CN104561194A - 一种n-乙酰神经氨酸醛缩酶在催化合成n-乙酰神经氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶在催化合成N-乙酰神经氨酸中的应用。即以氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶为催化剂，以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，制备N-乙酰神经氨酸。本发明首次将氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶应用于N-乙酰神经氨酸制备中，取得很好的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶(N-acetylneuraminic acid lyase，Nal)的应用，尤其涉及一种来自谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032中的Nal在以N-乙酰甘露糖胺（N-acetyl-D-mannosamine，ManNAc）以及丙酮酸为底物生产N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）中的应用。
背景技术
N-乙酰神经氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid,Neu5Ac）是一种重要的奶粉添加剂，可以提高婴幼儿的免疫力[1]，同时又可以作为抗A、B型流感病毒药物合成前体[2]。以ManNAc和丙酮酸为底物经Nal催化合成Neu5Ac是目前最主要的合成Neu5Ac的途径。Nal已经被运用到Neu5Ac的工业合成中[3-5]，Nal催化ManNAc和丙酮酸合成Neu5Ac是一个可逆的反应。Nal在自然界的分布非常广泛，在细菌和哺乳动物中都有发现[6]。许多病原菌入侵人体后利用Nal来分解人体的Neu5Ac作为自身的碳源和氮源[6]，因此目前从病原菌中报道了大量的Nal。除了病原菌来源的Nal外，也有从食品安全（generally regarded as safe，GRAS）的菌株中发现的Nal。比如Lactobacillus plantarum WCFS1[7]和Taphylococcus carnosus TM300[8]。由于底物丙酮酸价格低廉[9]、温度稳定性高[10]，Nal已经被广泛运用在了Neu5Ac的合成中。但是目前所有的Nal都有一个共同的缺陷：在催化合成Neu5Ac的可逆反应中，Nal更倾向于分解Neu5Ac[7,8,11-14]。
为获得高活性的Nal并解决Nal的化学平衡偏向于分解Neu5Ac的问题，本专利从食品安全的菌株Corynebacterium glutamicum ATCC13032[15]克隆并表达了N-乙酰神经氨酸醛缩酶（CgNal）。其是Nal的一种，包含312个氨基酸，其在Genbank中的收录号为NP_601846，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码该蛋白的基因含有939bp碱基，其在Genbank中的收录号为NC_003450.3，其基因序列如SEQ ID NO：1所示。至今未发现CgNal用于Neu5Ac合成的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶（Nal）在催化N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）和丙酮酸合成N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶（Nal）在催化N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）与丙酮酸合成N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）反应中的应用。
具体的方法是，以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶为催化剂，以N-乙酰甘露糖胺与丙酮酸为底物，合成N-乙酰神经氨酸。
更具体的方法是，表达含有如SEQ ID NO：1所示的基因序列的重组菌，破碎后的粗N-乙酰神经氨酸醛缩酶或进一步经镍柱纯化后得到的纯N-乙酰神经氨酸醛缩酶与N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸在缓冲液中反应得到N-乙酰神经氨酸。
其中，所述的含有如SEQ ID NO：1所示的基因序列的重组菌按如下方法构建得到：以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板扩增出N-乙酰神经氨酸醛缩酶Nal的基因并连接到pET-28a载体上，再将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中。
其中，表达含有如SEQ ID NO：1所示的基因序列的重组菌的方法是：培养重组菌至OD600=04-0.8时添加终浓度0.2-1.0mmol·L-1IPTG，在15-37℃、150-220rpm条件下诱导4-12h。优选的方法是：培养重组菌至OD600为0.6时添加终浓度0.2mmol·L-1IPTG，在30℃、220rpm条件下诱导10h。
其中，镍柱纯化条件为：20mmol·L-1咪唑溶液洗脱杂蛋白，500mmol·L-1咪唑溶液洗脱纯酶。
