CN102978192A - 突变型头孢菌素c酰化酶及其制备方法和转化7-aca的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种突变型头孢菌素C酰化酶，将具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。解决了现有技术中突变型头孢菌素C酰化酶催化活性小，酶活性受外界影响大，存在产物抑制的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别地，涉及一种突变型头孢菌素C酰化酶，本发明的另一方面还提供了前述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法和应用。
背景技术
7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是医药工业生产半合成头孢菌素抗生素的重要中间体，工业化生产7-ACA主要用化学法和酶法。目前国内7-ACA生产大多仍采用化学法，但由于该方法需采用大量昂贵的化学试剂、反应条件苛刻、环境污染严重、成本高等缺陷，而酶法生产7-ACA优势明显，工艺简单、反应条件温和、生产环保、成本低、质量优等特点。化学法技术成熟，进一步上升的空间较小；而酶法技术先进，绿色环保，仍具备较大上升空间。随着国家环保的重视、及对可持续发展的绿色工业追求，酶法取代化学法是必然的趋势。
酶法生产7-ACA可分为两步酶法和一步酶法。目前主要研究及工业化应用的是两步酶法，其过程主要是头孢菌素C钠盐在固定化D-氨基酸氧化酶催化下被氧化成α-酮己二酸单酰7-ACA，α-酮己二酸单酰7-ACA迅速转化为GL-7-ACA，GL-7-ACA在固定化GL-7-ACA酰化酶催化作用下裂解为7-ACA和戊二酸，再经过结晶和干燥得到7-ACA产品。一步酶法是利用头孢菌素C酰化酶对底物CPC进行直接催化生成7-ACA，相比于两步酶法，一步酶法具有生产工艺简单、设备要求低及生产成本低等优点，但是头孢菌素C酰化酶对CPC的催化活性低，仅为GL-7-ACA酰化酶的2~4%。
为了提高头孢菌素C酰化酶的催化活性，目前对头孢菌素C酰化酶进行突变的方式主要有以下几个：1、取头孢菌素酰化酶基因序列，在270位点引入苯丙氨酸，在215、296、416、417、261、271、294、297、307、308和309等位点引入突变氨基酸，经密码子优化后克隆入pET24，转化入大肠杆菌BL21(DE3)获得含有头孢菌素酰化酶突变基因的转化子，发酵检测发现在这些位点的突变提高了头孢菌素酰化酶的CPC酰化酶活性。2、将来源于假单胞杆菌N176中头孢菌素C酰基转移酶基因（vac)序列，设计出两条适用于顶头孢霉中表达的基因序列（ecs1和ecs2)，利用基因工程技术转化入顶头孢霉获得包含有ecs1或ecs2的转化子，在转化子发酵液中检测到7-ACA转化率为38.4%。3、、基于来源于假单胞杆菌SE83的CPC酰化酶基因（acyⅡ）序列，通过分子模拟技术进行理性设计，应用定点突变和饱和突变技术对V121α、G139α、F58β、I75β、I176β和S471β等六个点进行突变，密码子优化后转化入大肠杆菌得到转化子后检测突变效果，V121αA、G139αS、F58βN、I75βT、I176βV和S471βC等六倍突变体S12的CPC酰化酶活性最高，高达712U/L，对CPC的转化率也高达98%。3、基于假单胞杆菌SE83的CPC酰化酶基因（acyⅡ）氨基酸序列，在引入S12的6个突变点的基础上进行了L677F和A675G双点突变得到突变体CAase-TU2，经密码子优化后克隆入pET28a(+)和pMKC载体，分别转化入BL21(DE3)和JM105后诱导表达出CPC酰化酶。4、基于假单胞杆菌SE83头孢菌素酰化酶Ⅱ基因（acyⅡ)序列，通过密码子优化技术，降低基因序列中的GC含量，获得合成CPC酰化酶基因（sCPCAcy)，其CPC酰化活力高于GL-7-ACA酰化活力2.3倍，基于sCPCAcy基因序列，把位于通道处675位点的Ala突变成Gly，克隆入pET28后转入大肠杆菌JM109(DE3)获得大肠杆菌JM109(DE3)/pET28-sCPCAcyA675G表达系统，诱导表达后得到CPC酰化酶。前述这些突变方法虽然酶活力有所提高，但是仍然无法满足工业需求，同时得到的突变型头孢菌素C酰化酶容易受7-ACA产物的抑制，使7-ACA的产率低，转化速率低，酶的活性受外界影响较大。为了满足工业的需求，急需要一种酶活力高，不易受产物抑制，受外界因素影响较小的头孢菌素C酰化酶。
发明内容
本发明目的在于提供一种突变型头孢菌素C酰化酶及其制备方法和应用，以解决现有技术中突变型头孢菌素C酰化酶催化活性小，酶活性受外界影响大，存在产物抑制的技术问题。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种突变型头孢菌素C酰化酶，将具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。
进一步地，突变氨基酸序列的编码基因为a~e中的一种，
a）具有序列表中SEQ ID NO.4的基因序列；
b）具有序列表中SEQ ID NO.6的基因序列；
c）具有序列表中SEQ ID NO.8的基因序列；
d）在严格条件下可与a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列；
e）与a、b或c任一项限定的基因序列具有90％以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列。
进一步地，突变氨基酸序列为将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，具有序列表中SEQ IDNO.3的氨基酸序列。
进一步地，突变氨基酸序列为将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417位的组氨酸突变为甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.5的氨基酸序列。
