CN101240285A - 一种头孢菌素c酰化酶及其载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CPC酰化酶，该酶的编码基因为SEQ ID NO：4所示的DNA序列以及与它具有80％以上同源性的DNA序列。本发明还公开了含有编码CPC酰化酶的载体和转化体以及该酶的用途。该酶表达活性高、催化活性高、并且产物耐受性高，能够高效催化底物CPC生成产物7－ACA。

Description

一种头孢菌素C酰化酶及其载体和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说涉及一种头孢菌素C酰化酶，含有该头孢菌素C酰化酶基因的表达载体；以及用该酶制备7-氨基头孢烷酸的方法。

背景技术

头孢菌素类药物(Cephalosporins)与青霉素一样，是一族β-内酰胺类广谱抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并加速细胞壁的破坏而起到杀菌的作用。头孢菌素的抗菌部位为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)，由双氢噻嗪环和β-内酰胺环融合而成，它是各类半合成头孢菌素类抗生素药物的重要中间体。7-ACA主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过酶法或化学法裂解脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到。酶法具有工艺简单、安全、高效、无污染及产品质量稳定等优点，与传统的、污染严重的化学法相比具有较大的竞争优势，因而用酶法裂解CPC生产7-ACA已成为发展趋势。用酶法裂解生产7-ACA，分为一步酶法和两步酶法。其中，两步酶法是利用来源不同的两种酶进行两步催化反应：首先，CPC在D-氨基酸氧化酶(D-AminoAcid Oxidase，DAAO)的作用下，生成一个具有酮基的中间体，此中间体不稳定，易被同时生成的过氧化氢(H₂O₂)氧化为戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)，然后其在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去侧链，生成7-ACA。一步酶法是利用头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin Cacylase，CPC酰化酶)直接催化头孢菌素C，脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链，一步生成7-ACA。与两步酶法相比，一步酶法更为简单、便捷，因而日益受到重视。

CPC酰化酶与GL-7-ACA酰化酶，均属于头孢菌素酰化酶，只是二者的底物特异性不同。天然的GL-7-ACA酰化酶只能催化GL-7-ACA生成7-ACA，不能催化CPC底物；而天然的CPC酰化酶虽然能够催化CPC一步生成7-ACA，但其对CPC的催化活性只为GL-7-ACA催化活性的2-4％(Li Y等.Eur JBiochem，1999，262(3)：713-719.Saito Y等.Appl Envir Microb，1996，62(8)：2919-2925)。

产生CPC酰化酶的天然菌株主要为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。已经克隆测序的基因来自Pseudomonas sp.N176(USP 5,192,678)和Pseudomonas sp.SE83acyII(Matsuda等.J.Bacteriol.，1987，169：5821-5829)等。目前对CPC酰化酶的研究主要集中在对CPC酰化酶以及GL-7-ACA酰化酶进行改造，实现底物特异性转移以提高它们对CPC的活性和特异性。2001年，对来源于Pseudomonas sp.KAC-1的GL-7-ACA酰化酶的三维结构进行了成功测定，该结构表明更为广泛的相互作用发生在GL-7-ACA酰化酶与底物GL-7-ACA的戊二酰侧链之间(KimY等.Chem.Biol.，2001，8：1253～1264)。对源于P.diminuta N176的CPC酰化酶的突变研究表明，一种在215位、296位和309位三个位点进行突变的突变体表现出了比GL-7-ACA更高的CPC酶活，在一定程度上实现了底物特异性的转移(Pollegioni L等.Protein Science，2005，14(12)：3064～3076)。对Pseudomonasstrain SE83 acyII的研究(WO 2005/014821 A1)也取得了显著进展，通过对Val122Ala-Gly140Ser-Phe297Arg(Phe58βArg)-Ile314Thr(Ile75βThr)-Ile415Val(Ile176βVal)-Ser710Cys(Ser471βCys)等多点突变提高了对底物CPC的活性和特异性，CPC酶活相对于野生菌提高8～10倍左右，并能有效地用于一步酶法催化CPC生产7-ACA。因此通过基因工程方法对CPC酰化酶进行改造，是提高CPC酰化酶活性和底物特异性的有效途径。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种催化活性高且产物耐受性高的CPC酰化酶。

本发明第二个目的是提供含有上述CPC酰化酶编码基因的载体和转化体。

本发明第三个目的是提供一种上述CPC酰化酶在制备7-氨基头孢烷酸上的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明一种CPC酰化酶，其编码基因为下述DNA序列之一：

(a)具有SEQ ID NO：4所示的DNA序列；

(b)与SEQ ID NO：4所示的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质；

(c)在高严谨条件下可与SEQ ID NO：4所限定的DNA序列杂交，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质的DNA序列。

上述CPC酰化酶，其中所述(b)优选为具有85％以上同源性；更优选的(b)为具有90％以上的同源性。

上述CPC酰化酶，其具有如下的氨基酸序列：在SEQ ID NO：3的氨基酸序列基础上，至少下列一个位点的氨基酸被其他氨基酸所替换，其中所述的氨基酸为：263位精氨酸(Arg263)、270位甲硫氨酸(Met270)、295位脯氨酸(Pro295)、296位组氨酸(His296)、309位组氨酸(His309)、666位亮氨酸(Leu666)、675位丙氨酸(Ala675)及677位亮氨酸(Leu677)。所述的氨基酸残基均位于底物结合及催化的活性中心部位以及底物进出活性中心的通道位置上。

上述CPC酰化酶，优选突变为：在SEQ ID NO：3的氨基酸序列基础上，至少下述一个位点的氨基酸被所述的氨基酸替换：

270位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸(Met270Phe)；

309位组氨酸替换为缬氨酸(His309Val)；

675位丙氨酸替换为甘氨酸(Ala675Gly)；

677位亮氨酸替换为苯丙氨酸(Leu677Phe)。

本发明一种CPC酰化酶CAase-TU1，具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。CAase-TU1是在SEQ ID NO：4所编码氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的基础上，其第677位的亮氨酸被苯丙氨酸取代(Leu677Phe)。

本发明一种CPC酰化酶CAase-TU2，具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。CAase-TU2是在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的基础上，其第675位的丙氨酸被甘氨酸取代(Ala675Gly)。

所述的SEQ ID NO：4所示的DNA序列，是根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，面向大肠杆菌宿主表达所需要的优选密码子和基因高表达所需要的适宜鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)碱基含量，反向设计并从头合成的新的DNA序列，该DNA序列具有如下特征：原天然CPC酰化酶acyII基因(SEQ ID NO：2，2325bp)的高度稀有密码子(使用频率为10％以下)从46个下降到0个；一般稀有密码子(使用频率为10～20％)从76个下降到43个；原天然CPC酰化酶acyII基因(SEQ ID NO：2)中的GC碱基含量从69.0％下降到59.8％；同时，在基因的1060～1065位碱基处引入EcoR I限制性内切酶位点GAATTC，并删除了原基因SEQ ID NO：2内部的EcoRI、BamHI和HindIII的酶切位点。

所述的SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，是在来自Pseudomonas sp.SE83acyII的野生CPC酰化酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的基础上，在Val122Ala-Gly140Ser-Phe58βArg-Ile75βThr-Ile176βVal-Ser471βCys六个位点引入氨基酸突变而得到的(WO 2005/014821 A1)。所述的来自Pseudomonas sp.SE83 acy II的野生的CPC酰化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，由774个氨基酸残基组成，包括239个氨基酸残基的α亚基序列和535个氨基酸残基的β亚基序列，其原始CPC酰化酶基因序列为SEQ ID NO：2所示的DNA序列。

含有上述本发明CPC酰化酶编码基因的重组表达载体、宿主菌均属于本发明的保护范围。

按照本领域技术人员熟知的方法，可以构建含有上述CPC酰化酶编码基因的重组载体和转化体。

含有上述CPC酰化酶编码基因的表达载体，可以是组成型或诱导型的载体。

所述的诱导型表达载体，包括pET或其它系列诱导型表达载体。如一种携带CPC酰化酶突变体基因的诱导型表达载体PET28-CPCacy(见图1)。

所述的组成型表达载体，包括与麦芽糖结合蛋白MBP融合表达的pMKC组成型表达载体(Y U H.M.等，Journal of Molecular Biocatalysis B：Enzymatic，2006，43，118-123)及其它高效组成型表达载体。如携带CPC酰化酶突变体基因的一个组成型表达载体pMKC-CPCacy(见图2)。

本发明采用诱导型表达载体，其所述的宿主菌优选为E.coli BL21(DE3)(Promega公司)或JM109(DE3)(鼎国公司)或其它适宜菌株等作为受体菌。

本发明采用组成型表达载体，其宿主菌优选为E.coli TB1(New EnglandBiolab公司)、E.coli JM105(赛百盛公司)或其它适宜菌株等作为受体菌。

上述CPC酰化酶转化体的构建方法，可以采用常规的氯化钙法或电穿孔转化法(Sambrook J等.Molecular Cloning：A Laboratory manual.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)。

上述CPC酰化酶、携带有上述CPC酰化酶编码基因的重组表达载体或转化体在制备7-氨基头孢烷酸上的应用。

本发明CPC酰化酶突变体的粗酶液首先采用硫酸铵饱和沉淀进行初步纯化，进一步采用树脂、硅胶或亲和层析柱等载体进行固定化，即可用于从CPC制备7-氨基头孢烷酸。

本发明具有如下优点：(1)、本发明CPC酰化酶基因表达活性高，可以在重组大肠杆菌中高活性表达；(2)、本发明CPC酰化酶催化活性高，且成功实现了底物特异性的转移，对底物CPC的催化活性是GL-7-ACA的4～6倍左右；(3)、本发明CPC酰化酶的产物耐受性高。最终，采用本发明提供的改良型CPC酰化酶，能够高效催化底物CPC生成产物7-ACA，为7-ACA的一步酶法工业化生产奠定了坚实基础。

附图说明

图1.携带CPC酰化酶基因的重组质粒pET28-CPCacy示意图

图2.携带CPC酰化酶基因的重组质粒pMKC-CPCacy示意图

图3.重组大肠杆菌诱导型和组成型表达CPC酰化酶SDS-PAGE图

其中M：蛋白质分子量标准；

1为JM105/pMKC-CPCAcy，其中68kDa条带为CPC酰化酶α亚基与MBP融合表达产物，58kDa条带为CPC酰化酶β亚基；

2为BL21(DE3)/pET28a-CPCacy，其中58kDa条带为CPC酰化酶β亚基，28kDa条带为CPC酰化酶α亚基(含3.4kDa融合肽链)

图4.本发明CPC酰化酶突变体催化底物CPC合成7-ACA的的高压液相色谱(HPLC)图，其中A：CPC标准品；B：7-ACA标准品；C：诱导型表达收获的CPC酰化酶的催化反应液。

具体实施方式

实施例1

头孢菌素C酰化酶基因序列的设计与合成

(1)本发明CPC酰化酶基因设计：采用Genebank中Pseudomonas sp.SE83cephalosporin acylase II的蛋白质序列(SEQ ID NO：1，Genbank AAA25690)，同时引入SEQ ID NO：3中的六个突变位点：Val122Ala-Gly140Ser-Phe58βArg-Ile75βThr-Ile176βVal-Ser471βCys(WO2005/014821A1)，利用在线服务器DNAWorks(网址：http://helixweb.nih.gov/dnaworks)反向设计CPC酰化酶的基因序列。根据大肠杆菌密码子简并性及偏好性，上述面向大肠杆菌宿主高表达而重新设计的CPC酰化酶基因序列为SEQ ID NO：4，该序列中E.coli一般稀有密码子(使用频率低于20％)从野生基因SEQ ID NO：2的76个降低至43个，占全基因的5.6％；高度稀有密码子(使用频率低于10％)从SEQ ID NO：2的46个下降为0；GC含量从SEQ ID NO：2的68.99％降低至57.81％，从而有利于在大肠杆菌中获得高活性的CPC酰化酶。

(2)新基因SEQ ID NO：4采用Assembly PCR合成所需的寡DNA片断(Oligos)设计：用DNAWorks服务器将全长为2328bp的CPC酰化酶基因SEQID NO：4分为两段进行Oligos的设计。第I段总长为1065bp，DNAWorks服务器输出34条Oligos用于该基因的合成。第II段总长为1263bp，DNAWorks服务器输出38条Oligos用于该基因的合成。各Oligos的长度约为50bp，Oligos序列之间有20-25bp左右的重叠区。各序列重叠部分退火温度为58±1.9℃。在第I段基因两端通过引物A_up/A_low引入BamH I/EcoR I酶切位点。A_up序列为：CGGGATCCATGACGATGGCGGCGAAA(下划线为BamHI酶切位点)，A_low序列为：GGAATTCGCGGTCCGCACCACCGCGAACTGCAAT(下划线为EcoRI酶切位点)。在第II段基因两端通过引物B_up/B_low引入EcoR I/Hind III酶切位点。B_up序列为：GGAATTCGATATTGTGGAAACCCGTCA(下划线为EcoR I酶切位点)，B_low序列为：CCCAAGCTTTCACGCCGGCACTA(下划线为Hind III酶切位点)。

(3)第I段基因的Assembly PCR合成过程：由北京三博远志生物技术有限公司合成34条Oligos序列和引物。将各Oligos以等浓度混合，取7μL混合液为模板，采用Pfu DNA聚合酶进行高保真扩增。PCR扩增反应体积为20ul，Pfu DNA聚合酶的浓度根据使用说明书的推荐确定；浓度为2.5mM的单核苷酸混合液(dNTPs)2.0ul；94℃变性5min后，进入35个循环的变性-退火-延伸过程(94℃，30s；58℃，45s；72℃，2min)，最后72℃延伸10min。该步骤可获得含第I段基因的混合液；以该混合液为模板，用第(2)步设计的基因两端引物A_up和A_low再次进行PCR扩增，扩增反应条件同上，即可获得最终的1065bp第I段目标基因。

(4)第II段基因的Assembly PCR合成过程：基本同第I段基因。Oligos和引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。将各Oligos以等浓度混合，取7μL混合液为模板，采用Pfu DNA聚合酶进行高保真扩增。扩增反应条件和合成过程同上。最后以第(2)步设计的B_up和B_low为基因两端引物，再次进行PCR扩增，扩增反应条件同上，即可获得最终的1263bp第II段目标基因。

(5)第I段和第II段基因的连接：将人工合成的两段基因以及质粒pUC18分别采用限制性内切酶BamH I/EcoR I和EcoR I/Hind III双酶切。pUC18和各限制性内切酶和缓冲液均从宝生物工程(大连)有限公司购得。酶切反应体积20μL，质粒用量4μL，基因片断(PCR产物)10μL，各酶用量1μL，缓冲液2μL，采用无菌水补足20μL。37℃反应4小时，采用常规0.7％琼脂糖凝胶电泳，分别回收得到基因片断和质粒骨架。采用T4DNA连接酶(Promega公司)在4℃进行连接反应14小时。将连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)，涂布LB平板(氨苄青霉素抗性，Amp+)，挑选阳性克隆，进行摇瓶培养12h。收获细胞，采用常规试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取小量质粒进行常规酶切和电泳验证，获得重组质粒pUC18-acy，即获得了本发明CPC酰化酶基因的人工设计全序列(SEQ ID NO：4)。提交该CPC酰化酶基因进行DNA测序分析(北京三博远志生物技术有限公司)，结果表明，克隆获得的CPC酰化酶基因的全DNA序列与设计结果完全一致(见SEQ ID NO：4)。