其中，N-乙酰神经氨酸醛缩酶与N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸的反应用量为：0.36～300U·mL-1粗酶或纯酶与100～1000mmol·L-1N-乙酰甘露糖胺及100～2000mmol·L-1丙酮酸进行反应。
其中，所述的缓冲液为20-200mmol·L-1pH7～8.8的Tris-HCl缓冲液或20-200mmol·L-1pH9.0～9.5的甘氨酸-NaOH缓冲液，优选pH7～8.5Tris-HCl缓冲液，最优选pH7.5Tris-HCl缓冲液或pH8.5的Tris-HCl缓冲液。
其中，在缓冲液中的反应条件为：温度25～60℃，反应时间0.1～12h；优选温度35～45℃，反应时间0.15～0.5h；最优选：温度40℃，反应时间0.15～0.5h。
发明人基于现代生物信息学思想，结合分子生物学技术，采用基因工程的手段从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032克隆N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因，在大肠杆菌中表达后发现其能催化ManNAc和pyruvate生产Neu5Ac。
有益效果：本发明首次将氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶应用于催化ManNAc和pyruvate合成Neu5Ac中，取得很好的效果，其酶活高达 12U/mg，由于这个反应是个可逆反应，相对于其它来源的醛缩酶而言，该醛缩酶的化学平衡更偏向于N-乙酰神经氨酸即唾液酸合成方向，同时酶的表达效果很好，没有形成包涵体，可溶性酶表达量很大，是来源于大肠杆菌的醛缩酶基因的表达量的5倍，同时谷氨酸棒杆菌是一个食品级安全的菌。
附图说明
图1为N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的构建图。
图2为CgNal（来自于谷棒ATCC13032）和EcNal（来自于大肠杆菌）表达后蛋白电泳图。其中，1为CgNal粗酶，2为CgNal纯酶，3为EcNal粗酶，4为EcNal纯酶，5为Marker。
图3为pH对CgNal酶活的影响。
图4为温度对CgNal酶活的影响。
图5为CgNal在温浴过程中酶活的变化。
图6为pH7.5下金属离子及表面活性剂对CgNal酶活的影响。
图7为pH8.5下金属离子及表面活性剂对CgNal酶活的影响。
图8为以CgNal为催化剂合成Neu5Ac过程中产物的浓度变化。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：重组大肠杆菌E.coli Rosseta（pET28a-CgNal）的构建。
1、N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因的获取：
谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032进行基因组的提取，然后以提取的基因组为模板，进行PCR。
构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：
上游引物（CgNal-sense含BamH I）为：
5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCTTCCGCAACTTTCACCG-3’
下游引物（CgNal-anti含HindⅢ）为：
5’-TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAAGCGGTGTACAGGAATTCATC-3’
所有引物均由苏州金唯智公司合成。
基因的PCR条件：
按如下参数循环30次：98℃变性10s，68℃退火延伸1min，最后72℃延伸10min。2、重组大肠杆菌E.coli Rosseta（DE3）转化：
用BamH I及HindⅢ分别酶切pET-28a载体（pET-28a购于Novagen(默克中国)），确认载体完全线性化之后分别胶回收PCR的目的片段和线性化的表达载体，然后通过一步法定向克隆无缝克隆试剂盒（ClonExpress），将10uL的连接产物pET-28a-CgNal加入100uL的Rosetta(DE3)感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激90sec。冰上放置5min。加入预热的0.9mL LB培养基。200rpm37℃1h。将200uL菌液加入分别含有100μg/mL的卡那霉素和氯霉素的LB平板上，37℃过夜培养12～16h。构建图谱见图1。
实施例2：醛缩酶CgNal的获取。
1、N-乙酰神经氨酸醛缩酶CgNal的表达。
挑取重组菌E.coli Rosseta（pET-28a-CgNal）至含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。然后按1(v/v)%接种量分别接种到新鲜培养液中，37℃培养至OD600约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmol·L-1，30℃，200rpm，诱导表达10h后，离心(4℃，10000rpm，10min)。
2、N-乙酰神经氨酸醛缩酶CgNal的纯化。
将收集的菌泥用100mmol·L-1Tris-HCl（PH7.5）缓冲重悬，超声破碎细胞(功率300W，超声3s，间歇5s，共5min)，离心(4℃，12000rpm，15min)取上清。
