外消旋体中降解L-Trp产生D-Trp，但是该反应的副产物丙酮酸和吲哚可抑制色氨酸酶的活性，因而需要去除(Kawasakiet al.Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1995,59:1938–1943)。目前报道的这些方法都存在理论产率为50％，过程复杂，产率低和对映选择性等缺点。尽管在1949年，Eadie G等人报道可以由D-氨基酸转氨酶使得底物吲哚丙酮酸和D-丙氨酸反应的方法来制备光学纯D-Trp，该方法理论产率为100％，但是活性低，而最终的产率仅为13％(Eadie Get al.Journal ofBiological Chemistry,1949,181:449–458)。海因酶过程是一个由海因消旋酶，海因酶和氨甲酰水解酶组成的三酶级联反应，由于其可以打破传统的50％转化率的限制，而且拥有较高的得率，一直以来被认为是高效经济制备光学纯D-氨基酸的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对已经报道的氨甲酰水解酶的可溶性差以及对底物D-N-氨甲酰色氨酸的低催化活性等问题，提供一种新的氨甲酰水解酶，其具有良好的可溶性，对D构型的氨甲酰氨基酸底物表现出高立体选择性，并对D-N-氨甲酰色氨酸具有高的催化活性。

本发明的第一个目的是提供一种氨甲酰水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述氨甲酰水解酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的第三个目的是提供携带编码所述氨甲酰水解酶基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述氨甲酰水解酶的细胞系。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞是表达氨甲酰水解酶的重组大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以BL21(DE3)为宿主，以pET28a为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因。

本发明的第五个目的是提供制备所述细胞系的方法，包括如下步骤：

1)采用化学合成或PCR方法克隆编码所述氨甲酰水解酶的基因AshyuC；

2)将步骤1)获得的AshyuC基因与质粒pET28a同时用限制性核酸内切酶BamH I和EcoR I双酶切，然后使用T4DNA连接酶进行连接，获得重组表达载体pET28a-AshyuC；

3)将步骤2)获得重组表达载体pET28a-AshyuC转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-AshyuC。

本发明的第六个目的是提供一种氨甲酰水解酶的制备方法，所述方法是培养所述细胞系，获得重组的氨甲酰水解酶。

在本发明的一种实施方式中，培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞的类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生D-氨甲酰水解酶即可。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述细胞系在LB培养基中培养。

在本发明的一种实施方式中，LB培养基含有：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH 7.0。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将表达本发明的氨甲酰水解酶基因的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀达0.5～0.7，在终浓度为0.1～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，28～30℃诱导培养4～8h后，即可高效表达本发明的重组D-氨甲酰水解酶。离心收集菌体并细胞破碎获得粗酶液，再用镍柱进行纯化，获得重组D-N-氨甲酰水解酶。

本发明的第七个目的是提供以重组氨甲酰水解酶作为催化剂在海因酶过程级联反应中催化L-吲哚甲基海因生成D-色氨酸的方法。

在本发明的一种实施方式中，氨甲酰水解酶的用量为1:12～2:5kU/mmol底物。

在本发明的一种实施方式中，所述方法按下述步骤进行：L-吲哚甲基海因的浓度为5～300mmol/L；所述的氨甲酰水解酶的用量为1～50kU/L；海因消旋酶的用量为1～50kU/L；D-海因酶的用量为1～25kU/L；所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH 6～8；所述的反应的温度为20～40℃；所述的级联反应时间以反应完全为准，一般为0.5～48小时。

本发明还提供所述酶在制备含有D-色氨酸的产品中的应用。

有益效果：本发明提供了一种D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-色氨酸，其可溶性好，催化效率高(转化率99.9％)、立体选择性强(e.e.>99.9％)、适用的反应条件温和、环境友好。本发明的氨甲酰水解酶催化效果佳，底物适用性广，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1为基因AshyuC的PCR扩增电泳图谱。M，Marker；1，基因AshyuC

图2为pET28a-AshyuC重组质粒物理图谱。

图3为重组D-N-氨甲酰水解酶的蛋白电泳图。M，Marker；泳道1、2、3分别为重组基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-AshyuC诱导后上清、沉淀及纯化后的纯酶。