进一步地，突变氨基酸序列为将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第296位的组氨酸突变为天然氨基酸和将第417位的组氨酸突变为甘氨酸。
进一步地，第296位的组氨酸为突变为苯丙氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.7的蛋白质序列。本发明的另一方面还提供了一种前述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
a）将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列进行定点突变、定点饱和突变或多点突变步骤得到可编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的突变基因；
b）将突变基因插入到质粒中得到表达载体；
c）将表达载体转化进入菌株中得到重组菌；
d）将重组菌用1%乳糖诱导进行发酵得到头孢菌素C酰化酶。
进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤为将头孢菌素C酰化酶通过固定化金属亲和层析法进行纯化得到头孢菌素C酰化酶纯酶。
进一步地，质粒为pET28a(+)，菌株为E.coli BL21(DE3)。
本发明的另一方面还提供了一种由前述头孢菌素C酰化酶转化成7-ACA的方法，将前述述头孢菌素C酰化酶与CPC-Na底物进行转化反应1~3h，转化温度为20~25℃，pH为8.2~8.6。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的突变型头孢菌素C酰化酶，通过对野生型头孢菌素C酰化酶的第288位的缬氨酸进行突变可以增加头孢菌素C酰化酶稳定性，对第417位组氨酸位点进行突变，可以减小组氨酸活性作用区域的空间位阻，对第296为组氨酸位点进行突变可以改变活性作用区域的酸碱性和空间位阻，通过对前述三个位点的突变改变了野生型头孢菌素C酰化酶的生物性能，提高了催化活性高和比活，同时产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制小，受外界影响小，可以迅速的催化CPC转化生成7-ACA。
本发明提供的突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，将野生型头孢菌素C酰化酶的经过定点突变、定点饱和突变或多点突变，同时采用1%的乳糖对重组菌进行诱导，得到的突变型头孢菌素C酰化酶表达水平更高，结构更稳定，不容易产生其他类型的突变。
本发明提供的转化7-ACA的方法将转化温度确定为20~25℃，PH确定为8.2~8.6，在60分钟内7-ACA的产率达到98%以上，CPC的残留量仅为1%，7-ACA的产率高，转化速率快。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例的重组表达质粒pET28-CPC构建流程图；
图2是本发明优选实施例的SDS-PAGE图谱；
图3是本发明实施例3的反应初始时7-ACA含量的HPLC峰图；
图4是本发明实施例3的反应结束时7-ACA含量的HPLC峰图；
图5是本发明醋酸根离子对对比例1中头孢菌素C酰化酶的影响图；
图6是本发明醋酸根离子对实施例3中头孢菌素C酰化酶的影响图；
图7是本发明7-ACA产物对对比例1中头孢菌素C酰化酶的影响图；
图8是本发明7-ACA产物对实施例3中头孢菌素C酰化酶的影响图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明的一个方面提供了一种突变型头孢菌素C酰化酶，现有的野生型的头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列，该氨基酸序列的编码基因为序列表中SEQ ID NO.2的基因序列。本发明提供的氨基酸序列将具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。由于288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸位于头孢菌素C酰化酶的活性区域影响了头孢菌素C酰化酶的活性，同时在这三个位点上缬氨酸、组氨酸存在产物抑制，导致7-ACA产率低，转化速率慢。为了提高头孢菌素C酰化酶的活性和7-ACA的转化率，本发明对前述三个位点进行突变，对第288位的缬氨酸进行突变可以增加头孢菌素C酰化酶稳定性，对第417位组氨酸位点进行突变，可以减小组氨酸活性作用区域的空间位阻，对第296为组氨酸位点进行突变可以改变活性作用区域的酸碱性和空间位阻，通过对前述三个位点的突变改变了野生型头孢菌素C酰化酶的生物性能，提高了催化活性高和比活，同时产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制小，可以迅速的催化头孢菌素C直接转化生成7-ACA。
进一步地，突变氨基酸序列的编码基因为a~e中的一种，
a）具有序列表中SEQIDNO.4的基因序列；
b）具有序列表中SEQ IDNO.6的基因序列；
c）具有序列表中SEQIDNO.8的基因序列；
d）在严格条件下可与a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列；
e）与a、b或c任一项限定的基因序列具有90％以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列。
本文中的严格条件可为在1×SSC，0.1%SDS的溶液中，在60℃条件下杂交并洗膜。
前述突变氨基酸序列的编码基因是序列表中SEQ ID NO.2的基因序列进行定点突变，多点突变和定点饱和突变得到的。序列表中SEQ ID NO.4的基因序列编码序列表中SEQ ID NO.3的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO.6的基因序列编码序列表中SEQ ID NO.5的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO.8的基因序列编码序列表中SEQ ID NO.7的氨基酸序列。