将收集到的上清酶液添加到Ni-NTA柱（Ni-NTA His·Bind Resin,Novagen）中，冰上保温30分钟。弃去穿透液后，用含20mmol·L-1咪唑的100mmol·L-1Tris-HCl（pH7.5）洗去杂蛋白。再用含500mmol·L-1咪唑的100mmol·L-1Tris-HCl（pH7.5）将目标蛋白CgNal洗脱下来。以来自大肠杆菌的醛缩酶EcNal[16]为对照，用12%的SDS-PAGE检测酶的纯度及表达量，如图2所示。将纯化后的CgNa用Bradford法进行蛋白浓度的测定。
实施例3：醛缩酶CgNal酶学性质的研究。
1、CgNal酶活的检测方法
CgNal的酶活分为Neu5Ac合成反应的酶活以及Neu5Ac分解反应的酶活。Neu5Ac合成反应的酶活定义为每分钟合成1μmol Neu5Ac所需的酶量，Neu5Ac分解反应酶活定义为每分钟分解1μmol Neu5Ac所需的酶量。Neu5Ac分解反应的酶活检测液为0.1M丙酮酸，0.1·mol·L-1ManNAc和0.1mol·L-1Tris-HCl(pH7.5或8.5）；Neu5Ac分解反应的酶活检测液为100mmol·L-1Neu5Ac和0.1mol·L-1的Tris-HCl（pH7.5或8.5）。纯化后的Nal加到1ml的酶活检测液中至终浓度为30μg/ml（约0.36U/ml)。在37℃下反应20分钟后，在沸水中加热5min终止反应，12000g离心10分钟并用0.22μm滤头过滤样品。
采用Agilent1200高效液相色谱，一根Bio-Rad Aminex87-H柱进行检测底物及产物（以5mmol·L-1H2SO4为流动相，流速0.6ml/min，折光示差检测器）。
2、不同pH值下CgNal的酶活
pH对CgNal的影响采用如下缓冲：0.1M Tris-HCl(pH7-8.8)和0.1M的甘氨酸-NaOH缓冲（pH9.0-9.5）。在不同的pH的酶活检测液中检测酶活，从而检测pH对酶活的影响。检测结果显示，在pH7.5-8.4之间CgNal的Neu5Ac分解反应活性远大于Neu5Ac合成反应的活性；而当pH8.6-8.8之间时，Neu5Ac的分解活性与Neu5Ac合成的活性接近（图3）。
3、温度对CgNal的影响
分别用pH7.5的温度梯度（25℃-60℃）来检测醛缩酶CgNal的正向酶活和反向酶活，找出最适反应温度。在pH7.5的条件下，CgNal的最适温度为40℃，Neu5Ac的分解和合成反应的最适温度一致。在pH8.5条件下，Neu5Ac合成方向的最适温度为40℃，Neu5Ac分解方向为45℃（图4）。将CgNal在0.1M Tris-HCl pH8.5的缓冲，37℃条件下温浴48h，并检测温浴过程中酶活的变化，从而确定CgNal的稳定性。在温浴的前10h内，CgNal的Neu5Ac合成活性体现出上升趋势，36h的温浴仍能保持出发活力的80%左右（图5）。
4、金属离子及表面活性剂对CgNal活性的影响
在CgNal的酶活检测液中加入5mM的CaCl2，NaCl,BaCl2,FeCl3,KCl,ZnCl2,CoCl2,MgCl2,NH4Cl,NiSO4,EDTA,CTAB和SDS，并以不添加任何金属离子和表面活性剂的样品作为对照。检测CgNal在pH7.5和pH8.5条件下的酶活。pH8.5条件下的CgNal的酶活远大于pH7.5条件下的CgNal酶活，而且金属离子对于CgNal在不同pH条件下 的影响差别很大。在pH7.5条件下，ZnCl2,CoCl2,NiSO4,CTAB和SDS都促进了CgNal在合成Neu5Ac方向的反应，同时也抑制了分解Neu5Ac方向的反应（图6）。而对于pH8.5条件下的金属离子对于CgNal没有明显的激活作用。CgNal，ZnCl2，CTAB和SDS促进了Neu5Ac合成相对于Neu5Ac分解方向的优势，但却整体降低了酶活性（图7）。因此，在合适的pH及金属离子、表面活性剂的作用下CgNal在合成Neu5Ac方向的速率大于Neu5Ac分解方向的速率。
5、CgNal的酶反应动力学常数的测定
CgNal在pH7.5及pH8.5条件下对底物ManNAc,Neu5Ac和丙酮酸的酶促反应动力常数实在不同浓度的底物条件下测定的。测定对于丙酮酸的动力常数时，固定ManNAc的浓度为100mM，丙酮酸浓度在1-100mM浓度之间变化。测定对于ManNAc的动力学常数时，固定丙酮酸浓度为100mM，ManNAc的浓度在1-400mM之间变化。测定对于Neu5Ac的动力学常数时，Neu5Ac的浓度在1-200mM之间变化。CgNal在pH7.5及pH8.5条件下对于Neu5Ac，ManNAc和丙酮酸的动力学常数表1所示。当pH从7.5上升至8.5时，底物的Km与Vmax值均有很大的提高。
表1CgNal的动力学常数
实施例4：以CgNal为催化剂催化合成Neu5Ac。
在20ml的反应体系中，反应液为50mM Tris-HCl（pH7.5和pH8.5）中含有0.8mol·L-1ManNAc，2mol·L-1丙酮酸。1mL同等条件下诱导剂纯化的CgNal（180U/mL）和EcNal（64U/mL）加到反应液中。催化条件为37℃，200rpm下进行12h。pH适时调整为7.5和8.5并取样检测反应过程中ManNAc，丙酮酸和Neu5Ac的含量。催化结果显示，CgNal的产量远高于ECNal的产量，12h内CgNal最高合成185g/LNeu5Ac。在催化的前6h内pH8.5的产量都明显高于pH7.5，之后pH8.5的产量与pH7.5的产量在EcNal以及CgNal的催化结果中都很接近（图8）。
【参考文献】：
1. Oriquat,G.A.,et al.,Soluble CD14,sialic acid and L-Fucose in breast milk and their role in increasing the immunity of breast-fed infants.American Journal of Biochemistry and Biotechnology,2011.7(Compendex):p.21-28.