实施例2

诱导型表达载体pET28-CPCacy与转化体BL21(DE3)/pET28-CPCacy的构建

(1)质粒pET28-CPCacy的构建：对实施例1获得的质粒载体pUC18-acy采用BamHI/HindIII双酶切。酶切反应体积20μL，质粒用量4μL，各酶用量1μL，缓冲液2μL，采用无菌水补足20μL。37℃反应过夜，获得酶切产物CPC酰化酶基因。采用相同方法酶切质粒载体pET28a(No vagen公司)，获得pET28a的线性质粒骨架。用PCR产物回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)纯化酶切产物后，将CPC酰化酶基因和pET28a的线性质粒骨架在4℃采用T4DNA连接酶进行连接反应14h。将连接反应物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布LB平板(卡那霉素抗性，Kan+)，挑选阳性克隆，进行摇瓶培养12h。收获细胞，采用常规试剂盒提取小量质粒进行常规酶切和电泳验证，获得重组质粒pET28-CPCacy(见图1)。

(2)转化体BL21(DE3)/pET28-CPCacy的构建：采用电穿孔转化法将重组质粒pET28-CPCacy转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Promega公司)。取1μl纯化后的质粒于一个1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电转杯一起置于冰上预冷；将50μl BL21(DE3)感受态细胞转移至此1.5ml的离心管中，小心混匀，冰上放置10min；打开电转仪，调节电压为1250V；将质粒和感受态细胞的混合物转移至已预冷的电转杯中，轻轻敲击使得混合物均匀进入电转杯的底部，同时注意混合物中不能有气泡。将电转杯放入电转化仪，按下电击键，听到蜂鸣声后，向杯中迅速加入800μl的LB液体培养基(配方见《分子克隆指南》)，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。置于37℃，220rpm摇床培养30min。取50μl菌液涂布于含有50μg/ml卡那抗生素的LB固体培养基平板，放入37℃培养箱培养20小时，得基因重组菌BL21(DE3)/pET28-CPCacy。

实施例3

组成型CPC酰化酶表达载体与转化体的构建

质粒pMKC-CPCacy的构建方法同实施例2(1)，采用BamHI/HindIII双酶切，获得CPC酰化酶全基因。同时采用相同方法酶切质粒载体pMKC-Acy(YUH.M.等.Journal of Molecular Biocatalysis B：Enzymatic，2006，43，118-123)，获得pMKC的线性质粒骨架。用PCR产物回收试剂盒纯化后，将CPC酰化酶基因和pMKC的线性质粒骨架在4℃采用T4 DNA连接酶进行连接反应14h，构建组成型表达重组质粒pMKC-CPCacy(见图2)。转化方法同实施例2(2)，采用电穿孔转化法将pMKC-CPCacy转化大肠杆菌E.coli JMl 05(天根生化科技(北京)有限公司)，获得转化体JM 105/pMKC-CPCacy。

实施例4

采用Overlap PCR方法构建CPC酰化酶CPCase-TU1基因及其转化体

从本发明基因序列SEQ ID NO：4出发，通过三步Overlap PCR扩增，引入Leu438βPhe突变，构建改良型CPC酰化酶CPCase-TU1。第一步以实施例2中pET28-CPCAcy质粒为模板，采用Mup/A438引物进行扩增。其中，Mup的序列为：CCGGAATTCGATATTGTGGAAACCCGTCAT(下划线部分为EcoRI酶切位点)；A438的序列为：ACTAACCGGGTTAAACAGTGCGGCCCA(下划线部分为突变引入位点)；Pfu DNA聚合酶扩增常规条件扩增，退火温度60℃，即可获得438β突变位点前片断。第二步扩增采用B438/Mdown引物，其中B438的序列为：TGGGCCGCACTGTTTAACCCGGTTA(下划线部分为突变引入位点)，Mdown的序列为：CCCAAGCTTTCACGCCGGCACTAATTCTT(下划线部分为HindIII酶切位点)；其它条件同第一步扩增，即可获得438β突变位点后片断。第三步扩增采用上述Mup/Mdown引物，以第一、第二步扩增获得的片断为模板，其它条件同上，即可获得Leu438βPhe突变的全基因序列。

对Leu438βPhe突变的基因序列和实施例2所得pET28-CPCAcy质粒分别进行EcoRI/HindIII双酶切，酶切条件同实施例2(1)。常规0.7％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收突变基因序列以及pET28-CPCAcy的骨架大片断。采用T4DNA连接酶4℃过夜连接14hr，电穿孔法转入JM109感受态细胞，固体LB培养基37℃过夜培养至长出大小适中的单菌落。挑取单菌落接入卡那霉素抗性LB液体培养基，37℃、200rpm过夜培养；提质粒，即可获得β亚基Leu438βPhe突变的诱导型表达质粒pET28-CPCaseTU1。电穿孔转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，即得转化体BL21(DE3)/pET28-CPCaseTU1。具体实验方法同实施例2。

实施例5

采用Overlap PCR方法构建CPC酰化酶CPCase-TU2基因及其转化体

方法同实施例4，从本发明基因序列SEQ ID NO：4出发，通过三步OverlapPCR扩增，引入Ala436βGly-Leu438βPhe双突变，构建改良型CPC酰化酶CPCase-TU2。其中，第一步扩增采用Mup/A436-438引物对，Mup同上，A436-438的序列为：ACTAACCGGGTTAAACAGACCGGCCCA(下划线部分为突变引入位点)；第二步扩增采用B436-438/Mdown引物，Mdown同上，B436-438的序列为：TGGGCCGGTCTGTTTAACCCGGTTA(下划线部分为突变引入位点)，第三步扩增以上述第一、第二步扩增获得的436β、438β双突变前后片断为模板，其它条件同上，即获得Ala436βGly-Leu438βPhe双突变的基因序列。

转化方法同实施例4，进一步成功构建β亚基Ala436βGly-Leu438βPhe双突变的诱导型表达质粒pET28-CPCaseTU2。电穿孔转化大肠杆菌宿主BL21(DE3)，即得转化体BL21(DE3)/pET28-CPCaseTU2。

实施例6

本发明CPC酰化酶基因在诱导型和组成型转化体中的表达试验

将实施例2和实施例3获得的本发明CPC酰化酶基因SEQ ID NO：4的诱导型表达菌株BL21(DE3)/pET28-CPCacy和组成型表达菌株JM105/pMKC-CPCacy进行平行培养。首先在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中(培养基组成为：50ml/300ml摇瓶，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)分别接种单菌落，37℃、200rpm培养12h，制作种瓶。

从种瓶中按照2％接种量转接到含50mg/L卡那霉素的发酵培养基中(培养基为：玉米浆50g/L，酵母膏10g/L，NH₄Cl 2.5g/L，甘油5.0g/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 16.4g/L，pH 7.5)，28℃、200rpm条件下摇瓶培养24小时。对于诱导型表达转化体BL21(DE3)/pET28-CPCacy，采用终浓度为lmM/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导CPC酰化酶的表达。对于组成型表达转化体JM105/pMKC-CPCacy，不加IPTG，直接在28℃相同条件下摇瓶培养24小时。

收集菌体，进行常规十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺蛋白质凝胶电泳(SDS-PAGE)检测CPC酰化酶的表达，本发明CPC酰化酶基因SEQ ID NO：4的诱导型和组成型表达都获得了大量的活性蛋白(见图3)。

以CPC为底物，采用高压液相色谱法(HPLC)测定CPC酰化酶的酶活。首先制备粗酶液：4ml菌液在4℃、8000rpm离心10min，所得沉淀用0.1MTris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤两次后重悬于2ml缓冲液，冰浴超声10min(320W，3×3×60次)；在4℃，15000rpm离心5min获取上清；加入100μl底物(0.1M Tris-HCl缓冲液配制60mg/ml CPC溶液，pH 8.0)，并用缓冲液补加至200μl，37℃反应5min后，加入600μl终止液(20％乙酸与0.05mol/LNaOH溶液2∶1体积混合)。8000rpm离心3min，取500μl上清液进行HPLC分析(phenomenexC18柱，150×4.6mm；流动相：15％甲醇，7.5％乙腈，1％乙酸；254nm检测吸光度)，测定CPC酰化酶的酶活。酶活单位定义为每分钟催化生成1μmol 7-ACA所需的酶量。酶活测定结果表明，BL21(DE3)/pET28-CPCacy和JM105/pMKC-CPCacy对底物CPC的催化活性分别为2950U/L和3120U/L，分别是专利文献WO 2005/014821 A1中报道的SEQ ID NO：3所示CPC酰化酶活性(1207U/L)的2.4倍和2.6倍。

实施例7

本发明CPCase-TU1催化CPC生成7-ACA试验

对实施例4获得的诱导型转化体BL21(DE3)/pET28-CPCaseTU1进行摇瓶培养。培养条件同实施例6。收集50ml菌液，用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤后低温超声破碎，细胞破碎后的粗酶液直接用于3％CPC钠盐到7-ACA的催化转化，28℃下摇床振荡反应1h。取样500μl，用HPLC法分析，结果(见图4)表明，本发明CPC酰化酶CPCase-TU1可以成功地将底物CPC一步转化生成7-ACA。

按照实施例6所述的催化条件，同时以CPC和GL-7-ACA为底物进行催化反应，酶活分析结果表明，CPCase-TU1对CPC底物的催化活性达到3000U/L，而对GL-7-ACA底物的催化活性为625U/L，说明成功实现了底物特异性的转移。

根据实施例6所述的反应体系，在100μl CPC溶液和相同酶活的原CPC酰化酶与CPCase-TU1(突变CPC酰化酶)混合液中加入终浓度为1.25g/L的7-ACA，考察产物抑制情况。37℃温浴5min后加入600μl终止液(50mM NaOH与20％冰醋酸1∶2混合)；离心后取500μl上清与100μl 0.5％(w/v)PDAB甲醇溶液混合，37℃温浴10min后测定415nm吸光度。结果表明，CPCase-TUl的保留酶活为初始的75％，比SEQ ID NO：3所示的CPC酰化酶提高19％。

序列表

Claims (10)

1、一种CPC酰化酶，其编码基因为下述核苷酸序列之一：

(a)具有SEQ ID NO：4所示的DNA序列；

(b)与SEQ ID NO：4所示的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质；

(c)在高严谨条件下可与SEQ ID NO：4所限定的DNA序列杂交，且编码具有CPC酰化酶活性的蛋白质的DNA序列。

2、按照权利要求1所述的CPC酰化酶，其特征在于其氨基酸序列为：在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列基础上，至少下列一个位点的氨基酸被其他氨基酸所替换，所述的氨基酸为：263位精氨酸、270位甲硫氨酸、295位脯氨酸、296位组氨酸、309位组氨酸、666位亮氨酸、675位丙氨酸和677位亮氨酸。

3、按照权利要求2所述的CPC酰化酶，其特征在于其氨基酸序列为：在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列基础上，至少下述一个位点的氨基酸被所述的氨基酸替换：270位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸；

309位组氨酸替换为缬氨酸；

675位丙氨酸替换为甘氨酸；

677位亮氨酸替换为苯丙氨酸。

4、按照权利要求2或3所述的CPC酰化酶，其特征在于所述的CPC酰化酶在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列基础上，其第677位的亮氨酸被苯丙氨酸取代，其具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

5、按照权利要求4所述的CPC酰化酶，其特征在于所述的CPC酰化酶在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列基础上，其第675位的丙氨酸被甘氨酸取代，其具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

6、含有权利要求1所述CPC酰化酶编码基因的重组表达载体。

7、含有权利要求1所述CPC酰化酶编码基因的宿主菌。

8、按照权利要求7所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌为E.coliBL21、JM109、E.coli TB1或E.coli JM105等。

9、权利要求1至5任一所述的CPC酰化酶在制备7-氨基头孢烷酸上的应用。

10、权利要求6所述的重组表达载体在制备7-氨基头孢烷酸上的应用。

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