CN111748538A - 一种新型阿魏酸酯酶、突变体和应用 - Google Patents

一种新型阿魏酸酯酶、突变体和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种新型阿魏酸酯酶、突变体和应用，属于生物工程领域。本发明首先利用基因组学技术从厌氧真菌Neocallimastix sp.中成功筛选出一种阿魏酸酯酶基因，根据原核系统密码子使用的偏好性及阿魏酸酯酶基因的GC含量和mRNA的二级结构，对该阿魏酸酯酶基因进行密码子优化，得新型阿魏酸酯酶基因序列。该酶存在酯酶区和糖苷水解酶11区，对这两个区进行定点突变，得到的突变基因也在大肠杆菌中表达，分离纯化结果显示该新型阿魏酸酯酶及其突变体都成功地在大肠杆菌中表达，并且突变体的酯酶活性远低于未突变体，丰富了阿魏酸酯酶的菌种来源，在提高饲料纤维的消化率、改善动物生产性能方面具有理论上的指导意义。

Description

一种新型阿魏酸酯酶、突变体和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及厌氧真菌Neocallimastix sp.的一种新型阿魏酸酯酶及其突变体，具体涉及厌氧真菌Neocallimastix sp. 的宏基因组筛选、阿魏酸酯酶基因密码子优化、阿魏酸酯酶及其突变体表达、应用。
背景技术
秸秆类粗饲料的组成一般以纤维素、半纤维素及木质素为基本框架，还包括一些以酯键或醚键相连的阿魏酸、香豆酸和芥子酸等酚酸类物质。半纤维素(阿拉伯木聚糖)的侧链上会存在一些阿魏酸，会影响半纤维素酶对半纤维素的有效降解，因此，需要阿魏酸酯酶先断开酯键连接，才能让半纤维素酶完全发挥降解效应。阿魏酸酯酶，主要来源于细菌和一些好氧真菌如黑曲霉菌，是羧酸酯水解酶的一个亚类，根据蛋白质序列及催化底物的差异性可被分为A、B、C、D四种类型，最早分离纯化出的阿魏酸酯酶来源于链霉菌olivochromogenes。
厌氧真菌(来自草食动物消化道内)能够分泌多种高活性的植物细胞壁降解酶，其中就包含阿魏酸酯酶。然而，由于厌氧真菌生长周期较长，又对氧极不耐受，现今关于厌氧真菌阿魏酸酯酶的表达及酶学特性鉴定还很少。Borneman等于1992年从厌氧真菌Neocallimastix MC-2中分离纯化得到阿魏酸酯酶FAE-I和FAE-II，其分子量分别为 69kDa和24kDa，最适pH值范围分别为5.5-6.8和6.4-7.6。因此，挖掘厌氧真菌中新型阿魏酸酯酶可以为该酶的开发提供新的菌株来源，同时筛选高效的阿魏酸酯酶用作饲料酶制剂，可以提高饲料转化率，增加生产效益。
发明内容
本申请要解决的技术问题是：为了弥补厌氧真菌中阿魏酸酯酶研究的不足，本申请提供新型阿魏酸酯酶菌株，该菌株命名为新美鞭菌 Neocallimastix sp.,于2019年04月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，经检测为存活，保藏号为CGMCC No.17595，本发明首次克隆表达了厌氧真菌Neocallimastix sp.的一种新型阿魏酸酯酶及其突变体，为阿魏酸酯酶用作饲料酶制剂高效性提供了理论参考。
本申请解决其技术问题的解决方案是：
本发明的第一个目的是提供一种新型阿魏酸酯酶，该新型阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，具体是：
mngshhhhhhsnglvpvgshMYWGWQNNGWGNGSGNGGKSINDY KREQVSGRDIHVYAPSNLAPNSPLNNSLHGMDLDPNYQSSNTHW ETLADTEGFVPVYPRGNTGMSTWDIQGDKDTNWGLQIIDQMAKE YNIDKNRTYLSGFSMGGMFTYHAMSKIGDKIAAFAPCSGPNVFGA SKAMRPVPIFHVHGTNDDVLQYSQVEGFLKNYRDQFHCPSQADV KTNYPNSENPNATLYTWGPCDKGVYIKHLKLQGRGHSPSKADIG DIWNFVKEYSLTGSTSSGSGNGNGGGNGNNNGSSATGSCSSKITK QGYKCCAANCEVLYIDADGDWGVENGEWCGCGNRVTTSTSDKC SSKITAQGYKCCSANCIIYETDADGDWGVENGEWCGCGGCSTST GGSNTNPGGNGGNGGNGGNTTPVNTDFCKSSQHTGKSDKVTSNKVGSINGIGYELWADSGNNSATFYEDGSFSCSFSNAKDYLCRSGLS FDSTKTHQQIGHMYADFKLVKQNIRNVDYSYVGIYGWSRDPLVE YYVVDNWLSQYRPGDWVGNKKHGDFTIDGAKYTVYENTRYGPS IDGNTQFKQFFSIRQPARDCGTIDITAHFEQWEKFGMKLGKMHEA KVLGEAGSNGVGTSTTADFPYTKVYIK