2. Tao,F.,et al.,Biotechnological production and applications of N-acetyl-D-neuraminic acid:current state and perspectives.Appl Microbiol Biotechnol,2010.87(4):p.1281-9.
3. Xu,X.,et al.,Production of N-acetyl-D-neuraminic acid by use of an efficient spore surface display system.Applied and Environmental Microbiology,2011.77(Compendex):p.3197-3201.
4. Hu,S.,et al.,Coupled bioconversion for preparation of N-acetyl-D-neuraminic acid using immobilized N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid lyase.Appl Microbiol Biotechnol,2010.85(5):p.1383-91.
5. Tabata,K.,et al.,Production of N-acetyl--neuraminic acid by coupling bacteria expressing N-acetyl--glucosamine2-epimerase and N-acetyl--neuraminic acid synthetase.Enzyme and Microbial Technology,2002.30(3):p.327-333.
6. North,R.A.,et al.,Cloning,expression,purification,crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of N-acetylneuraminate lyase from methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Acta Crystallographica Section F,2013.69(3):p.306-312.
7. Sanchez-Carron,G.,et al.,Molecular characterization of a novel N-acetylneuraminate lyase from Lactobacillus plantarum WCFS1.Applied and Environmental Microbiology,2011.77(Compendex):p.2471-2478.
8. García García,M.I.,et al.,Characterization of a Novel N-Acetylneuraminate Lyase from Staphylococcus carnosus TM300and Its Application to N-Acetylneuraminic Acid Production.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012.60(30):p.7450-7456.
9. Ishikawa,M.and S.Koizumi,Microbial production of N-acetylneuraminic acid by genetically engineered Escherichia coli.Carbohydrate Research,2010.345(Compendex):p.2605-2609.
10. Yamamoto,K.,et al.,Serratia liquefaciensas a New Host Superior for Overproduction and Purification Using theN-Acetylneuraminate Lyase Gene ofEscherichia coli.Analytical Biochemistry,1997.246(2):p.171-175.
11. Krüger,D.,R.Schauer,and C.Traving,Characterization and mutagenesis of the recombinant N-acetylneuraminate lyase from Clostridium perfringens.European Journal of Biochemistry,2001.268(13):p.3831-3839.
12. Uchida,Y.,Y.Tsukada,and T.Sugimori,Purification and properties of N-acetylneuraminate lyase from Escherichia coli.J Biochem,1984.96(2):p.507-22.
13. Schauer,R.and M.Wember,Isolation and characterization of sialate lyase from pig kidney.Biol Chem Hoppe Seyler,1996.377(5):p.293-9.
14. Li,Y.,et al.,Pasteurella multocida sialic acid aldolase:A promising biocatalyst.Applied Microbiology and Biotechnology,2008.79(Compendex):p.963-970.