图4为D-N-氨甲酰水解酶的选择性分析液相检测图

具体实施方式

D-氨甲酰水解酶的酶活力测定：D-N-氨甲酰水解酶对底物DL-N-氨甲酰色氨酸的酶活力测定体系为：适量酶液、10mmol·L^-1DL-N-氨甲酰色氨酸，于30℃静置反应30min。反应结束后，取样进行液相检测。液相检测条件：色谱柱为Diamonsil Plus C18(25cm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(25：75)，流速为0.2～1mL·min^-1,检测波长为210nm。酶活力单位定义(U)：在30℃下，催化生成1μmol的D-色氨酸所需要的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。

实施例1 D-氨甲酰水解酶基因的克隆

采用一步克隆法克隆上述节杆菌中的D-N-氨甲酰水解酶基因。

(1)首先使用LB培养基，于37℃下过夜培养上述节杆菌。离心获得菌体后，使用常规细菌基因组提取试剂盒获得基因组总DNA。

(2)根据已报道的D-N-氨甲酰水解酶基因设计简并引物(上游引物：CGCGGATTCWTGSSSAAWWACTTR，下游引物：CGCGAATTCTYAGTCWTTSASKTT)，以节杆菌基因组为模板进行PCR，体系如下(μL)：10×PCR Mix 10，上游引物0.2，下游引物0.2，基因组0.2，DNA聚合酶0.2，ddH₂O 9.2。PCR程序为：95℃预变性10min，95℃裂解30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环29次，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，并利用琼脂糖胶回收试剂盒回收500～1000bp区间的条带(图1)，即氨甲酰水解酶基因。所得氨甲酰水解酶基因命名为AshyuC，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：全长948bp，其起始密码子为TTG，终止密码子为TAA。序列中无内含子，编码序列从第1个核苷酸起至945个核苷酸止，所编码的蛋白质序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2 重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-AshyuC的构建及培养

用限制性内切酶BamH I和EcoR I将质粒pET28a和AshycC于37℃水浴中过夜双酶切，次日经琼脂糖凝胶电泳纯化并利用琼脂糖回收试剂盒回收目标片段。37℃下，使用T4DNA连接酶将基因AshyuC与酶切过的质粒pET28进行连接，即得重组表达载体pET28a-AshyuC(图2)。将构建好的重组表达载体pET28a-AshyuC热转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布含卡那霉素抗性LB固体平板，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-AshyuC。挑取阳性克隆子于LB培养基中过夜培养，次日按2％转接量转接入新鲜LB培养中，培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mmol·L^-1IPTG，30℃诱导培养6小时后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于磷酸钾缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)中，超声破碎，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(图3)。由图3可知，目的蛋白全部都在上清中，说明重组酶在大肠杆菌中成功得到可溶表达。

实施例3 D-氨甲酰水解酶的分离纯化

悬浮重组细胞于A液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap FF crude(镍柱)，利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平衡，粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液(20mmol·L^-1磷酸钠，500mmol·L^-1NaCl，1000mmol·L^-1咪唑，pH 7.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋白洗脱下来，获得重组D-N-氨甲酰水解酶。对纯化后的蛋白进行酶活测定(DL-N-氨甲酰色氨酸为底物)及SDS-PAGE分析(图3)。由图3可知，镍柱纯化后，在38kDa左右显示单条带，且杂蛋白较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用HiTrap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化后的D-N-氨甲酰水解酶置换到PBS(100mmol·L^-1，pH 8.0)缓冲液中，进行下一步酶学性质分析。

实施例4

测定D-N-氨甲酰水解酶(AsHyuC)催化不同的DL-N-氨甲酰氨基酸的酶活力，测定方法均按照D-氨甲酰水解酶的酶活力测定方法，区别在于底物不同。以DL-N-氨甲酰色氨酸为底物测得的酶活为100％对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。测定结果如表1所示。

表1 AsHyuC的底物谱

表1显示，AsHyuC能够催化DL-N-氨甲酰苯丙氨酸和DL-N-氨甲酰苯甘氨酸，其相对活力分别只有DL-N-氨甲酰-色氨酸的28％和5％，对底物DL-N-氨甲酰邻氯苯甘氨酸，DL-N-氨甲酰甲硫氨酸，DL-N-氨甲酰亮氨酸，DL-N-氨甲酰异亮氨酸活力非常低。