进一步地，将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.3的氨基酸序列。氨基酸序列为将活性作用区域的第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸以增加头孢菌素C酰化酶稳定性，使头孢菌素C酰化酶的活性更高。
进一步地，将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417位的组氨酸突变为甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.5的氨基酸序列。本发明将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417位的组氨酸突变为甘氨酸以减小活性作用区域的空间位阻，使头孢菌素C酰化酶的活性更大，产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制更小。
进一步地，第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第296位的组氨酸突变为天然氨基酸和将第417位的组氨酸突变为甘氨酸。将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417位的组氨酸突变为甘氨酸，和将第296位的组氨酸突变为天然氨基酸以改变活性作用区域的酸碱性和空间位阻，使头孢菌素C酰化酶的活性更大，产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制更小。
进一步地，将第296位的组氨酸突变为苯丙氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.7的氨基酸序列。使头孢菌素C酰化酶的活性更大，产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制更小。
本发明的另一方面还提供了一种前述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
a）将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列进行定点突变、定点饱和突变或多点突变步骤得到具有序列表中SEQ ID NO.4的基因序列；具有序列表中SEQ ID NO.6的基因序列；具有序列表中SEQ ID NO.8的基因序列；在严格条件下可与a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列；与a、b或c任一项限定的基因序列具有90％以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列的突变基因；
b）将突变基因插入到质粒中得到表达载体；
c）将表达载体转化进入菌株中得到重组菌；
d）将重组菌用1%乳糖诱导进行发酵得到头孢菌素酰化酶。
按照本发明的制备方法制得的头孢菌素C酰化酶，野生型头孢菌素C酰化酶的进过定点突变、定点饱和突变或多点突变后，得到的突变型头孢菌素C酰化酶的结构更稳定，不容易产生其他类型的突变，突变型头孢菌素C酰化酶的活性更高，产量更大。同时本发明采用1%的乳糖对重组菌进行诱导，可以获得最高的CPC-III酶活表达水平；当乳糖浓度在1%以内时，CPC-III的酶活随乳糖浓度的增大而增大；当乳糖浓度高于1%时，CPC-III的酶活随乳糖浓度的增大而减小。
进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤为将头孢菌素C酰化酶通过固定化金属亲和层析法进行纯化得到头孢菌素C酰化酶纯酶。将头孢菌素C酰化酶进行纯化后，杂质更少，纯度更高。
进一步地，质粒为pET28a(+)，菌株为E.coli BL21(DE3)。本发明以pET28a(+)作为重组表达载体，由于pET28a(+)为诱导型表达载体，对突变型的头孢菌素C酰化酶的表达能力更强。基因工程重组菌株为将重组表达载体通过电转化或化学转化的方法导入到大肠杆菌宿主菌中，该大肠杆菌宿主菌具体为E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21(DE3)plys，选择前述的大肠杆菌作为本发明头孢菌素C酰化酶的宿主菌，成本更低，得到的头孢菌素C酰化酶的产量更多。
一种前述头孢菌素C酰化酶转化成7-ACA的方法，将前述头孢菌素C酰化酶与CPC-Na底物进行转化反应1~3h，转化温度为20~25℃，pH为8.2~8.6。当pH值、底物浓度和酶量一定时，温度低于20℃，转化反应时间随温度降低呈现明显延长趋势；当温度高于25℃，转化温度越高，则CPC的降解速度越快，当时7-ACA的降解速度呈现加快趋势，导致7-ACA的产率随温度升高而降低。当温度、底物浓度和酶量一定时，pH低于8.2，CPC转化率随pH降低呈明显的下降趋势，反应时间也呈延长趋势；pH高于8.6，CPC、7-ACA的降解速度随pH升高呈加快趋势，7-ACA的产率随pH升高而降低。本发明的转化温度为20~25℃，PH为8.2~8.6，转化反应速度最快，7-ACA的产率最高。
实施例
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法。引物为上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列测序为华大基因完成。大肠杆菌宿主菌为E.coli BL21(DE3)购于Merck公司，大肠杆菌宿主菌还可以是E.coli BL21(DE3)plys，购于天根公司。全自动电位滴定仪购于瑞士万通公司，型号为8系列。全自动电位滴定仪购于梅特勒-托利多公司，其余材料均为市售。
