CN114686464B

CN114686464B - 一种d-n-氨甲酰水解酶在d-色氨酸生产上的应用

Info

Publication number: CN114686464B
Application number: CN202011580200.0A
Authority: CN
Inventors: 谢新开; 陈文静; 胡丽; 范俊英; 徐伟
Original assignee: Hunan Yinhang Biological Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Yinhang Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2023-11-28
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN114686464A

Abstract

本发明涉及D‑N‑氨甲酰水解酶及其在D‑色氨酸生产上的应用，所述水解酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。

Description

一种D-N-氨甲酰水解酶在D-色氨酸生产上的应用

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种D-N-氨甲酰水解酶及其在D-色氨酸生产上的应用。

背景技术

D-色氨酸(D-Trp)是一种手性非常见氨基酸，在饲料行业和医药行业都有很大的市场和应用价值。在食品饲料工业中，D-色氨酸可以作为一种非营养甜味剂或饲料添加剂；在医药行业中，D-色氨酸主要被作为合成一些医药(如他达拉非)的中间体，或半合成肽类抗生素的原料；此外，D-色氨酸具有较高稳定性、广谱抗菌性、毒性小、过敏性低、吸收快、血浓度高、药力持续时间长等优势，是一种有低过敏性和抗药性的优点的非蛋白活性的氨基酸。因此D-色氨酸有很大的市场前景，需求量呈逐年增加的趋势。

目前，D-色氨酸的合成方法有拆分法、酶法合成和不对称合成法等。化学拆分法所用的拆分剂较贵，且具有步骤多、污染环境等问题；酶法拆分则在获得D-构型的同时分离(或消耗掉)一半L-构型；化学的不对称合成法步骤多、收率低、有机试剂容易污染环境；而酶法合成工艺简单、专一性强，条件温和且不污染环境，符合大规模工业化生产的要求。

当前酶法合成D-色氨酸的主要考虑路线是以L-吲哚甲基海因作为原料，使用海因消旋酶、D-海因酶和D-N-氨甲酰水解酶组成的三酶催化反应。一方面由于L-色氨酸的发酵生产已经成为成本较低的色氨酸骨架的主要来源，另一方面，该路线反应得率高,与其他方式相比具有较好的经济优势。

在L-吲哚甲基海因路线中，D-N-氨甲酰水解酶催化D-N-氨甲酰氨基酸水解得到产品D-氨基酸，它的立体选择性和催化速度是决定产物浓度和反应时间的主要因素。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种来源于红细菌Amaricoccussolimangrovi HB172011的酶蛋白，本发明发现，该酶蛋白可以高的立体选择性和催化速度催化D-N-氨甲酰氨基酸水解得到产品D-氨基酸。该酶蛋白是一种高效的D-N-氨甲酰水解酶，所述D-N-氨甲酰水解酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列：

所述D-N-氨甲酰水解酶具有快速水解D-N-氨甲酰-色氨酸生成D-色氨酸和碳酸氢铵的功能；

另一方面，本发明提供编码本发明所述的D-N-氨甲酰水解酶的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的载体(例如常用的大肠杆菌表达载体：pET&Duet Vectors(Novagen)、pGEX Vectors(GE Healthcare)或pCold Vectors(Takara Bio))，所述多核苷酸具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列:

另一方面，本发明提供包含本发明所述的D-N-氨甲酰水解酶、所述的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。

另一方面，本发明还提供一种制备D-色氨酸的方法，其特征在于，以D-N-氨甲酰色氨酸为原料，加入所述D-N-氨甲酰水解酶或所述的宿主细胞制得D-色氨酸。

另一方面，本发明还提供一种制备D-色氨酸的方法，其特征在于，以L-吲哚甲基海因作为原料，加入海因消旋酶、D-海因酶和所述D-N-氨甲酰水解酶或者加入海因消旋酶、D-海因酶和所述的宿主细胞，制得D-色氨酸。

本发明的D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-色氨酸，其可溶性好，催化效率高、立体选择性强。