实施例5

配制100mmol·L^-1不同pH的缓冲液：Tris-HCl(7.0～9.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6.0～8.0)、甘氨酸–NaOH缓冲液(pH 8.0～10.0)碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.5～10.5)。然后以DL-N-氨甲酰色氨酸为底物，测定AsHyuC在不同pH缓冲液的相对酶活力。AsHyuC的最适反应pH为8.0，纯酶比活力为0.6～0.8U·mg^–1。在pH为9.5～10.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，酶活降至20％以下。

实施例6

分别以DL-N-氨甲酰-色氨酸为底物，测定AsHyuC在不同温度(20～55℃)下的酶活，测得的最高酶活定为100％，其他温度下测得的酶活以相对于最高活力的百分比计算。结果显示AsHyuC的最适反应温度为30℃，此时纯酶的比活力为0.7～0.9U·mg^–1。

实施例7

测定AsHyuC对底物DL-N-氨甲酰-色氨酸的动力学参数。酶活测定体系列举如下：磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH 8.0)，DL-N-氨甲酰-色氨酸(0～20mmol·L^-1)。通过计算比酶活来表征反应速率，从而计算动力学参数。测定的AsHyuC对底物DL-N-氨甲酰-色氨酸的动力学参数分别为K_m为1.4mmol·L^-1，V_max为1.14μmol·min^–1·mg^–1。

实施例8

测定AsHyuC催化底物DL-N-氨甲酰水解酶的选择性。反应体系(10mL)为：适量纯化的酶液、10mmol·L^-1DL-N-氨甲酰-色氨酸。于30℃静置反应30min。反应结束后，取样进行液相检测。检测条件：Astec CHIROBIOTICTM T色谱柱(15cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水(40：60)，流速为0.2～1mL/min。由图4可知，该酶具有非常好的立体选择性，仅有D-色氨酸生成。

实施例9 氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-色氨酸

取2～500U所得的重组D-氨甲酰水解酶和2～500U的海因消旋酶(AaHyuA)、1～25UD-海因酶(AtHyuH)于磷酸盐缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，加入5％PEG400，5～300mmol·L^-1L-吲哚甲基海因(添加量如表2所示)，反应液总体积恒定为10mL。将反应置于20～40℃下，取样检测转化过程，条件如下：Diamonsil Plus C18色谱柱(25cm×4.6mm,5μm)，检测波长为210nm，流动相为乙腈：磷酸二氢钾(10～30：90～70)，流速为0.5～1mL/min。结果如表2所示，在上述反应条件下，均可以获得转化率98.0％以上的转化效果，得率达93.4～99.8％，产物的e.e.值>99.9％。

在1L级别进行反应制备D-色氨酸，添加50kUAaHyuA，25kUAtHyuH和50kUAsHyuC，300mmol L-吲哚甲基海因(68.7g)，5％PEG400至磷酸盐缓冲液(pH 6～8,100mmol·L^-1)中，搅拌至反应结束。反应结束后加入盐酸终止反应，离心经阳离子交换树脂纯化得到D-色氨酸，产品纯度达99％以上，产品总收率达82.4％。

表2 D-氨甲酰水解酶应用于海因酶过程制备D-色氨酸

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种D-N-氨甲酰水解酶及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 315

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ala Lys Asn Leu Met Leu Ala Val Ala Gln Val Gly Gly Ile Asp

1 5 10 15

Ser Thr Glu Ser Lys Pro Asp Val Val Ala Arg Leu Ile Ala Leu Leu

20 25 30

Glu Glu Ala Ala Ser Gln Gly Ala Glu Leu Val Val Phe Pro Glu Leu

35 40 45

Thr Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Thr Trp Phe Glu Glu Gly Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Tyr Phe Glu Lys Ser Met Pro Asn Asp Asp Val Arg Pro Leu

65 70 75 80

Phe Glu Arg Ala Lys Asp Leu Gly Val Gly Phe Tyr Leu Gly Tyr Ala

85 90 95

Glu Leu Thr Ser Asp Gln Lys Arg Tyr Asn Thr Ser Ile Leu Val Asn

100 105 110

Lys His Gly Asp Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Met His Leu Pro Gly