本发明人根据大肠杆菌密码子简并性及偏爱性对来源于假单胞菌N176编码头孢菌素C酰化酶的基因（CPCA）进行优化并合成。图1为重组表达质粒pET28-CPC构建流程图。
实施例1~4的野生型头孢菌素C酰化酶编码基因的获得、野生型头孢菌素C酰化酶载体的构建及基因工程菌的构建、头孢菌素C酰化酶酶活力的检测按照下述方法进行。
1、野生型头孢菌素C酰化酶编码基因的获得
将来源于假单胞菌N176的头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1，根据大肠杆菌密码子简并性及偏爱性对该氨基酸序列进行反向设计得到头孢菌素C酰化酶编码DNA序列，同时在该DNA序列的N端和C端分别加上Hind III和EcoR I酶切位点得到优化好的DNA序列。将优化好的DNA序列进行全基因合成得到具有氨基酸序列表SEQ ID NO.2的基因序列。
2、野生型头孢菌素C酰化酶载体的构建及基因工程菌的构建
将具有氨基酸序列表SEQ ID NO.2的基因序列与载体pUC57分别进行Hind III和EcoR I双酶切，切胶回收后，将回收产物进行按照3：1的比例进行混合，加入T4ligase于16℃过夜连接。将连接产物5μl转入50μl的Top10’感受态中，涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板中进行蓝白斑筛选。挑取白色单菌落进行扩培并提取质粒，将质粒与表达载体pET28a(+)分别进行Hind III和EcoR I双酶切，然后电泳并将目的条带切胶纯化回收，将回收后的质粒与载体以3：1的比例混合，加入T4ligase于16℃过夜连接构建表达载体pET28-CPCA，其表达蛋白命名为N176-CPC。
将5μl的N176-CPC转入50μl的Top10’感受态中，涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证，将阳性克隆接种于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培，提取质粒进行Hind III和EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序。测序完成后，将与野生型头孢菌素C酰化酶基因相同的质粒1μl转入50μl的BL21(DE3)感受态中。
3、头孢菌素C酰化酶酶活力的检测
（1）滴定法
原理：头孢菌素C在头孢菌素C酰化酶作用下转化成7-ACA和氨基己二酸，用NaOH溶液中和氨基己二酸，根据NaOH的消耗量计算CPC酰化酶活力。
具体操作方法：在1.5ml离心管中预先加入玻璃珠，当玻璃珠达到离心管刻度1.0ml处停止，精确量取0.5ml实施例1~3中的突变型头孢菌素C酰化酶于离心管中，在振荡频率为1500/min的MS3振荡器上振荡10min后，将样品连同玻璃珠一起，加至已装有预热至25℃的30ml的1%CPC-Na底物溶液的反应器中，调节水浴恒温25℃，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.00时开始计时，保持pH为8.00的条件搅拌反应5分钟，用全自动电位滴定仪检测氢氧化钠滴定液的消耗量。滴定法中酶活力的计算公式为：
其中VNaOH：氢氧化钠滴定液的消耗量，ml。
CNaOH：氢氧化钠滴定液的摩尔浓度为0.1mol/L。
T：反应时间，min。
V样：酶液样品体积，ml。
W样：固定化酶样品重量，g。
1000：由mmol转为μmol。
酶活力单位（U）定义为：在25℃，pH8.0条件下，在1min内催化底物头孢菌素C生成1μmol氨基己二酸时所需的酶量为1U。
（2）高效液相色谱（HPLC）法
精确量取20μl的实施例1~3中的突变型头孢菌素C酰化酶进行离心过滤取上清液。将上清液与含有3％(W/V)的头孢菌素C的0.02mol/L、pH8.00磷酸盐缓冲液混合至终体积200μl，得到反应初始时体系。将反应初始时体系在25℃反应l0min后，加入200μl的40％的冰醋酸终止反应，得反应结束时体系。将反应初始时体系和反应结束时体系分别进行HPLC分析。
溶样相配制：称取1.542g乙酸铵加950ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH至7.0，0.45μm水系滤膜过滤，混合均匀后备用。
流动相配制：称取1.542g乙酸铵加965ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH至7.0，0.45μm水系滤膜过滤，加入50ml色谱纯的乙腈，混合均匀后脱气30min。
检测波长：254nm。
柱子类型：BDS C18200mm×4.6mm。
总流速：1.0ml/min。
进样量：20μl。
酶活力单位（U）定义为：在25℃，pH8.0条件下，在1min内催化底物头孢菌素C生成1μmol产物7-ACA的所需的酶量为1U。
实施例1
a）以含野生型头孢菌素C酰化酶表达载体pET28-CPCA克隆菌株Top10’菌株中提取的质粒为突变模板，提取的质粒具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列。根据提取质粒的基因序列设计突变引物，在反向PCR反应体系中反向PCR进行288位点的定点突变，首先在95℃下预变性5min，然后在94℃下变性30S，在60℃下退火1min，在72℃下延伸8min，重复变性、退火、延伸18次，最后72℃延伸10min得到PCR产物。反向PCR反应体系的制备方法为将5μl的10*pfxbuffer，1μl的正向引物，1μl的反向引物，1μl的Mg2+，1μl的模板DNA，10μl的5*EnhancerBuffer，2μl的dNTPs，0.5μl的酶活力为2.5U/μl的pfx高保真DNA聚合酶，加无菌去离子水定容至50μl。该单点突变为V288M，该定点突变正向引物具有序列表中SEQ ID NO.9的基因序列；反向引物具有序列表中SEQ IDNO.10的基因序列。