进一步地，所述的一种新型阿魏酸酯酶，包含酯酶功能区、糖苷水解酶11区(GH11)和两个碳水化合物结合模块(CBM10)；这种新型阿魏酸酯酶不仅可以断开多糖中的阿魏酸酯键，还能发挥多糖水解功能，且该酶的最适温度和最适pH分别为37℃和7.5。
本发明的第二个目的是提供编码上述新型阿魏酸酯酶的基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，具体为：
AGGCAGTGGGGATGCCGAAACAACGGTTGGGGTAACGGG GGTGGGAATGGCGGTAAATCAATTAACGATTACAAACGTGAAC AAGTAAGTGCGCGTGACATTCACGTATACGCTCCTTCTAATCTG GCTCCCAATTCGGCCTTGTTACTGAGTTTGCACGGGATGGACCA GGACCCGATTTACCAACAGTCTAACACGCACTGGGAGACGCTG GCCGATACTGAGCGGTTCGTTGTAGATTACCCTCGCGGAGGGAC CGGCATGTCAACGTGGGATATCCAGGGTGATAAGGATACAAACT GGGTGCTGCAGATTATTGACCAGATGGCGAAGGAGTACATTATT GATTAAGACGGTGTATATCATTCGCGCTTTAGCATGGGAGGCAT GTTCACTTATCACGCCATGTCAAAGATCGGAGACAAGATCGCCG CCTTCGCCCCCTGCTCGGGACCAAACGTGTTTGGCGCTTCTAAA GCGATGCGCCCCGTTCCGATTTTTCATGTTCACGGAACTAATGAT GATGTTCTGCAATACTCACAAGTAGAAGCGTAATTAATTAACTA CCGCGACCAATTCCACTGTCCAAGCCAAGCGGATGTAAAAACG AATTACCCGAATTCCGAGAATCCGAACGCGACTTTGTACACATG GGGTCCCTGTGACAAAGGTGTATACATCAAACATTTGAAATTGC AAGGGCGTGGCCATTCGCCTTCCAAGGCAGACATCGGCGACAT CTGGAACTTTGTAAAAGAATATAGCCTTACAGGCTCCACAAGCA GTGGTTCAGGCAACGGTAACGGCAACGGAAATGGAAACGGTA ACGGTAGTTCGGCCTCGGGGAGCTGCTCTTCGAAAATTACTAAG CAGGGCTATAAGTGTTGTGCGGCGAATTGTGAAGTTCTGTACAT CGATGCAGACGGCGACTGGGGTGTGGAGAATGGCGAGTGGTGT GGGTGCGGGAACCGCGTTACGACCAGCACTTCGGATAAATGTA GTAGCAAGATCACGGCTCAGGGGTATAAATGCTGTAGTGCGAAT TGTATCATTTACGAAACCGACGCCGACGGAGATTGGGGCGTTG AAAATGGTGAGTGGTGTGGTTGTGGTGGCGGTTCGAGCAGTAC TGGTGGTTCCAACACGAACCCGGGGGGAAATGGAGGGAATGG GGGCAACGGAGGTAACACCACGCCCGTTAATACGGATTTTTGC AAATCAAGCCAACATACAGGAAAATCAGACAAGGTGACCAGCA ATAAGGTGGGAAGTATCAACGGGATCGGGTACGAACTGTGGGC TGATTCCGGGAATAATTCAGCGACTTTCTACGAAGATGGGTCTT