附图说明

图1为SEQ ID No.1编码的蛋白在大肠杆菌中的表达情况的SDS-PAGE胶图，其中：

1：表达了水解酶的裂解液上清；

2：表达了水解酶的裂解后非水溶部分。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

如无特别说明，本发明中使用的实验方法均为常规方法，基因克隆操作具体可参见前述Sambrook et al.,1989；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)或其它分子生物实验室手册。

i)试剂：DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)和T4连接酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自Axygen公司，L-色氨酸、氰酸钾、D-色氨酸、尿素等试剂都购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

ii)载体和菌株：所使用的表达载体为pET-30a(+)，质粒购自Novagen公司，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，购自天根生化科技(北京)有限公司。

iii)测序与引物合成由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。

iv)基因合成由通用生物系统(安徽)有限公司完成。

V)吲哚甲基海因的合成是利用L-色氨酸和氰酸钾在酸性条件下反应，按照文献Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals,54(2),110-114；2011所述方法制得。D-N-氨甲酰-色氨酸的合成是利用D-色氨酸和尿素在微波条件下反应制得(J.Med.Chem.2016,59,1580-1598)。

实施例1：分子克隆

如SEQ ID No.2所示的基因片段合成后，经NdeI-HindIII消化后，凝胶回收编码片段并与同样位点消化的pET-30a载体用T4连接酶连接。连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于LB琼脂培养基(含有50mg/L的卡那霉素)、挑单菌落至LB液体培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中培养，测序验证克隆正确性。经验证的克隆置于-80℃保藏备用。

实施例2：SEQ ID No.1编码的水解酶在大肠杆菌中的重组可溶表达。

在LB琼脂培养基上将保藏的克隆活化。然后将单菌落接种至LB液体培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中，37℃震荡温育12h。将1mL培养物转接至50mL新鲜的LB液体培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中，37℃震荡温育至OD600达到0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.4mM)在25℃温育16h以诱导蛋白质表达。

温育后，将培养物以4,000g在4℃离心10min，弃上清，收集大肠杆菌细胞。将收集的大肠杆菌细胞重悬于预冷的15mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在4℃超声破碎大肠杆菌细胞。细胞破碎液以6,000g在4℃离心15min去除沉淀，得到的上清为含重组酶的粗酶液。从对应的SDS-PAGE分析的结果看，水解酶(如图1箭头所指)在大肠杆菌宿主中是可溶表达的。

实施例3：SEQ ID No.1编码的水解酶对D-N-氨甲酰-色氨酸的水解实验

将D-N-氨甲酰-色氨酸溶解于100mM pH＝7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中，使得最终反应体系溶液中D-N-氨甲酰-色氨酸的终浓度为3g/L。向上述溶液加入0.4％体积的摇瓶超声酶试剂样品。在35℃，于振荡器上持续震荡(800rpm)2小时，取样并用高效液相色谱检测底物的转化情况。经HPLC定量分析，产物D-色氨酸的浓度为1.1g/L；经手性柱分析，D-色氨酸产物的e.e.值>99.9％。与之对应的，空pET-28a质粒酶液对照中无D-色氨酸产物。

实施例4：SEQ ID No.1编码的水解酶在吲哚甲基海因酶法制备D-色氨酸的应用

在100mL三颈烧瓶进行反应制备D-色氨酸，终体积25mL的反应体系中，含30g/L终浓度L-吲哚甲基海因(750mg)，NaHCO₃终浓度2g/L,MnCl₂终浓度0.5mM，PBS 50mM(pH 7.5),再依次加入下列pET-28a载体在BL21(DE3)宿主经摇瓶表达的超声裂解粗酶液，来自Agrobacterium tumefaciens的海因消旋酶(750uL，GenBank:QCM13411.1)、来自Agrobacterium tumefaciens的D-海因酶(1500uL，GenBank：WP_080866389.1),和SEQ IDNo.1编码的水解酶(2500uL)。反应在搅拌下维持35℃，滴加2M NaOH维持pH 7.5-8.0下进行，通过HPLC检测反应进程。经过夜反应后，反应体系中的微溶底物L-吲哚甲基海因全部消耗，溶液变成透明(底物消失)，D-色氨酸终浓度为26.69g/L，产率99.8％。

具体数据如表1.

表1

以上结果表明，本发明的D-N-氨甲酰水解酶可作为催化剂应用于海因酶过程制备光学纯D-色氨酸，其可溶性好，催化效率高、立体选择性强。

本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，并不影响本发明目的的实现。本实施例仅提供一种具体实现方案。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 湖南引航生物科技有限公司

<120> 一种D-N-氨甲酰水解酶在D-色氨酸生产上的应用

<130> 2020

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> PRT

<213> Amaricoccus solimangrovi HB17201

<400> 1

Met Thr Arg Lys Leu Thr Leu Ala Val Ala Gln Leu Gly Pro Ile Ala

1 5 10 15

Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Arg Arg Leu Leu Ala Met Leu

20 25 30

Arg Glu Ala Ala Gly Arg Gly Ala Thr Phe Val Val Phe Pro Glu Thr

35 40 45

Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp Phe Phe Glu Asp Gln Ala Glu

50 55 60

Val Asp Ala Trp Phe Glu Thr Glu Met Pro Asn Ala Ala Thr Leu Pro

65 70 75 80

Leu Phe Glu Ala Ala Ala Glu Leu Gly Val Gly Phe Asn Leu Gly Tyr

85 90 95

Ala Glu Leu Thr Thr Glu Asp Gly Pro Val Arg His Phe Asn Thr Ser

100 105 110

Ile Leu Val Asp Thr Lys Gly Arg Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Val

115 120 125

His Leu Pro Gly His Ala Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Trp Gln His

130 135 140

Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asn Leu Gly Phe Pro Val Tyr

145 150 155 160

Glu Met Asp Ser Ala Lys Val Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg

165 170 175

Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile

180 185 190

Cys Gly Gly Phe Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His

195 200 205

Asp His Leu Thr Ser Tyr His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser

210 215 220

Tyr Gln Asn Gly Val Trp Gly Ala Ala Ala Ala Lys Ala Gly Met Glu

225 230 235 240

Glu Gly Ser Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Cys Ala Pro Thr Gly

245 250 255

Glu Ile Val Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Asp Glu Val Ile Thr Ala

260 265 270

Ala Cys Asp Leu Asp Ala Cys Arg His Ile Arg Asp Glu Ile Phe Asn

275 280 285

Phe Lys Arg His Arg Gln Pro Arg His Tyr Gly Leu Ile Ser Glu Val

290 295 300

Glu Ala Glu Pro Leu Thr Val Ala

305 310

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

atgacccgca aactgaccct ggcagtggcc cagctgggtc cgattgcccg tgcagaaacc 60

cgtgaacagg tggtgcgccg cctgctggcc atgctgcgtg aagccgcagg ccgtggcgca 120

acctttgtgg tgtttccgga aaccgcactg accaccttct ttccgcgttg gttctttgaa 180

gatcaggcag aagtggatgc atggtttgaa accgaaatgc cgaatgcagc aaccctgccg 240

ctgtttgaag ccgcagccga actgggcgtg ggctttaatc tgggttatgc agaactgacc 300

accgaagatg gcccggtgcg ccattttaat accagtattc tggttgatac caaaggtcgc 360

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ccgtggcagc atctggaaaa gcgttatttt gaaccgggta atctgggttt tccggtttat 480

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cataatccgc cggttccgca gcatgatcat ctgaccagtt atcatcatct gctgagcatg 660

caggcaggta gctatcagaa tggtgtgtgg ggtgcagccg ccgccaaagc cggtatggaa 720

gaaggtagta tgctgctggg ccatagttgt atttgtgcac cgaccggcga aattgtggcc 780

ctgagcagca ccctgggtga cgaagtgatt accgccgcct gcgatctgga tgcctgtcgc 840

catattcgcg atgaaatttt caattttaag cgtcatcgcc agccgcgtca ttatggtctg 900

attagcgaag tggaagccga accgctgacc gttgcataa 939

Claims

1.一种制备D-色氨酸的方法，以D-N-氨甲酰色氨酸为原料，加入D-N-氨甲酰水解酶或宿主细胞制得D-色氨酸，其特征在于，所述宿主细胞包含编码所述D-N-氨甲酰水解酶的多核苷酸，或者包含所述多核苷酸的载体，所述D-N-氨甲酰水解酶为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，所述多核苷酸为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸源于红细菌Amaricoccussolimangrovi HB172011。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

4.一种制备D-色氨酸的方法，其特征在于，以L-吲哚甲基海因作为原料，加入海因消旋酶、D-海因酶和D-N-氨甲酰水解酶或者加入海因消旋酶、D-海因酶和宿主细胞，制得D-色氨酸，其特征在于，所述宿主细胞包含编码所述D-N-氨甲酰水解酶的多核苷酸，或者包含所述多核苷酸的载体，所述D-N-氨甲酰水解酶为如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，所述多核苷酸为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸源于红细菌Amaricoccussolimangrovi HB172011。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

7.一种如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的D-N-氨甲酰水解酶在制备D-色氨酸中应用。