将PCR产物进行纯化，将25μl纯化后的PCR产物，2μl的DPN I快速酶，3μl的10*Buffer混合，在37℃温育30min，然后后置于80℃热水中5min使DPNI快速酶失活得到突变基因。
b）将突变基因放置于冰上1h进行自身环化，然后将环化的突变基因转入大肠杆菌Top10’感受态细胞中，涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证获得阳性克隆。将阳性克隆接种于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培得到扩培产物。提取扩培产物中的质粒进行Hind III和EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序选出基因序列正确的表达载体。该表达载体命名为pET28-CPCAI，其表达蛋白即单倍突变体，命名为CPC-I。
c）将CPC-I通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养得到含野生型或突变型头孢菌素C酰化酶载体的重组菌。
d）挑取重组菌中的单菌落接种于含浓度为50μg/ml硫酸卡那霉素的20ml的LB液体培养基中进行扩培，于37℃培养8h得到扩培产物。将扩培产物以5%的接种量接种于100ml的TB培养基中进行发酵培养，先在37℃中发酵6h，再加入1%的乳糖并降温至25℃进行乳糖诱导培养14h得到头孢菌素酰化酶发酵液。
e）将头孢菌素酰化酶发酵液于12,000rmp，4℃离心得到菌体，在菌体中加入10ml温度为4℃的无菌生理盐水进行悬浮得到菌悬液，将菌悬液并用超声波破碎法破碎细胞，离心取上清液。将上清液上样至已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统（Bio-Rad）进行实时监控，当计算机中出现目的蛋白峰时，开始收集头孢菌素酰化纯酶直到该峰消失为止。
实施例2
a）以含野生型头孢菌素C酰化酶表达载体pET28-CPCA I克隆菌株Top10’菌株中提取的质粒为突变模板，提取的质粒具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列。根据提取质粒的基因序列设计突变引物，在反向PCR反应体系中反向PCR反应，基于288位点突变再次进行417位点的定点突变，首先在95℃下预变性5min，然后在94℃下变性30S，在60℃下退火1min，在72℃下延伸8min，重复变性、退火、延伸18次，最后72℃延伸10min得到PCR产物。反向PCR反应体系的制备方法为将5μl的10*pfx buffer，1μl的正向引物，1μl的反向引物，1μl的Mg2+，1μl的模板DNA，10μl的5*Enhancer Buffer，2μl的dNTPs，0.5μl的酶活力为2.5U/μl的pfx高保真DNA聚合酶，加无菌去离子水定容至至50μl。该单点突变为V288M、H417G，该定点突变正向引物具有序列表中SEQ ID NO.11的基因序列；反向引物具有序列表中SEQ IDNO.12的基因序列。
将PCR产物进行纯化，将25μl纯化后的PCR产物，2μl的DPN I快速酶，3μl的10*Buffer混合，在37℃温育30min，然后后置于80℃热水中5min使DPNI快速酶失活得到突变基因。
b）将突变基因放置于冰上1h进行自身环化，然后将环化的突变基因转入大肠杆菌Top10’感受态细胞中，涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证获得阳性克隆。将阳性克隆接种于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培得到扩培产物。提取扩培产物中的质粒进行Hind III和EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序选出基因序列正确的表达载体。该表达载体命名为pET28-CPCAII，其表达蛋白即双倍突变体命名为CPC-II。
c）将CPC-II通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养得到含野生型或突变型头孢菌素C酰化酶载体的重组菌。
d）挑取重组菌中的单菌落接种于含浓度为50μg/ml硫酸卡那霉素的20ml的LB液体培养基中进行扩培，于37℃培养8h得到扩培产物。将扩培产物以5%的接种量接种于100ml的TB培养基中进行发酵培养，先在37℃中发酵6h，再加入1%的乳糖并降温至25℃进行乳糖诱导培养14h得到头孢菌素酰化酶。
e）将头孢菌素酰化酶发酵液于12,000rmp，4℃离心得到菌体，在菌体中加入10ml温度为4℃的无菌生理盐水进行悬浮得到菌悬液，将菌悬液并用超声波破碎法破碎细胞，离心取上清液。将上清液上样至已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统（Bio-Rad）进行实时监控，当计算机中出现目的蛋白峰时，开始收集头孢菌素酰化纯酶直到该峰消失为止。
实施例3
a）以含野生型头孢菌素C酰化酶表达载体pET28-CPCAII克隆菌株Top10’菌株中提取的质粒为突变模板，提取的质粒具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列。根据提取质粒的基因序列设计突变引物，在反向PCR反应体系中反向PCR进行第288、417和296位点的定点饱和突变，首先在95℃下预变性5min，然后在94℃下变性30S，在60℃下退火1min，在72℃下延伸8min，重复变性、退火、延伸18次，最后72℃延伸10min得到PCR产物。反向PCR反应体系的制备方法为将5μl的10*pfxbuffer，1μl的正向引物，1μl的反向引物，1μl的Mg2+，1μl的模板DNA，10μl的5*Enhancer Buffer，2μl的dNTPs，0.5μl的酶活力为2.5U/μl的pfx高保真DNA聚合酶，加无菌去离子水定容至至50μl。该三点点突变为V288M、H417G，H296X(其中X为任意氨基酸)，该定点饱和突变正向引物具有序列表中SEQ ID NO.13的基因序列；反向引物具有序列表中SEQ IDNO.14的基因序列。