TTAGTTGCTCCTTTAGCAATGCAAAGGACTATCTTTGCCGTTCG GGTTTGAGTTTTGATTCGACTAAGACGCATCAACAAATTGGACA CATGTACGCCGATTTCAAATTAGTTAAGCAGAACATCCGCAACG TCGATTACTCGTATGTTGGCATTTATGGTTGGTCACGTGACCCAC TTGTTGAATACTATGTGGTTGATAACTGGCTTTCCCAGTACCGTC CCGGAGATTGGGTCGGCAATAATTAACATGGAGATTTCACAATC GATGGAGCAAAGTACACCGTTTACGAAAATACGCGTTACGGCC CTTCAATCGACGGTAATACACAATTCAAACAGGGTTTCAGCATC CGCCAGCAAGCACGTGACTGCGGTACTATCGACATCACAGCCC ATTTTGAGCAATGGGAGAAGTTGGGAATGAAATTGGGCAAGAT GCATGAGGCGAAAGTATTGGGAGAGGCAAGGTCAAACGGCTC GGGAACTTCCGGGACTGCAGATTTCCCGTACGCCAAGGTCTATA TTAAATCC
含有上述编码新型阿魏酸酯酶的基因的重组表达载体、重组细胞或重组菌也在本发明的保护范围内。
进一步地，一种新型阿魏酸酯酶突变体，所述新型阿魏酸酯酶突变体为在SEQ IDNO.2基础上进行位点上的氨基酸突变，其特征在于，所述突变位点位于第126或第510位。
进一步地，所述第126位的丝氨酸被突变为丙氨酸或所述第510 位的谷氨酸被突变为丙氨酸。用于2个不同功能区定点突变的引物是：
S126A-F：5’ATTGCGCATTgccATGGGAGGCA 3’；
S126A-R：5’AGATATAGACGGATTGTATCAATATTC 3’；
E510A-F：5’CGCAGTTGTTgcaTACTATATCC 3’；
E510A-R：5’TCACCTGGCCATCCATGGATG 3’；
本发明的第三个目的是提供一种新型阿魏酸酯酶的筛选表达方法，包括下列步骤：
1)通过基因组学技术从厌氧真菌Neocallimastix sp.的宏基因组中筛选到一种未知阿魏酸酯酶基因；
2)利用大肠杆菌对该未知阿魏酸酯酶基因进行密码子优化，得新型阿魏酸酯酶基因序列；
3)预测新型阿魏酸酯酶的蛋白质结构域，通过同源性比较找出决定酯酶功能区和糖苷水解酶11区的活性位点，设计对应的引物将活性位点上的氨基酸突变使活性丧失，得新型阿魏酸酯酶突变体；
4)在大肠杆菌(DE3)中表达新型阿魏酸酯酶及其突变体，使用镍离子亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤法对这些酶蛋白进行分离纯化；
5)测定新型阿魏酸酯酶的基本酶学特性，分析新型阿魏酸酯酶及其突变体的底物降解特性。测定阿魏酸酯酶的基本酶学特性，主要指最适温度和pH，测定底物降解特性是以4-硝基苯基乙酸酯和阿魏酸甲酯为底物。
具体地，本发明提供应用基因工程重组菌发酵生产所述新型阿魏酸酯酶及其突变体的方法，是将含有编码新型阿魏酸酯酶或其突变体的基因的重组菌(含有新型阿魏酸酯酶或其突变体的基因的大肠杆菌 (DE3)活化培养后接入100mL含100ug/mL氨苄西林钠和20ug/mL 庆大霉素的LB液体培养基中，在37℃、225rpm/min条件下培养6h。随后15mL的菌液分别转移到6个装有1L含100ug/mL氨苄西林钠的LB液体培养基的细颈瓶中，于30℃、225rpm/min条件下振荡培养。当细颈瓶中的液体培养基的OD600值达到0.4时，每个瓶中加入500uL 1M的IPTG(终浓度为0.5mM)，12℃、180rpm/min继续诱导培养24h。5000rpm/min、4℃离心10min，去掉上清用特定缓冲液重悬浮菌体细胞，使用均质器)破碎细胞壁，于12000g、4℃离心30min，收集上清液。使用快速蛋白液相色谱仪按顺序对新型阿魏酸酯酶及其突变体进行镍离子亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤，得纯化的新型阿魏酸酯酶及其突变体。
所述活化培养是从-80℃冰箱中拿出大肠杆菌(DE3)，完成新型阿魏酸酯酶及其突变体的基因转化后涂布于含有100ug/mL氨苄西林钠的LB固体平板上，37℃温室过夜培养。