115 120 125

His Ala Asp Asn Arg Glu Gly Leu Pro Asn Gln His Leu Glu Lys Lys

130 135 140

Tyr Phe Leu Glu Gly Asp Leu Gly Phe Gly Val Phe Asp Phe His Gly

145 150 155 160

Val Gln Val Gly Met Cys Leu Cys Asn Asp Arg Arg Trp Pro Glu Val

165 170 175

Tyr Arg Ser Leu Ser Leu Gln Gly Ala Glu Leu Val Val Leu Gly Tyr

180 185 190

Asn Thr Pro Asp Phe Val Pro Gly Trp Gln Glu Glu Pro His Ala Lys

195 200 205

Met Phe Thr His Leu Leu Ser Leu Gln Ala Gly Ala Tyr Gln Asn Ser

210 215 220

Val Phe Val Ala Ala Ala Gly Lys Ser Gly Phe Glu Asp Gly His His

225 230 235 240

Met Ile Gly Gly Ser Ala Val Val Ala Pro Ser Gly Glu Ile Leu Ala

245 250 255

Lys Ala Ala Gly Glu Gly Asp Glu Val Val Val Val Lys Ala Asp Ile

260 265 270

Asp Met Gly Arg Pro Tyr Lys Glu Thr Val Phe Asp Phe Ala Ala His

275 280 285

Arg Arg Pro Glu Ala Tyr Gly Ile Ile Ala Glu Arg Lys Gly Arg Gly

290 295 300

Ala Pro Leu Pro Val Ala Phe Asn Val Asn Asp

305 310 315

<210> 2

<211> 948

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttggcgaaaa acttgatgct cgcggttgct caagtcggcg gtatcgatag tacggaatca 60

aaacccgatg tcgtcgcacg cctgattgcc ctgctggaag aagcagcgtc ccagggcgcg 120

gaactggtgg tctttcccga actcacgctg accacgttct tcccgcggac ctggttcgaa 180

gaaggggact tcgagggata cttcgaaaaa tccatgccca atgacgatgt ccggcccctc 240

ttcgaacggg ccaaagacct tggtgttggt ttctatctcg ggtacgcgga actgaccagt 300

gatcagaagc ggtacaacac atcgatcctg gtgaacaagc acggggacat cgtgggcaag 360

taccgcaaga tgcatctgcc gggccatgcc gataaccggg aaggacttcc caaccagcat 420

ctcgaaaaga agtacttcct cgaaggagac ctcgggttcg gtgtcttcga cttccatggc 480

gtgcaggtcg gcatgtgtct ctgcaatgac cggcgctggc ccgaggtcta ccgttcgctt 540

tccctgcagg gagcagaact cgttgtcctg ggctataaca cccccgattt cgttccgggc 600

tggcaggaag agccgcacgc aaagatgttc acgcaccttc tctcgcttca ggcgggcgca 660

taccagaact cggtatttgt cgctgccgcg ggcaagtcgg gcttcgagga cgggcaccac 720

atgatcggtg gatcagcggt cgtcgcgccc agcggcgaaa tcctggccaa agcggccggt 780

gagggcgatg aagtcgtcgt tgtgaaagca gatatcgaca tgggcaggcc ctataaggaa 840

acggtcttcg acttcgccgc ccaccggcgc cccgaagcgt acggcatcat cgccgaaaga 900

aaagggcggg gcgccccgct gcccgtcgcg ttcaacgtga atgactaa 948

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggattcw tgsssaawwa cttr 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgaattct yagtcwttsa sktt 24

Claims (10)

1.一种氨甲酰水解酶，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述氨甲酰水解酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.携带权利要求2或3所述基因的载体。

5.表达权利要求1所述氨甲酰水解酶的细胞系。

6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以BL21(DE3)为宿主，以pET系列任一质粒为载体，表达权利要求1所述的氨甲酰水解酶。

7.一种制备氨甲酰水解酶的方法，其特征在于，培养权利要求5所述的细胞系，获得重组的氨甲酰水解酶。

8.一种D-色氨酸的生产方法，其特征在于，以权利要求1所述的氨甲酰水解酶作为催化剂，催化L-吲哚甲基海因。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在pH 6～10.5的环境中，在海因消旋酶、D-海因酶存在下，添加权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶，控制反应温度为20～55℃，反应0.5～48小时。

10.权利要求1所述的氨甲酰水解酶在制备含有D-色氨酸的产品中的应用。