将PCR产物进行纯化，将25μl纯化后的PCR产物，2μl的DPN I快速酶，3μl的10*Buffer混合，在37℃温育30min，然后后置于80℃热水中5min使DPNI快速酶失活得到突变基因。
b）将突变基因放置于冰上1h进行自身环化，然后将环化的突变基因转入大肠杆菌Top10’感受态细胞中，涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证获得阳性克隆。将阳性克隆接种于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培得到扩培产物。提取扩培产物中的质粒进行Hind III和EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序选出基因序列正确的表达载体。该表达载体命名为pET28-CPCAIII，其表达蛋白即三倍突变体命名为CPC-III。
c）将CPC-II通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养得到含野生型或突变型头孢菌素C酰化酶载体的重组菌。
d）挑取重组菌中的单菌落接种于含浓度为50μg/ml硫酸卡那霉素的20ml的LB液体培养基中进行扩培，于37℃培养8h得到扩培产物。将扩培产物以5%的接种量接种于100ml的TB培养基中进行发酵培养，先在37℃中发酵6h，再加入1%的乳糖并降温至25℃进行乳糖诱导培养14h得到头孢菌素酰化酶。
e）将头孢菌素酰化酶发酵液于12,000rmp，4℃离心得到菌体，在菌体中加入10ml温度为4℃的无菌生理盐水进行悬浮得到菌悬液，将菌悬液并用超声波破碎法破碎细胞，离心取上清液。将上清液上样至已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统（Bio-Rad）进行实时监控，当计算机中出现目的蛋白峰时，开始收集头孢菌素酰化纯酶直到该峰消失为止。
对比例1
将野生型头孢菌素酰化酶按照实施例3的方法进行纯化步骤得到野生型头孢菌素酰化纯酶，命名为N176-CPC。
对比例2
将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列，在288位点进行定点突变，将第288位点的缬氨酸突变为苯丙氨酸，其余步骤均与实施例1相同得到多倍突变体，命名为CPC-IV。
对比例3
将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列，在296位点进行定点突变，将第296位点的组氨酸突变为丝氨酸，其余步骤均与实施例1相同得到多倍突变体，命名为CPC-V。
对比例4
将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列，在417位点进行定点突变，将第417位点的组氨酸突变为甲硫氨酸，其余步骤均与实施例1相同得到多倍突变体，命名为CPC-VI。
对比例5
将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列，在270、215、296、416、417、261、271、294、297、307、308和309等位点进行定点饱和突变，其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体，命名为CPC-VII。
对比例6
将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列，在V121α、G139α、F58β、I75β、I176β和S471β等位点进行定点饱和突变，其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体，命名为CPC-VIII。
对比例7
将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列，在L677F和A675G位点进行双点突变，其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体，命名为CPC-IX。
对比例8
将具有序列表中SEQ ID NO.2的基因序列通过密码子优化技术降低基因序列中的GC含量获得合成CPC酰化酶基因（sCPCAcy)；基于sCPCAcy基因序列，把位于通道处675位点的Ala突变成Gly，其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体，命名为CPC-X。
头孢菌素酰化酶纯度检测：将实施例1的头孢菌素酰化纯酶CPC-I进行SDS-PAGE检测，图2为头孢菌素酰化纯酶的SDS-PAGE检测结果，其中：M为标准蛋白分子量；1为发酵液菌体经破碎离心后的上清总蛋白，即粗酶样品；2为经固定化金属亲合层析后的头孢菌素C酰化酶纯酶样品。从图2中可知，未进过纯化的头孢菌素酰化酶其杂质较多，而经过纯化的头孢菌素酰化酶的样品中发现有2条非常单一的条带，其中α亚基和β亚基的大小分别为22KD和58KD。证明按照本发明的纯化方法得到的头孢菌素酰化酶的纯度明显提高。
乳糖浓度梯度诱导实验：将实施例3的突变体酶CPC-III做了乳糖浓度梯度诱导实验，乳糖浓度梯度（W/V）为0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%和2%，其结果列于表1中。
表1实施例3的乳糖诱导实验结果表
| 乳糖浓度 | 0.1% | 0.2% | 0.5% | 1% | 1.5% | 2% |
| 酶活（U/L） | 1420 | 3200 | 8820 | 14560 | 13860 | 13680 |
从表1的实验结果可知，实施例3的突变体酶CPC-III的酶活与乳糖浓度存在线性关系，当乳糖浓度在1%以内时，CPC-III的酶活随乳糖浓度的增大而增大；当乳糖浓度高于1%时，CPC-III的酶活随乳糖浓度的增大而减小，选用1%的乳糖诱导浓度可以获得最高的CPC-III酶活表达水平。
头孢菌素C酰化酶的发酵活力和纯酶比活检测：
将实施例1~3、对比例1~8的头孢菌素酰化纯酶进行发酵活力和纯酶比活进行检测，检测结果列于表2中。
现有技术记载的CPC-VII、CPC-VIII、CPC-IX、CPC-X酶活力是在37℃下进行检测的，头孢菌素C酰化酶在37℃下会自身降解，导致检测的活力部分并不是头孢菌素C酰化酶的真实活力，将CPC-VII、CPC-VIII、CPC-IX、CPC-X按照本发明的检测方法进行，将其实际酶活力列于表2中。
表2发酵活力和纯酶比活检测结果表
从表2的检测结果可知，CPC-I、CPC-II、CPC-III的发酵活力明显高于对比例1，证明按照本发明的突变位点对头孢菌素C酰化酶进行突变，头孢菌素C酰化酶的活性提高了4~12倍，具有显著的技术效果。CPC-I、CPC-II、CPC-III的发酵活力明显高于CPC-IV、CPC-V、CPC-VI，证明将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第296位的组氨酸突变为其他任意19种氨基酸和将第417位的组氨酸突变为甘氨酸得到的突变型头孢菌素C酰化酶的活力明显高于将第288、296、417为氨基酸突变为其他氨基酸得到的头孢菌素C酰化酶，头孢菌素C酰化酶的活性提高了4倍，具有显著的技术效果。CPC-I、CPC-II、CPC-III的发酵活力明显高于CPC-VII、CPC-VIII、CPC-IX、CPC-X证明按照本发明的突变位点对氨基酸进行突变，将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第296位的组氨酸突变为其他任意19种氨基酸和将第417位的组氨酸突变为甘氨酸得到的突变型头孢菌素C酰化酶，酶活性比对其他位点进行突变的酶活性更高，具有显著的技术效果。
头孢菌素C酰化酶醋酸根离子耐受实验：
分别精确量取酶量为200U的对比例1的N176-CPC的和实施例3的CPC-III放置于装有预热至25℃的30ml1%（W/V）的CPC-Na底物溶液的反应器中，在该反应液中预先加入一定浓度（0.2%~1%）的醋酸根离子，开搅拌，水浴恒温25℃，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.00计时，保持pH8.00反应5分钟，使用全自动电位滴定仪检测并记录氢氧化钠滴定液的消耗量。
其中图5为对比例1对醋酸根离子耐受性曲线图，图上表明，当醋酸根浓度0.2％下，对比例4的头孢菌素C酰化酶活性就已下降了54.9%；图6为实施例3对醋酸根离子耐受性曲线图，从图中可知，醋酸根浓度1％下，三倍突变体CPC-III头孢菌素C酰化酶的活性下降了26.62%。因此，相对于对比例4的头孢菌素C酰化酶，三倍突变体CPC-III对醋酸根离子耐受性有显著提升，在低浓度情况下，基本不受醋酸根离子抑制。证明按照本发明的方法得到的突变型头孢菌素C酰化酶，其酶活力对外界影响较小。
将实施例3和对比例1的头孢菌素C酰化酶进行7-ACA影响实验，验证7-ACA对野生型或三倍突变体CPC-III头孢菌素C酰化酶的影响。
精确量取酶量200U的对比例1的头孢菌素C酰化纯酶酶和实施例3中的三倍突变体CPC-III纯酶，放入30ml温度为25℃，浓度为1%（W/V）的CPC-Na底物溶液中，在加入加入浓度为0.4%~2%的7-ACA，在25℃的水浴温度下，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.0，然后保持pH为8.00的条件进行搅拌反应5分钟，使用全自动电位滴定仪检测并记录氢氧化钠滴定液的消耗量。
其中图7为7-ACA对对比例1抑制性曲线图，图上表明，当7-ACA浓度为0.4％的条件下，对比例1的头孢菌素C酰化酶活性就已下降62.34%；图8为7-ACA对实施例3的抑制性曲线图，从图中可知，在7-ACA浓度为0.4％的条件下，三倍突变体CPC-III酶活性仅仅下降了17.8%，当在7-ACA浓度上升为2％时，其酶活性也只下降53.81%，远远低于对比例1的头孢菌素C酰化酶。因此，相对于野生型孢菌素C酰化酶，三倍突变体CPC-III对7-ACA耐受性有显著提升。
头孢菌素C转化7-ACA实验：
精确量取实施例1中酶量为7000U的CPC-I纯酶放入装有温度为23℃，浓度为3%（W/V）的1000ml的CPC-Na底物溶液中得到溶液1。将溶液1在23℃下进行水浴，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.20时开始计时，保持溶液1的pH为8.40反应1~3h得到7-ACA-1。
精确量取实施例2中酶量为7000U的CPC-II纯酶放入装有温度为25℃，浓度为3%（W／V）的1000ml的CPC-Na底物溶液中得到溶液1。将溶液1在25℃下进行水浴，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.20时开始计时，保持溶液1的pH为8.60反应1~3h得到7-ACA-2。
精确量取实施例3中酶量为7000U的CPC-III纯酶放入装有温度为21℃，浓度为3%（W/V）的1000ml的CPC-Na底物溶液中得到溶液1。将溶液1在21℃下进行水浴，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.20时开始计时，保持溶液1的pH为8.20反应1~3h得到7-ACA-3。
精确量取对比例1中酶量为7000U的N176-CPC纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-4。
精确量取对比例2中酶量为7000U的CPC-IV纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-5。
精确量取对比例3中酶量为7000U的CPC-V纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-6。
精确量取对比例4中酶量为7000U的CPC-VI纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-7。
精确量取对比例5中酶量为7000U的CPC-VII纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-8。
精确量取对比例6中酶量为7000U的CPC-VIII纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-9。
精确量取对比例7中酶量为7000U的CPC-IX纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-10。
精确量取对比例8中酶量为7000U的CPC-X纯酶按照实施例1的方法得到7-ACA-11。
对实施例1~3和对比例1~8中消耗的纯酶的量和7-ACA的产量进行监控，用HPLC法检测头孢菌素C和7-ACA的含量，检测结果列于表3中。
表3头孢菌素C酰化酶转化CPC生成7-ACA过程监控结果表。
由表3的监控结果结果可以看出，对比例1的头孢菌素C酰化酶转化CPC生成7-ACA过程中，转化6个小时，才生成72.5%的7-ACA，头孢菌素C残留量达20.5%，说明野生型头孢菌素C酰化酶不能完全转化CPC且转化过程耗时太长；同时对比例2~8的头孢菌素C酰化酶在转化CPC生成7-ACA的过程中，头孢菌素C均有残留，同时转化过程均达到360小时；而实施例1~3的突变体头孢菌素C酰化酶在60分钟内能转化CPC生成96.9%的7-ACA，且CPC残留仅有1.0%，相对于野生型头孢菌素C酰化酶，其转化率大大提高，转化效果显著上升，转化时间有很大的缩短，证明按照本发明的方法对头孢菌素C酰化酶进行突变，具有意想不到的技术效果。
图3是本发明实施例3的反应初始时7-ACA含量的HPLC峰图；图4是本发明实施例3的反应结束时7-ACA含量的HPLC峰图。从图3和图4可知，三倍突变体CPC-III头孢菌素C酰化酶转化率高，几乎没有看到有CPC残留。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，将具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；所述氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列的编码基因为a~e中的一种，
a）具有序列表中SEQ ID NO.4所述的基因序列；
b）具有序列表中SEQ ID NO.6所述的基因序列；
c）具有序列表中SEQ ID NO.8所述的基因序列；
d）在严格条件下可与所述a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列；
e）与所述a、b或c任一项限定的基因序列具有90％以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列。
3.根据权利要求1所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列为将所述第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列为将所述第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将所述第417位的组氨酸突变为甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列为将所述第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将所述第296位的组氨酸突变为天然氨基酸和将所述第417位的组氨酸突变为甘氨酸。
6.根据权利要求5所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述第296位的组氨酸为突变为苯丙氨酸，具有序列表中SEQ ID NO.7所述的蛋白质序列。
7.一种权利要求1至6中任意一项所述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）将所述具有序列表中SEQ ID NO.2所述的基因序列进行定点突变、定点饱和突变或多点突变步骤得到可编码SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的突变基因；
b）将所述突变基因插入到质粒中得到表达载体；
c）将所述表达载体转化进入菌株中得到重组菌；
d）将所述重组菌用1%乳糖诱导进行发酵得到头孢菌素C酰化酶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括纯化步骤，所述纯化步骤为将所述头孢菌素C酰化酶通过固定化金属亲和层析法进行纯化得到头孢菌素C酰化酶纯酶。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述质粒为pET28a(+)，所述菌株为E.coliBL21(DE3)。
10.一种头孢菌素C酰化酶转化成7-ACA的方法，其特征在于，将权利要求1~6任意一项所述头孢菌素C酰化酶与CPC-Na底物进行转化反应1~3h，所述转化温度为20~25℃，pH为8.2~8.6。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Mutant cephalosporin C-acylase and its preparation method and method for converting 7-ACA Granted publication date: 20140910 Pledgee: Changsha Bank city branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: HUNAN FLAG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980012003 |