将上述获得的破碎菌体细胞上清通过镍柱对其进行His纯化后所得纯化溶液，即含有新型阿魏酸酯酶及其突变体的酶液。
重组表达优选以pET28a为表达载体，以大肠杆菌(DE3)为表达宿主构建重组菌。
用于扩增该新型阿魏酸酯酶基因的引物是：
正向引物Forward：
5’AAGCATACGCAGCGGGGATGAGGAAAC 3’；
反向引物Revers：
5’CGGCTCGAGTAATGTACTGTAGACCTTGCCGTACCG 3’；
本发明的第四个目的是提供新型阿魏酸酯酶在降解阿魏酰低聚糖中的应用。
本发明的有益效果：本发明利用基因组学技术从厌氧真菌 Neocallimastix sp.中成功筛选出一种阿魏酸酯酶基因，根据原核系统密码子使用的偏好性及阿魏酸酯酶基因的GC含量和mRNA的二级结构，对该阿魏酸酯酶基因进行密码子优化，得新型阿魏酸酯酶基因序列。该新型阿魏酸酯酶存在酯酶区和糖苷水解酶11区，对这两个区进行定点突变，得到的突变基因也在大肠杆菌中表达，分离纯化结果显示该新型阿魏酸酯酶及其突变体都成功地在大肠杆菌中表达，所编码的新型阿魏酸酯酶基因突变体比酶活都基本丧失，与新型阿魏酸酯酶相比，酯酶区突变体(S126A)和糖苷水解酶11区突变体(E510A) 在降解酯类物质时都表现极低的酶活力。因此，新型阿魏酸酯酶作为酶制剂进行高效工作时，必须保证该酶不同区域的活性及结构的完整性。本发明的新型阿魏酸酯酶及其突变体丰富了阿魏酸酯酶的菌种来源，同时在提高饲料纤维的消化率、改善动物生产性能方面具有理论上的指导意义。
附图说明
图1为本发明的新型阿魏酸酯酶及其突变体筛选表达技术路线图；
图2为新型阿魏酸酯酶及其突变体的SDS-PAGE结果图；
图3为新型阿魏酸酯酶及其突变体降解四种阿魏酰低聚糖释放阿魏酸的结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
在本发明的具体实施例中，氨基酸序列如阿魏酸酯酶的酯酶区突变体是将新型阿魏酸酯酶的第126位的丝氨酸突变成丙氨酸，所得突变体命名为S126A。
在本发明的具体实施例中，氨基酸序列如阿魏酸酯酶的糖苷水解酶11区突变体是将新型阿魏酸酯酶的第510位的谷氨酸突变成丙氨酸。所得突变体命名为E510A。
实施例：新型阿魏酸酯酶及其突变体降解四种阿魏酰低聚糖释放阿魏酸的研究
酶液的制备：
是将含有编码新型阿魏酸酯酶或其突变体的基因的重组菌(含有新型阿魏酸酯酶或其突变体的基因)的大肠杆菌(DE3)活化培养后接入100mL含100ug/mL氨苄西林钠和20ug/mL庆大霉素的LB液体培养基中，在37℃、225rpm/min条件下培养6h。随后15mL的菌液分别转移到6个装有1L含100ug/mL氨苄西林钠的LB液体培养基的细颈瓶中，于30℃、225rpm/min条件下振荡培养。当细颈瓶中的液体培养基的OD600值达到0.4时，每个瓶中加入500uL 1M的IPTG (终浓度为0.5mM)，12℃、180rpm/min继续诱导培养24h。 5000rpm/min、4℃离心10min，去掉上清用特定缓冲液重悬浮菌体细胞，使用均质器)破碎细胞壁，于12000g、4℃离心30min，收集上清液。使用快速蛋白液相色谱仪按顺序对新型阿魏酸酯酶及其突变体进行镍离子亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤，得纯化的新型阿魏酸酯酶及其突变体。
所述活化培养是从-80℃冰箱中拿出大肠杆菌(DE3)，完成新型阿魏酸酯酶及其突变体的基因转化后涂布于含有100ug/mL氨苄西林钠的LB固体平板上，37℃温室过夜培养。
将上述获得的破碎菌体细胞上清通过镍柱对其进行His纯化后所得纯化溶液，即含有新型阿魏酸酯酶及其突变体的酶液。技术路线图如图1所示。
以四种来源于麦麸的阿魏酰低聚糖(FA、FAXX、FAXG和FAX) 为底物，研究新型阿魏酸酯酶(WT)、酯酶区突变体(S126A)和糖苷水解酶11区突变体(E510A)降解这些底物释放阿魏酸浓度的情况。设置三个试验组，每组包含三个重复。
1.先配制1mmol/L的阿魏酰低聚糖液于烧杯，用锡箔纸包裹于 -20℃冻存，用前置于冰上解冻。
2.取上述阿魏酰低聚糖液，加入酶液，配制反应体系为75uL，底物终浓度为0.2mmol/L，酶终浓度为0.5umol/L的溶液，在37℃水浴1h后再进行95℃ 8min酶灭活，随后冷却至室温；
3.加入75uL甲醇于上述灭活液涡旋30s后，15000g离心10min (4℃)，取120uL上清于干净的液相色谱瓶中，使用液相色谱仪测定上清中阿魏酸的浓度，用阿魏酸作底物制作标准曲线计算样品中的阿魏酸浓度。
设置对照组，和实验组的区别在于不加酶液。新型阿魏酸酯酶及其突变体的SDS-PAGE结果如图2所示；新型阿魏酸酯酶及其突变体降解四种阿魏酰低聚糖释放阿魏酸的结果如图3所示。
通过结果得知，WT降解FA、FAXX、FAXG和FAX释放出的阿魏酸浓度分别为186.34±0.64umol/L、158.72±0.24umol/L、 130.84±0.57umol/L和84.45±0.71umol/L。与WT相比，其他两种突变体释放出的阿魏酸浓度都极低，E510A所释放出阿魏酸浓度显著低于 WT(P<0.05)，说明糖苷水解11区的失活会影响酯酶的活性，也即糖苷水解11区对阿魏酸酯酶的酯酶活性有着必要的维持作用。
以上对本申请的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本申请精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种新型阿魏酸酯酶、突变体和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1878
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcagtggg gatgccgaaa caacggttgg ggtaacgggg gtgggaatgg cggtaaatca 60
attaacgatt acaaacgtga acaagtaagt gcgcgtgaca ttcacgtata cgctccttct 120
aatctggctc ccaattcggc cttgttactg agtttgcacg ggatggacca ggacccgatt 180
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tatggttggt cacgtgaccc acttgttgaa tactatgtgg ttgataactg gctttcccag 1560
taccgtcccg gagattgggt cggcaataat taacatggag atttcacaat cgatggagca 1620
aagtacaccg tttacgaaaa tacgcgttac ggcccttcaa tcgacggtaa tacacaattc 1680
aaacagggtt tcagcatccg ccagcaagca cgtgactgcg gtactatcga catcacagcc 1740
cattttgagc aatgggagaa gttgggaatg aaattgggca agatgcatga ggcgaaagta 1800
ttgggagagg caaggtcaaa cggctcggga acttccggga ctgcagattt cccgtacgcc 1860
aaggtctata ttaaatcc 1878
<210> 2
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Tyr Trp Gly Trp Gln Asn Asn Gly Trp Gly Asn Gly Ser Gly Asn
1 5 10 15
Gly Gly Lys Ser Ile Asn Asp Tyr Lys Arg Glu Gln Val Ser Gly Arg
20 25 30
Asp Ile His Val Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Pro Asn Ser Pro Leu
35 40 45
Asn Asn Ser Leu His Gly Met Asp Leu Asp Pro Asn Tyr Gln Ser Ser
50 55 60
Asn Thr His Trp Glu Thr Leu Ala Asp Thr Glu Gly Phe Val Pro Val
65 70 75 80
Tyr Pro Arg Gly Asn Thr Gly Met Ser Thr Trp Asp Ile Gln Gly Asp
85 90 95
Lys Asp Thr Asn Trp Gly Leu Gln Ile Ile Asp Gln Met Ala Lys Glu
100 105 110
Tyr Asn Ile Asp Lys Asn Arg Thr Tyr Leu Ser Gly Phe Ser Met Gly
115 120 125
Gly Met Phe Thr Tyr His Ala Met Ser Lys Ile Gly Asp Lys Ile Ala
130 135 140
Ala Phe Ala Pro Cys Ser Gly Pro Asn Val Phe Gly Ala Ser Lys Ala
145 150 155 160
Met Arg Pro Val Pro Ile Phe His Val His Gly Thr Asn Asp Asp Val
165 170 175
Leu Gln Tyr Ser Gln Val Glu Gly Phe Leu Lys Asn Tyr Arg Asp Gln
180 185 190
Phe His Cys Pro Ser Gln Ala Asp Val Lys Thr Asn Tyr Pro Asn Ser
195 200 205
Glu Asn Pro Asn Ala Thr Leu Tyr Thr Trp Gly Pro Cys Asp Lys Gly
210 215 220
Val Tyr Ile Lys His Leu Lys Leu Gln Gly Arg Gly His Ser Pro Ser
225 230 235 240
Lys Ala Asp Ile Gly Asp Ile Trp Asn Phe Val Lys Glu Tyr Ser Leu
245 250 255
Thr Gly Ser Thr Ser Ser Gly Ser Gly Asn Gly Asn Gly Gly Gly Asn
260 265 270
Gly Asn Asn Asn Gly Ser Ser Ala Thr Gly Ser Cys Ser Ser Lys Ile
275 280 285
Thr Lys Gln Gly Tyr Lys Cys Cys Ala Ala Asn Cys Glu Val Leu Tyr
290 295 300
Ile Asp Ala Asp Gly Asp Trp Gly Val Glu Asn Gly Glu Trp Cys Gly
305 310 315 320
Cys Gly Asn Arg Val Thr Thr Ser Thr Ser Asp Lys Cys Ser Ser Lys
325 330 335
Ile Thr Ala Gln Gly Tyr Lys Cys Cys Ser Ala Asn Cys Ile Ile Tyr
340 345 350
Glu Thr Asp Ala Asp Gly Asp Trp Gly Val Glu Asn Gly Glu Trp Cys
355 360 365
Gly Cys Gly Gly Cys Ser Thr Ser Thr Gly Gly Ser Asn Thr Asn Pro
370 375 380
Gly Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Asn Thr Thr Pro Val
385 390 395 400
Asn Thr Asp Phe Cys Lys Ser Ser Gln His Thr Gly Lys Ser Asp Lys
405 410 415
Val Thr Ser Asn Lys Val Gly Ser Ile Asn Gly Ile Gly Tyr Glu Leu
420 425 430
Trp Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Glu Asp Gly Ser
435 440 445
Phe Ser Cys Ser Phe Ser Asn Ala Lys Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly
450 455 460
Leu Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr His Gln Gln Ile Gly His Met Tyr
465 470 475 480
Ala Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Asn Ile Arg Asn Val Asp Tyr Ser
485 490 495
Tyr Val Gly Ile Tyr Gly Trp Ser Arg Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr
500 505 510
Val Val Asp Asn Trp Leu Ser Gln Tyr Arg Pro Gly Asp Trp Val Gly
515 520 525
Asn Lys Lys His Gly Asp Phe Thr Ile Asp Gly Ala Lys Tyr Thr Val
530 535 540
Tyr Glu Asn Thr Arg Tyr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asn Thr Gln Phe
545 550 555 560
Lys Gln Phe Phe Ser Ile Arg Gln Pro Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile
565 570 575
Asp Ile Thr Ala His Phe Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Met Lys Leu
580 585 590
Gly Lys Met His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Ser Asn Gly
595 600 605
Val Gly Thr Ser Thr Thr Ala Asp Phe Pro Tyr Thr Lys Val Tyr Ile
610 615 620
Lys
625

Claims (8)

1.一种新型阿魏酸酯酶，其特征在于，该新型阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
2.如权利要求1所述的一种新型阿魏酸酯酶，其特征在于，包含酯酶功能区、糖苷水解酶11区(GH11)和两个碳水化合物结合模块(CBM10)。
3.编码权利要求2所述的一种新型阿魏酸酯酶的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
4.含有权利要求3所述的编码新型阿魏酸酯酶的基因的重组表达载体、重组细胞或重组菌。
5.如权利要求1所述的一种新型阿魏酸酯酶突变体，所述新型阿魏酸酯酶突变体为在SEQ ID NO.2基础上进行位点上的氨基酸突变，其特征在于，所述突变位点位于第126或第510位。
6.如权利要求5所述的一种新型阿魏酸酯酶突变体，其特征在于，所述第126位的丝氨酸被突变为丙氨酸或所述第510位的谷氨酸被突变为丙氨酸。
7.如权利要求1所述的一种新型阿魏酸酯酶的筛选表达方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)通过基因组学技术从厌氧真菌Neocallimastix sp.的宏基因组中筛选到一种未知阿魏酸酯酶基因；
2)利用大肠杆菌对该未知阿魏酸酯酶基因进行密码子优化，得新型阿魏酸酯酶基因序列；
3)预测新型阿魏酸酯酶的蛋白质结构域，通过同源性比较找出决定酯酶功能区和糖苷水解酶11区的活性位点，设计对应的引物将活性位点上的氨基酸突变使活性丧失，得新型阿魏酸酯酶突变体；
4)在大肠杆菌(DE3)中表达新型阿魏酸酯酶及其突变体，使用镍离子亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤法对这些酶蛋白进行分离纯化；
5)测定新型阿魏酸酯酶的基本酶学特性，分析新型阿魏酸酯酶及其突变体的底物降解特性。
8.如权利要求1所述的新型阿魏酸酯酶在降解阿魏酰低聚糖中的应用。
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