15. Zahoor ul Hassan,A.,S.Lindner,and V.F.Wendisch,Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum aimed at alternative carbon sources and new products.
16. Sun,W.,et al.,Construction and expression of a polycistronic plasmid encoding N-acetylglucosamine 2-epimerase and N-acetylneuraminic acid lyase simultaneously for production of N-acetylneuraminic acid.Bioresource Technology,2013.130(0):p.23-29。
Claims (9)
1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶在催化N-乙酰甘露糖胺与丙酮酸合成N-乙酰神经氨酸反应中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶为催化剂，以N-乙酰甘露糖胺与丙酮酸为底物，合成N-乙酰神经氨酸。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，表达含有如SEQ ID NO：1所示的基因序列的重组菌，破碎后的粗N-乙酰神经氨酸醛缩酶或进一步经镍柱纯化后得到的纯N-乙酰神经氨酸醛缩酶与N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸在缓冲液中反应得到N-乙酰神经氨酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的含有如SEQ ID NO：1所示的基因序列的重组菌按如下方法构建得到：以Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板扩增出N-乙酰神经氨酸醛缩酶的基因并连接到pET-28a载体上，再将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，表达含有如SEQ ID NO：1所示的基因序列的重组菌的方法是：培养重组菌至OD600=04-0.8时添加终浓度0.2-1.0mmol·L-1IPTG，在15-37℃、150-220rpm条件下诱导4-12h。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，镍柱纯化条件为：20mmol·L-1咪唑溶液洗脱杂蛋白，500mmol·L-1咪唑溶液洗脱纯酶。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，N-乙酰神经氨酸醛缩酶与N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸的反应用量为：0.36～300U·mL-1粗酶或纯酶与100～1000mmol·L-1N-乙酰甘露糖胺及100～2000mmol·L-1丙酮酸进行反应。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的缓冲液为pH7～8.8的Tris-HCl缓冲液或者pH9.0-9.5的甘氨酸-NaOH缓冲。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在缓冲液中的反应条件为：温度25～60℃，反应时间0.1～12h。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106632531A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-10 | 河南科技学院 | 一种α‑2,3羟乙酰唾液酸乳果糖的制备方法 |
| WO2018058723A1 (zh) * | 2016-09-28 | 2018-04-05 | 南京农业大学 | 一种酶法合成唾液酸类似物的方法及其应用 |
| CN108330095A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-07-27 | 江南大学 | 一种积累n-乙酰神经氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
| WO2024036508A1 (zh) * | 2022-08-17 | 2024-02-22 | 深圳大学 | 融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及n-乙酰神经氨酸的生产方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101255431A (zh) * | 2000-03-09 | 2008-09-03 | Basf公司 | 编码代谢途径蛋白的谷氨酸棒杆菌基因 |
| CN103060300A (zh) * | 2011-10-20 | 2013-04-24 | 中国科学院微生物研究所 | N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101787008A (zh) * | 2009-01-23 | 2010-07-28 | 中国科学院上海药物研究所 | N-乙酰神经氨酸类化合物、其药物组合物及其制备方法和用途 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101255431A (zh) * | 2000-03-09 | 2008-09-03 | Basf公司 | 编码代谢途径蛋白的谷氨酸棒杆菌基因 |
| CN103060300A (zh) * | 2011-10-20 | 2013-04-24 | 中国科学院微生物研究所 | N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GENBANK: "登入号：CAC25117.1", 《GENBANK 数据库》 * |
| 周传华等: "来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质", 《生物工程学报》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018058723A1 (zh) * | 2016-09-28 | 2018-04-05 | 南京农业大学 | 一种酶法合成唾液酸类似物的方法及其应用 |
| CN106632531A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-10 | 河南科技学院 | 一种α‑2,3羟乙酰唾液酸乳果糖的制备方法 |
| CN106632531B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-02-22 | 河南科技学院 | 一种α-2,3羟乙酰唾液酸乳果糖的制备方法 |
| CN108330095A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-07-27 | 江南大学 | 一种积累n-乙酰神经氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
| CN108330095B (zh) * | 2018-03-01 | 2020-12-29 | 江南大学 | 一种积累n-乙酰神经氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
| WO2024036508A1 (zh) * | 2022-08-17 | 2024-02-22 | 深圳大学 | 融合蛋白酶、融合表达载体和工程菌以及n-乙酰神经氨酸的生产方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |