CN114774388A

CN114774388A - 一种阿魏酸酯酶及其突变体n.7-16与应用

Info

Publication number: CN114774388A
Application number: CN202210580375.4A
Authority: CN
Inventors: 成艳芬; 马玉萍; 朱伟云
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-03-16
Filing date: 2021-03-16
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-03-16
Also published as: CN114958805B; CN112980812B; CN114774388B; CN114958805A; CN112980812A

Abstract

本发明公开了一种阿魏酸酯酶及其突变体N.7‑16与应用。所述的阿魏酸酯酶具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其性质稳定，反应pH为6‑8，反应温度为37‑54℃。本发明在所述的阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基础上分别通过增加阿魏酸酯酶中二硫键的数量、改变其碳水化合物结合模块的侧链基团以及改变催化结构域电荷，得到了阿魏酸酯酶突变体N.7‑16，与原始阿魏酸酯酶相比，此突变体的比酶活均得到明显提高。本发明得到的阿魏酸酯酶以及突变体性质稳定，有助于阿魏酸酯酶的工业化应用。

Description

一种阿魏酸酯酶及其突变体N.7-16与应用

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种阿魏酸酯酶及其突变体N.7-16与应用。

背景技术

阿魏酸酯酶是一种能够水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，进而将阿魏酸游离出来的一种酶，它是羧酸酯水解酶的一个亚类，也是一种胞外酶。目前，在食品工业中通常利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸。在饲料工业与造纸工业可利用阿魏酸酯酶提高纤维饲料的消化率和帮助脱除木质素。因此，阿魏酸酯酶是具有广阔应用前景的。

自然界中的阿魏酸酯酶广泛存在于植物及微生物中，主要来源为微生物，真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶。迄今为止，研究人员已经从微生物中分离和鉴定了80多种阿魏酸酯酶，其中主要来源于真菌。但由野生型菌株分泌的阿魏酸酯酶活性相对较低且产酶过程耗时较长，因此就需要通过丰富的基因资源来获得酶活更高的新型的阿魏酸酯酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阿魏酸酯酶及其突变体N.7-16与应用。所述的阿魏酸酯酶具有稳定的性质，通过定点突变得到突变体的酶活均明显提升。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种阿魏酸酯酶，其氨基酸如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

进一步的，所述阿魏酸酯酶的反应pH为6-8，反应温度为37-54℃；Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺能够明显抑制阿魏酸酯酶活性。

进一步的，所述阿魏酸酯酶的最适反应pH为7，最适反应温度为45℃。

本发明还提供了阿魏酸酯酶突变体N.1-300，氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，其是由氨基酸序列为SEQ ID No.1的阿魏酸酯酶的第300位氨基酸由甘氨酸变为半胱氨酸获得的。

本发明还提供了所述的阿魏酸酯酶突变体N.1-300的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

本发明还提供了阿魏酸酯酶突变体N.7-16，其氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，其是由氨基酸序列为SEQ ID No.2的阿魏酸酯酶的第16位氨基酸由赖氨酸变为精氨酸获得的。

本发明还提供了所述的阿魏酸酯酶突变体N.7-16的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

本发明还提供了阿魏酸酯酶突变体N.9-98，其氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，其是由氨基酸序列为SEQ ID No.3的阿魏酸酯酶的第98位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸获得的。

本发明还提供了所述的阿魏酸酯酶突变体N.9-98的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.18所示。

进一步的，所述的阿魏酸酯酶突变体N.1-300、所述的阿魏酸酯酶突变体N.7-16、或者所述的阿魏酸酯酶突变体N.9-98的比酶活力明显高于所述阿魏酸酯酶的比酶活力。

本发明还提供了所述的阿魏酸酯酶、或者所述的阿魏酸酯酶突变体N.1-300、或者所述的阿魏酸酯酶突变体N.7-16、或者阿魏酸酯酶所述的突变体N.9-98在用于制备降解阿魏酸甲酯的制剂中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明通过基因技术获得了3个不同于现有阿魏酸酯酶的新型阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9，并在它们的氨基酸序列的基础上通过定点突变获得了3个比酶活得到明显提升的阿魏酸酯酶突变体N.1-300、N.7-16、N.9-98，其比酶活分别比原始阿魏酸酯酶提高了9.91％、11.47％、14.86％，也同时证明增加阿魏酸酯酶中二硫键的数量、改变其碳水化合物结合模块(CBM)的侧链基团以及改变结构域电荷均能够影响阿魏酸酯酶的酶活，并提高其酶活，为提高阿魏酸酯酶酶活，获得更好活性的阿魏酸酯酶提供了基础以及突变方式。本发明得到的阿魏酸酯酶以及突变体性质稳定，更有利于阿魏酸甲酯的分解以及阿魏酸的制取，且拓展了阿魏酸酯酶的制备途径和获取方式，有利于阿魏酸酯酶在工业生产中的应用。

附图说明

图1为PCR扩增阿魏酸酯酶基因结果；其中泳道1、4、6分别为PCR扩增阿魏酸酯酶基因N.1、N.7、N.9。

图2为双酶切质粒pHBM905BDM结果；其中1为对照质粒pHBM905BDM；泳道2为质粒pHBM905BDM的双酶切。

图3为培养物上清中的阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9成功表达；其中泳道1、2、3分别为阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9。

图4为平板检测阿魏酸酯酶活性结果，其中1、2、3分别为阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9水解底物产生的透明圈。

图5为阿魏酸酯酶的纯化结果图；其中泳道1、2、3分别为阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9。

图6为阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9的反应适合pH结果。

图7为阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9的pH稳定性结果。

图8为阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9的反应适合温度结果。

图9为阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9的温度稳定性结果。

图10为金属离子对阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9酶活性的影响结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；未注明具体来源的材料，均为市售产品。

配置培养基：

1、BMGY固体培养基(每100mL)：酵母提取物1.0g，胰蛋白胨2.0g，含(NH₄)₂SO₄的YNB1.34g，甘油1g，100mM pH＝6.0的磷酸钾缓冲液，115℃灭菌20min；

2、BMMY液体培养基(每100mL)：酵母提取物1.0g，胰蛋白胨2.0g，含(NH₄)₂SO₄的YNB1.34g，100mM pH＝6.0的磷酸钾缓冲液，115℃灭菌20min；

3、MD固体培养基(每100mL)：葡萄糖2.0g，含(NH₄)₂SO₄的YNB 1.34g，琼脂1.6g，115℃灭菌20min；

4、YPD液体培养基(每100mL)：酵母提取物1.0g，胰蛋白胨2.0g，葡萄糖2.0g，115℃灭菌20min；

5、YPD固体培养基(每100mL)：酵母提取物1.0g，胰蛋白胨2.0g，葡萄糖2.0g，琼脂1.6g，115℃灭菌20min。

实施例1：阿魏酸酯酶的制备与纯化

一、阿魏酸酯酶的制备

1、PCR扩增反应

将阿魏酸酯酶N.1、阿魏酸酯酶N.7和阿魏酸酯酶N.9的氨基酸序列(分别如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示)交由上海生工生物有限公司转为基因序列，并根据表达菌株毕赤酵母密码子的偏好性对基因序列进行密码子优化，最后得到长度分别为1065bp、1203bp、864bp的阿魏酸酯酶N.1基因、阿魏酸酯酶N.7基因、阿魏酸酯酶N.9基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示。根据阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列设计如表1所示的3对扩增引物，并以其模板进行PCR扩增。

表1阿魏酸酯酶基因扩增PCR引物

PCR反应体系如表2，PCR程序如表3所示。

表2PCR体系

表3PCR程序

反应结束后样品暂存于4℃冰箱。

PCR扩增的目的基因，通过0.8％的琼脂糖核酸电泳检测，证实扩增片段与目的基因大小一致见图1。

2、质粒pHBM905BDM双酶切

质粒pHBM905BDM双酶切体系如表4所示：

表4pHBM905BDM双酶切体系

37℃反应5h后，用琼脂糖凝胶电泳验证条带是否酶切完全，80℃终止反应15min，胶回收目的片段后保存于-20℃冰箱。

限制性内切酶Not I、Rsr II切割载体质粒pHBM905BDM获得载体片段如图2所示，与对照相比质粒完全切割。

3、回收目的DNA片段

琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，琼脂糖凝胶经核酸染料染色1h后置于蓝光仪下切割目的条带，目的条带用Omega公司胶回收试剂盒回收，方法参考试剂盒说明书，回收的DNA样品存放于-20℃。

4、载体片段连接

载体片段连接反应的体系如表5所示：

表5连接反应的体系

冰上反应5min后转化E.coli DH5α感受态。

5、重组pHBM905BDM表达质粒的线性化

已构建插入目的序列的pHBM905BDM表达质粒Sal I酶切线性化体系如表6所示：

表6Sal I酶切体系

37℃反应3h，80℃反应10min，将样品胶回收后保存于-20℃冰箱。

6、毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115感受态细胞的制备

(1)平板划线：在超净工作台中，使用接种环将Pichia pastoris GS115菌株在YPD平板上三区划线，用封口膜封住培养皿并倒置于28℃恒温培养箱中培养48小时；

(2)接种：挑取单菌落于20mL YPD培养基中，28℃、220r/min培养菌液OD₆₀₀≈3；

(3)转接：将上述菌液转接到100mL YPD培养基中，使起始OD₆₀₀＝0.3，28℃、220r/min培养；

(4)离心收菌：当菌液OD₆₀₀＝1.5～2.0时，3000r/min、离心5min；

(5)ddH₂O洗菌：在超净工作台中去上清，用30mL左右预冷的超纯水轻柔重悬细胞2次，3000r/min、离心5min；

(6)SB洗菌：用8mL的SB溶液重悬细胞，30℃、220r/min摇30min；

(7)1M sorbitol洗菌：3000r/min、离心5min后去上清，用15mL预冷的1M sorbitol重悬细胞3次，再用1mL预冷的1M sorbitol重悬细胞；

(8)分装感受态：每管80μL感受态分装于冻存管中，先将感受态细胞放入-20℃冰箱中慢冻几小时，再放入-80℃冰箱中保存。

7、Pichia pastoris GS115感受态细胞的转化

(1)电转杯准备：清洗干净酵母电转杯并置于去离子水中超声15min，倒掉去离子水用75％乙醇超声15min，倒掉75％乙醇再用去离子水超声15min，最后用无水乙醇超声15min，将电转杯置于55℃烘箱中烘干；

(2)取80μL制备好的Pichia pastoris GS115感受态细胞和1μg左右线性化回收后的表达质粒混合，转移到冰上预冷的电转杯中静置5min；

(3)电转：将电转杯擦干放入电转仪(Biorad)中电击(电击参数1500V，25μF，200Ω，2mm)；电转后立即加入200μL MD和200μl 1M的sorbitol，轻柔混匀后转移到1.5ml Ep管中，28℃、220r/min孵育1～2h；

(4)涂板培养：孵育后的混合物3000r/min离心2min，去上清，留下约100μl菌液吸打混匀之后涂MD平板，平板倒置于28℃培养箱中培养48-72h。

8、PCR筛选重组毕赤酵母

(1)挑取MD平板上的单菌落于1.5ml EP管中，加入50μl去离子水，加入1/4去离子水体积的玻璃珠(直径0.5mm)。

(2)置于beat机上剧烈震荡30s，冰上放置10s，震荡10次，12000r/min，离心10min。

(3)取1μl上清做PCR验证是否为阳性克隆子。PCR条件如表7，PCR程序如表3所示。

表7PCR体系

9、24孔板筛选重组毕赤酵母

(1)PCR验证为阳性克隆的酵母单菌落接种到每孔含5ml BMGY的24孔板内，同一单菌落标记一致，28℃、220r/min培养36～48h；

(2)离心菌液去上清，每孔加入2ml BMMY，28℃、220r/min培养，每隔12h加入20μL的甲醇诱导酵母表达目的蛋白；

(3)诱导96h后，取菌液上清用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳筛选可以表达目的蛋白的菌株。

10、聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测蛋白表达

(1)配置12％的分离胶和5％的浓缩胶，组分如表8和9所示：

表8 12％的分离胶组分

表9 5％的浓缩胶组分

(2)煮样：取80μL上清液，加入20μL 5×蛋白上样loading，100℃煮10min，待样品冷却至室温后，12000r/min离心1min。

(3)跑胶：取20μL离心后样品加入上层胶孔中，电泳条件浓缩胶用80V，分离胶用120V。

(4)染色：待目的蛋白电泳至分离胶底部时，结束电泳，用考马斯亮蓝染色液室温染色4h或过夜。

(5)脱色：将染色后的胶用清水冲洗干净，再置入考马斯亮蓝脱色液中，室温脱色至条带显现并分析结果。

结果如图3所示，培养物上清成功表达目的蛋白。

11、阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的摇瓶表达

(1)接种：取重组阳性单菌落接种于100mL BMGY液体培养基，28℃、220r/min培养至OD₆₀₀＝8～12。

(2)转接：离心收集菌液，弃上清，用30mL BMMY培养基重悬。

(3)诱导：每隔12h向菌液中添加30μL甲醇，持续诱导120h。

(4)收集上清：诱导后的菌液，以10000r/min的速度离心20min，上清暂存于4℃冰箱或者用超滤管浓缩后放置于-80℃超低温冰箱。

二、阿魏酸酯酶蛋白浓度测定与纯化

1、蛋白浓度测定

按Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书绘制蛋白浓度标准曲线(BSA蛋白用PBS稀释)和目的蛋白浓度。

2、蛋白纯化

(1)取适量Ni-NTA珠于小型层析柱空柱(60ml，26.2×134mm)中，先用PBS洗3次，再用10mM咪唑洗3次，活化Ni珠。

(2)粗酶液与Ni珠在4℃下用静音混合器混合60min。

(3)待目的蛋白与Ni珠结合后，收集透过筛板流出的上清。洗涤Ni珠，用PBS洗3次；10mM和20mM咪唑洗脱杂蛋白3次；200mM咪唑洗脱目的蛋白3次；再用1M咪唑清洗Ni珠。

(4)SDS-PAGE电泳检测分析目的条带纯度，使用无杂蛋白的阿魏酸酯酶测定酶学性质。

纯化结果如图4，SDS-PAGE显示纯化蛋白较为干净可用于酶活性质测定。

实施例2：阿魏酸酯酶酶学性质测定

1、阿魏酸酯酶酶活定义

在一定温度和pH条件下，每分钟阿魏酸酯酶水解阿魏酸甲酯产生1μmol阿魏酸所需的酶量定义为1个酶活单位，以U表示。酶的比酶活指在特定条件下，每mg阿魏酸酯酶所具有的酶活力单位数。

2、酶活测定原理

阿魏酸酯酶在一定温度和pH条件下，水解阿魏酸甲酯生成阿魏酸，通过在0D＝350nm下测定反应前后体系中阿魏酸甲酯吸光度的变化，计算酶解阿魏酸甲酯的减少量，进而得出阿魏酸酯酶的活性。

3、阿魏酸酯酶的平板筛选

100ml的去离子水中加入1g底物阿魏酸甲酯和1.5g琼脂粉，用微波炉加热溶解至均一溶液，将加热好的溶液倒入培养皿中，室温冷却。在冷却后的固体平板上点5μl发酵上清，37℃过夜培养后检测有无水解圈判断发酵上清是否有酶活。

结果如图4所示，平板上出现水解圈，说明阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9能够分解平板中的阿魏酸甲酯，即在毕赤酵母中表达的阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9具有活性。

4、阿魏酸甲酯浓度标准曲线的绘制

(1)用甲醇作为溶剂配制100mM的阿魏酸甲酯母液，由于不同pH下相同浓度的阿魏酸甲酯溶液吸光值不同，所以在每个整点pH时用对应的pH溶液将母液稀释成不同浓度的标准液：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mM；pH 3.0-7.0(0.1M柠檬酸磷酸盐)，pH 7.0-9.0(0.1M Tris-HCl)、pH 9.0-11.0(0.1M Glycine-NaOH)。

(2)在96孔板中加入100μL标准液，用酶标仪在波长350nm下，测定其吸光度；

(3)以阿魏酸甲酯的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程，回归系数(R²)大于0.999，方可用。

5、pH对阿魏酸酯酶酶活的影响

(1)阿魏酸酯酶的最适pH

以酶标板每孔为反应容器，采用100μl的反应体系，以10mM的阿魏酸甲酯为底物。反应温度为37℃、波长350nm下反应1h，每隔3min测定pH在4、5、6、7、8、9、10处的吸光值，pH3.0-7.0(0.1M柠檬酸磷酸盐)，pH 7.0-9.0(0.1M Tris-HCl)、pH 9.0-11.0(0.1M Glycine-NaOH)。以最高酶活作为100％，计算不同pH下的相对酶活，得到阿魏酸酯酶反应的最适pH。

(2)阿魏酸酯酶的pH稳定性

选择阿魏酸酯酶最适pH及其左右两个pH点为孵育缓冲液，以阿魏酸甲酯为反应底物，等量酶在37℃下孵育，以孵育前酶活为100％，隔点取样测定剩余酶活。

阿魏酸酯酶反应的最适pH的结果如图6所示，三种阿魏酸酯酶的最适pH都为7。阿魏酸酯酶的pH稳定性的结果如图7所示，三种阿魏酸酯酶的pH稳定性都较好，pH稳定性最好的是阿魏酸酯酶N.7，分别在pH＝6、7、8下孵育8h后剩余酶活都还在90％左右。

6、温度对阿魏酸酯酶酶活的影响

(1)阿魏酸酯酶的最适温度

分别在18℃、28℃、37℃、45℃、53℃、62℃下，以10mM阿魏酸甲酯为底物，反应30min后煮沸终止反应，离心后取100μl上清测定OD₃₅₀下的吸光值。以最高酶活作为100％，计算不同温度下的相对酶活，得到阿魏酸酯酶反应的最适温度。

(2)阿魏酸酯酶的温度稳定性

以阿魏酸甲酯为反应底物，等量酶在最适温度及其左右两个温度下孵育，以孵育前酶活为100％，隔点取样测定剩余酶活。

阿魏酸酯酶反应的最适温度的结果如图8所示，在18～63℃范围内三种阿魏酸酯酶都具有活性，且它们的最适反应温度均为45℃。阿魏酸酯酶的温度稳定性的结果如图9所示，温度越高三种阿魏酸酯酶的酶活越低；温度稳定性最好的是阿魏酸酯酶N.7，37℃孵育12h后剩余酶活高达90％以上；其次温度稳定性较好的是阿魏酸酯酶N.1，45℃孵育9h后剩余酶活在60％以上。

7、金属离子对阿魏酸酯酶的酶活影响

在酶促反应体系中分别加入终浓度为5mmol/L的金属离子(Ca²⁺、Na⁺、K⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Co³⁺)与阿魏酸酯酶孵育10min后加入阿魏酸甲酯，pH＝7(0.1M Tris-HCl)，37℃下反应30min后煮沸终止反应，离心机12000r/min，离心5min测定OD350下的吸光值。以不加金属离子的反应体系为对照组。

如图10所示，不同的金属离子对阿魏酸酯酶活性都有一定影响，对阿魏酸酯酶N1、N.7、N.9具有明显抑制作用的金属离子有Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺(P<0.05)，三种金属离子的抑制程度各有差别；Ca²⁺能显著提高阿魏酸酯酶N.1、N.7的活性(P<0.05)。

8、阿魏酸酯酶的比酶活

分别配置0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mM的阿魏酸甲酯，加入等量纯化后的阿魏酸酯酶，在最适温度和pH的下反应1h，每隔2min测定波长350nm下的吸光值，进行双倒数作图并计算得到的K_m和V_max。

在最适pH和温度条件下测定重组酶催化不同浓度阿魏酸甲酯的反应速率，按照Linewear-Burk作图得到相应的V_max与K_m值，计算得出K_cat、K_cat/K_m值。阿魏酸酯酶动力学参数如表10所示。

V_max表示酶一定量的前提下，随着底物浓度的增加酶促反应速率到达的最大值；K_m反应酶与底物之间的亲和力，K_m越大，酶对底物得亲和力越小；K_cat表示酶催化特定底物的能力，K_cat越大催化能力越强；K_cat/K_m反应出酶对底物的催化效率，该值同时反映了酶对底物的亲和力和催化能力，K_cat/K_m越大催化效率越高。由表10可知，阿魏酸酯酶N.1的V_max最大为96.26U mg^-1，虽然阿魏酸酯酶N.7对阿魏酸甲酯的亲和力最高，但是阿魏酸酯酶N.1对阿魏酸甲酯的高催化能力使得最终阿魏酸酯酶N.1的催化效率最高。

表10阿魏酸酯酶的酶促动力学参数

实施例3：阿魏酸酯酶突变体的获取

分别以实施例1得到的阿魏酸酯酶N.1基因、阿魏酸酯酶N.7基因、阿魏酸酯酶N.9基因的核苷酸序列为模板，对比分析阿魏酸酯酶的催化结构域和底物结合结构域，根据其氨基酸序列进行定点突变。

增加阿魏酸酯酶N.1(核苷酸序列SEQ ID No.4)的二硫键的数量获得阿魏酸酯酶N.1-300，阿魏酸酯酶N.1-300为含G300C单点突变的突变体(氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，编码核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，第300位氨基酸由甘氨酸变为半胱氨酸，其对应的DNA序列由GGT变为TGT)。改变阿魏酸酯酶N.7(核苷酸序列SEQ ID No.5)碳水化合物结合模块(CBM)的侧链基团，探究该区域变化对酶活产生的影响获得阿魏酸酯酶N.7-16，阿魏酸酯酶N.7-16为含K16R单点突变的突变体(氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，编码核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，第16位氨基酸由赖氨酸变为精氨酸，其对应的DNA序列由AAG变为AGA)。将阿魏酸酯酶N.9(核苷酸序列SEQ ID No.6)催化结构域中的碱性氨基酸突变为酸性氨基酸，探究催化结构域电荷的变化对酶活的影响获得阿魏酸酯酶N.9-98，阿魏酸酯酶N.9-98为含K98E单点突变的突变体(氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，编码核苷酸序列如SEQ ID No.18所示，第98位氨基酸由赖氨酸变为谷氨酸，其对应的DNA序列由AAG变为GAG)。

阿魏酸酯酶突变体按照实施例1中的方法转化毕赤酵母，使其表达，再利用底物阿魏酸甲酯测定突变前阿魏酸酯酶N.1、N.7、N.9的比酶活以及阿魏酸酯酶突变体的比酶活，结果如表11所示，阿魏酸酯酶突变体的比酶活均有了不同幅度的提高，其中阿魏酸酯酶突变体N.1-300相较于N.1比酶活提高了9.91％，阿魏酸酯酶突变体N.7-16相较于N.7比酶活提高了11.47％，阿魏酸酯酶突变体N.9-98相较于N.9比酶活提高了14.86％。

表11突变前后阿魏酸酯酶的比酶活

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种阿魏酸酯酶及其突变体与应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 355

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Cys Phe Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Pro Cys Cys Glu Asn Thr Asn

1 5 10 15

Glu Val Val Ala Val Asp Glu Asn Gly Val Trp Gly Ile Glu Asn Gly

20 25 30

Val Trp Cys Gly Ile Gly His Ser Ile Lys Asn Asp Asp Tyr Glu Ser

35 40 45

Ser Leu Asn Asn Thr Asp Trp Lys Leu Leu Glu Gln Gln Gln Gln Gln

50 55 60

Gln Gln Gln Gln Asn Ile Ile Gln Lys Arg Gln Tyr Gln Gly Asp Tyr

65 70 75 80

Met Ser Lys Leu Arg Val Val Asn Thr Cys Pro Met Glu Ala Arg Phe

85 90 95

Lys Gln Asn Gly Ile Asn Tyr Pro Thr Ala Gln Lys Ile Thr Tyr Phe

100 105 110

Ser Arg Thr Thr Asn Lys Asn Arg Gln Met Asn Ile Ile Leu Pro Val

115 120 125

Gly Tyr Asn Pro Asn Lys Arg Tyr Pro Val Leu Tyr Phe Leu His Gly

130 135 140

Met Leu Gln Tyr Glu Asp Ser Met Leu Glu Glu Asn Ile Gly Thr Ile

145 150 155 160

Ala Ile Pro Thr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Lys Ala Lys Glu Met Ile

165 170 175

Ile Val Leu Pro Asn Val Tyr Ala Pro Pro Pro Gly Lys Glu Ala Pro

180 185 190

Ala Glu Phe Asn Glu Ala His Phe Leu Gly Tyr Asn Asn Phe Ile Asn

195 200 205

Glu Ile Val Asn Asp Ile Met Pro Tyr Met Gln Ser His Tyr Ser Val

210 215 220

Ala Thr Gly Arg Glu Asn Thr Ala Ile Cys Gly Phe Ser Met Gly Gly

225 230 235 240

Arg Thr Ser Ile Tyr Ile Gly Phe Gln Arg Pro Asp Leu Phe Gly Tyr

245 250 255

Val Gly Ala Phe Ser Pro Ala Pro Gly Leu Ile Pro Ala Asp Asp Ser

260 265 270

Asn Gly His His Asn Gly Leu Tyr Thr Val Asn Asn Phe Arg Ser Asn

275 280 285

Ser Pro Ala Pro Ile Val Thr Leu Ile Ser Cys Gly Thr Asn Asp Ser

290 295 300

Ala Val His Gln Phe Pro Lys Glu Tyr His Glu Val Leu Thr Arg Asn

305 310 315 320

Asn Gln Arg His Ile Trp Phe Glu Ile Pro Gly Ala Asp His Asp Ala

325 330 335

Arg Ala Ile Ser Ala Gly Leu Tyr Asn Phe Val Ser Ala Ala Phe Gly

340 345 350

Ala Leu Asn

355

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Cys Trp Ser Glu Glu Tyr Gly Tyr Pro Cys Cys Gln Glu Thr Lys

1 5 10 15

Asp Val Val Lys Thr Asp Glu Ala Gly Ala Trp Gly Ile Glu Asn Gly

20 25 30

Glu Trp Cys Gly Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala Glu Asp Val Ile

35 40 45

Glu Ser Gly Ser Asp Ser Asp Asn Asp Asp Glu Leu Leu Asp Thr Ser

50 55 60

Asp Val Ala Glu Ile Val Glu Pro Thr Glu Ser Thr Val Pro Glu Val

65 70 75 80

Pro Glu Val Pro Gly Ile Pro Glu Asn Pro Phe Gly Glu Ser Pro Phe

85 90 95

Pro Gly Gly Ala Gly Glu Glu Ile Gln Trp Asn Ala Asn Ala Asn Tyr

100 105 110

Thr Pro Ala Glu Ile Pro Asn Thr Ala Val Ser Glu Tyr Met Ser Lys

115 120 125

Leu Val Val Lys Asp Tyr Cys Pro Ala Asp Val Ser Ser Pro Gln Glu

130 135 140

Gly Val Glu Tyr Pro Thr Ala Glu Lys Ile Thr Tyr Tyr Ser Asn Thr

145 150 155 160

Thr Ala Asn Glu Arg Lys Met Asn Val Ile Leu Pro Val Gly Tyr Thr

165 170 175

Glu Ser Lys Lys Tyr Pro Val Leu Tyr Phe Leu His Gly Ile Met Gly

180 185 190

Asp Glu Asp Thr Met Leu Leu Thr Gly Pro Asp Thr Ile Ala Ile Pro

195 200 205

Thr Asn Leu Ile Asn Ser Gly Leu Ala Lys Glu Met Ile Ile Val Leu

210 215 220

Pro Asn Gln Tyr Ala Pro Ala Pro Gly Thr Glu Ile Pro Pro Ala Leu

225 230 235 240

Thr Gln Glu Tyr Phe Asp Gly Tyr Asp Asn Phe Ile Asn Glu Leu Val

245 250 255

Asn Asp Ile Met Pro Tyr Ile Glu Ser Asn Tyr Ser Val Ala Thr Gly

260 265 270

Arg Glu Asn Thr Ala Val Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Arg Asn Ser

275 280 285

Leu Tyr Ile Gly Tyr Lys Arg Ser Asp Leu Phe Gly Tyr Val Gly Ala

290 295 300

Phe Ser Pro Ala Pro Gly Val Val Pro Gly Asp Asp Phe Ser Gly His

305 310 315 320

His Pro Gly Leu Phe Lys Val Glu Ser Glu Phe Arg Thr Asp Tyr Pro

325 330 335

Pro Ile Val Thr Leu Ile Ser Gly Gly Thr Lys Asp Ser Ile Val Gly

340 345 350

Val Phe Pro Lys Ser Tyr His Asp Ile Leu Thr Thr Asn Glu Gln Asp

355 360 365

His Ile Trp Val Glu Val Pro Glu Ala Asp His Asp Gly Thr Ala Leu

370 375 380

Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn Phe Ile Gln Thr Ala Phe Gly Ala Leu Asp

385 390 395 400

Asn

<210> 3

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Leu Ala Lys Asn Tyr Leu Lys Lys Ile Lys Ile Ile Asn Pro

1 5 10 15

Cys Pro Thr Asn Leu Leu Leu Arg His Ala Gly Val Ser Tyr Gly Asn

20 25 30

Ile Ile Arg Asp Lys Tyr Tyr Ser Lys Thr Ile Asn Asp Ile Lys Pro

35 40 45

Ile Thr Leu Ile Leu Pro Lys Asp Phe Lys Glu Asn Lys Thr Tyr Pro

50 55 60

Val Leu Tyr Leu Leu His Gly Leu Phe Ser Thr Glu Glu Ser Leu Leu

65 70 75 80

Glu Asp Gly Tyr Asn Ala Asp Asn Ile Leu Phe Asn Leu Ile His Glu

85 90 95

Lys Lys Ala Lys Asp Met Ile Leu Ala Leu Pro Asn Gln Tyr Thr Pro

100 105 110

Val Asn Gly Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Phe Asp Gln Lys His Tyr Asp

115 120 125

Gly Tyr Asp Asn Phe Ile Asn Asp Leu Val His Asp Ile Met Pro Phe

130 135 140

Met Glu Lys Asn Tyr Pro Ile Ala Lys Gly Arg Glu Asn Thr Ala Ile

145 150 155 160

Ser Gly Phe Ser Met Gly Gly Arg Asn Ser Leu Tyr Ile Gly Tyr Thr

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe Ser Pro Ala Pro Gly

180 185 190

Val Thr Pro Gly Arg Asp Ile Tyr Asn Glu Leu Lys Gly Leu Phe Lys

195 200 205

Glu Ser Glu Phe Arg Val Lys Asp Glu Lys Leu Thr Pro Lys Val Ser

210 215 220

Leu Ile Cys Gly Gly Thr Asn Asp Phe Ile Val Gly Asn Thr Pro Glu

225 230 235 240

Lys Tyr His Lys Ile Leu Glu Lys Asn Lys Gln Pro His Val Trp Tyr

245 250 255

Pro Ile Pro Gly Ala Asp His Asp Thr Asp Ala Phe Thr Ser Gly Tyr

260 265 270

Tyr Asn Phe Val Thr Ser Ile Phe Asp Ile Leu Asn Lys Lys Lys Asn

275 280 285

<210> 4

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gattgtttct ctacccaatt gggttaccca tgttgtgaga acactaacga ggttgttgct 60

gttgatgaga acggtgtttg gggtattgag aacggtgttt ggtgtggtat tggtcactct 120

atcaagaacg atgattacga gtcttctttg aacaacactg attggaagtt gttggagcag 180

caacaacaac aacaacagca acaaaacatt attcaaaaga gacaatacca aggtgactac 240

atgtctaagc ttagagttgt taacacttgt ccaatggagg ctcgttttaa gcaaaacggt 300

attaactacc caactgctca aaagattact tacttctcta gaaccaccaa caagaacaga 360

caaatgaaca ttattttgcc agttggttac aaccctaaca agagataccc tgttttgtac 420

ttcttgcacg gtatgttgca atacgaggat tctatgttgg aggagaacat tggtactatt 480

gctattccta cttacttggc taagcaaggt aaagctaagg agatgattat tgttttgcca 540

aacgtctacg ctccaccacc aggaaaggag gctccagctg agttcaacga agctcacttc 600

ttgggttaca acaacttcat caacgagatt gttaacgaca ttatgccata catgcaatct 660

cactactctg ttgctactgg aagagagaac actgctattt gtggtttctc catgggtggt 720

agaacctcta tctacattgg attccaaaga ccagatttgt tcggttacgt tggtgctttc 780

tctcctgctc ctggtttgat tcctgctgat gactctaacg gtcaccacaa cggtttgtac 840

actgttaaca acttcagatc taactctcca gccccaattg ttactttgat ttcttgtggt 900

actaacgatt ctgctgttca ccaattccca aaggaatacc acgaagtttt gactagaaac 960

aaccaaagac acatttggtt cgagattcca ggtgctgatc acgacgctag agctatctct 1020

gctggtttgt acaacttcgt ttctgctgct ttcggtgctt tgaac 1065

<210> 5

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagtgttggt ctgaagagta cggttaccca tgttgtcaag aaactaagga tgttgttaag 60

actgatgagg ctggtgcttg gggtattgag aacggtgaat ggtgtggtat ttctaagatt 120

gaatctgatg ctgaggacgt cattgaatcc ggttctgact ctgataacga tgatgaattg 180

ttggatactt cagacgttgc tgaaatcgtt gaaccaactg aatcaactgt tccagaagtt 240

ccagaagttc ctggtattcc agagaaccca ttcggtgaat ctccattccc aggtggtgct 300

ggtgaagaaa ttcaatggaa cgctaacgct aactacactc cagctgaaat tccaaacact 360

gctgtttctg agtacatgtc taagttggtc gttaaggatt actgtccagc tgatgtttct 420

tccccacaag aaggtgttga gtacccaact gctgaaaaga ttacctacta ctcaaacact 480

actgctaacg agagaaagat gaacgttatc ttgccagttg gttacactga gtctaagaag 540

tacccagttt tgtacttctt gcacggtatt atgggtgacg aagatacaat gctgttgact 600

ggtccagaca ctatcgctat tcctactaac ttgattaact ctggtttggc taaggagatg 660

atcattgttt tgccaaacca atacgcccca gctccaggta ccgagatccc acctgccttg 720

actcaagaat acttcgatgg ttatgacaac ttcattaacg aattggtcaa cgacattatg 780

ccatacattg agtctaacta ctcagttgcc actggtagag aaaacactgc tgttgctggt 840

ttttccatgg gtggtagaaa ctctctttac attggttaca agagatccga tctgttcggt 900

tacgtcggtg ctttctcccc agcccctggt gttgttccag gtgacgattt ctctggtcac 960

caccctggtt tgttcaaggt tgaatctgag ttccgtaccg attacccacc aattgttact 1020

ttgatttctg gtggtaccaa ggattctatc gttggtgttt ttccaaagtc ctaccacgac 1080

attttgacta ctaacgaaca agatcacatt tgggttgaag ttccagaagc tgatcatgac 1140

ggtactgctt tggattctgg ttactacaac ttcatccaaa ctgctttcgg tgctttggat 1200

aac 1203

<210> 6

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggagttgg ctaagaacta cttgaagaag attaagatca ttaacccatg tccaactaac 60

ttgttgttga gacacgctgg tgtttcttac ggtaacatta ttagagacaa gtactactct 120

aagactatta acgatattaa gccaattact ttgattttgc caaaggactt caaggaaaac 180

aagacttacc ctgttttgta cttgttgcac ggtttgttct ccaccgagga atctttgttg 240

gaggacggtt acaacgctga taacattttg ttcaacttga ttcacgaaaa gaaggctaag 300

gatatgattt tggcattgcc aaaccaatac accccagtca acggaaagta cttcacccca 360

gctttcgacc aaaagcacta cgatggttac gataacttca ttaacgattt ggttcatgac 420

attatgcctt tcatggaaaa gaactaccca atcgctaagg gtagagagaa cactgccatt 480

tctggtttct ctatgggtgg tagaaactct ttgtacatcg gatacactag accagacttg 540

ttcggttacg tcggagcttt ctccccagcc ccaggagtca ctccaggtag agatatctac 600

aacgagttga agggtttgtt caaggagtct gagttcagag ttaaggatga gaagttgact 660

ccaaaggttt cattgatttg tggtggaacc aacgatttca tcgttggtaa caccccagaa 720

aagtaccaca agatcttgga aaagaacaag caaccacacg tttggtaccc aattccaggt 780

gctgatcacg atactgatgc tttcacctcc ggttactaca atttcgttac ttctattttc 840

gacattttga acaagaagaa gaac 864

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaattaagat cccggatgga ttgtttctct acccaattgg gttacc 46

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgaattaat tcgcttagtg atggtgatgg tgatggttca aagcaccgaa agcagc 56

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattaagat cccggatgga gtgttggtct gaagagtacg g 41

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgaattaat tcgcttagtg atggtgatgg tgatggttat ccaaagcacc gaaagcag 58

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaattaagat cccggatgat ggagttggct aagaactact tgaag 45

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgaattaatt cgcttagtga tggtgatggt gatggttctt cttcttgttc aaaatgtcg 59

<210> 13

<211> 355

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Cys Phe Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Pro Cys Cys Glu Asn Thr Asn

1 5 10 15

Glu Val Val Ala Val Asp Glu Asn Gly Val Trp Gly Ile Glu Asn Gly

20 25 30

Val Trp Cys Gly Ile Gly His Ser Ile Lys Asn Asp Asp Tyr Glu Ser

35 40 45

Ser Leu Asn Asn Thr Asp Trp Lys Leu Leu Glu Gln Gln Gln Gln Gln

50 55 60

Gln Gln Gln Gln Asn Ile Ile Gln Lys Arg Gln Tyr Gln Gly Asp Tyr

65 70 75 80

Met Ser Lys Leu Arg Val Val Asn Thr Cys Pro Met Glu Ala Arg Phe

85 90 95

Lys Gln Asn Gly Ile Asn Tyr Pro Thr Ala Gln Lys Ile Thr Tyr Phe

100 105 110

Ser Arg Thr Thr Asn Lys Asn Arg Gln Met Asn Ile Ile Leu Pro Val

115 120 125

Gly Tyr Asn Pro Asn Lys Arg Tyr Pro Val Leu Tyr Phe Leu His Gly

130 135 140

Met Leu Gln Tyr Glu Asp Ser Met Leu Glu Glu Asn Ile Gly Thr Ile

145 150 155 160

Ala Ile Pro Thr Tyr Leu Ala Lys Gln Gly Lys Ala Lys Glu Met Ile

165 170 175

Ile Val Leu Pro Asn Val Tyr Ala Pro Pro Pro Gly Lys Glu Ala Pro

180 185 190

Ala Glu Phe Asn Glu Ala His Phe Leu Gly Tyr Asn Asn Phe Ile Asn

195 200 205

Glu Ile Val Asn Asp Ile Met Pro Tyr Met Gln Ser His Tyr Ser Val

210 215 220

Ala Thr Gly Arg Glu Asn Thr Ala Ile Cys Gly Phe Ser Met Gly Gly

225 230 235 240

Arg Thr Ser Ile Tyr Ile Gly Phe Gln Arg Pro Asp Leu Phe Gly Tyr

245 250 255

Val Gly Ala Phe Ser Pro Ala Pro Gly Leu Ile Pro Ala Asp Asp Ser

260 265 270

Asn Gly His His Asn Gly Leu Tyr Thr Val Asn Asn Phe Arg Ser Asn

275 280 285

Ser Pro Ala Pro Ile Val Thr Leu Ile Ser Cys Cys Thr Asn Asp Ser

290 295 300

Ala Val His Gln Phe Pro Lys Glu Tyr His Glu Val Leu Thr Arg Asn

305 310 315 320

Asn Gln Arg His Ile Trp Phe Glu Ile Pro Gly Ala Asp His Asp Ala

325 330 335

Arg Ala Ile Ser Ala Gly Leu Tyr Asn Phe Val Ser Ala Ala Phe Gly

340 345 350

Ala Leu Asn

355

<210> 14

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gattgtttct ctacccaatt gggttaccca tgttgtgaga acactaacga ggttgttgct 60

gttgatgaga acggtgtttg gggtattgag aacggtgttt ggtgtggtat tggtcactct 120

atcaagaacg atgattacga gtcttctttg aacaacactg attggaagtt gttggagcag 180

caacaacaac aacaacagca acaaaacatt attcaaaaga gacaatacca aggtgactac 240

atgtctaagc ttagagttgt taacacttgt ccaatggagg ctcgttttaa gcaaaacggt 300

attaactacc caactgctca aaagattact tacttctcta gaaccaccaa caagaacaga 360

caaatgaaca ttattttgcc agttggttac aaccctaaca agagataccc tgttttgtac 420

ttcttgcacg gtatgttgca atacgaggat tctatgttgg aggagaacat tggtactatt 480

gctattccta cttacttggc taagcaaggt aaagctaagg agatgattat tgttttgcca 540

aacgtctacg ctccaccacc aggaaaggag gctccagctg agttcaacga agctcacttc 600

ttgggttaca acaacttcat caacgagatt gttaacgaca ttatgccata catgcaatct 660

cactactctg ttgctactgg aagagagaac actgctattt gtggtttctc catgggtggt 720

agaacctcta tctacattgg attccaaaga ccagatttgt tcggttacgt tggtgctttc 780

tctcctgctc ctggtttgat tcctgctgat gactctaacg gtcaccacaa cggtttgtac 840

actgttaaca acttcagatc taactctcca gccccaattg ttactttgat ttcttgttgt 900

actaacgatt ctgctgttca ccaattccca aaggaatacc acgaagtttt gactagaaac 960

aaccaaagac acatttggtt cgagattcca ggtgctgatc acgacgctag agctatctct 1020

gctggtttgt acaacttcgt ttctgctgct ttcggtgctt tgaac 1065

<210> 15

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Glu Cys Trp Ser Glu Glu Tyr Gly Tyr Pro Cys Cys Gln Glu Thr Arg

1 5 10 15

Asp Val Val Lys Thr Asp Glu Ala Gly Ala Trp Gly Ile Glu Asn Gly

20 25 30

Glu Trp Cys Gly Ile Ser Lys Ile Glu Ser Asp Ala Glu Asp Val Ile

35 40 45

Glu Ser Gly Ser Asp Ser Asp Asn Asp Asp Glu Leu Leu Asp Thr Ser

50 55 60

Asp Val Ala Glu Ile Val Glu Pro Thr Glu Ser Thr Val Pro Glu Val

65 70 75 80

Pro Glu Val Pro Gly Ile Pro Glu Asn Pro Phe Gly Glu Ser Pro Phe

85 90 95

Pro Gly Gly Ala Gly Glu Glu Ile Gln Trp Asn Ala Asn Ala Asn Tyr

100 105 110

Thr Pro Ala Glu Ile Pro Asn Thr Ala Val Ser Glu Tyr Met Ser Lys

115 120 125

Leu Val Val Lys Asp Tyr Cys Pro Ala Asp Val Ser Ser Pro Gln Glu

130 135 140

Gly Val Glu Tyr Pro Thr Ala Glu Lys Ile Thr Tyr Tyr Ser Asn Thr

145 150 155 160

Thr Ala Asn Glu Arg Lys Met Asn Val Ile Leu Pro Val Gly Tyr Thr

165 170 175

Glu Ser Lys Lys Tyr Pro Val Leu Tyr Phe Leu His Gly Ile Met Gly

180 185 190

Asp Glu Asp Thr Met Leu Leu Thr Gly Pro Asp Thr Ile Ala Ile Pro

195 200 205

Thr Asn Leu Ile Asn Ser Gly Leu Ala Lys Glu Met Ile Ile Val Leu

210 215 220

Pro Asn Gln Tyr Ala Pro Ala Pro Gly Thr Glu Ile Pro Pro Ala Leu

225 230 235 240

Thr Gln Glu Tyr Phe Asp Gly Tyr Asp Asn Phe Ile Asn Glu Leu Val

245 250 255

Asn Asp Ile Met Pro Tyr Ile Glu Ser Asn Tyr Ser Val Ala Thr Gly

260 265 270

Arg Glu Asn Thr Ala Val Ala Gly Phe Ser Met Gly Gly Arg Asn Ser

275 280 285

Leu Tyr Ile Gly Tyr Lys Arg Ser Asp Leu Phe Gly Tyr Val Gly Ala

290 295 300

Phe Ser Pro Ala Pro Gly Val Val Pro Gly Asp Asp Phe Ser Gly His

305 310 315 320

His Pro Gly Leu Phe Lys Val Glu Ser Glu Phe Arg Thr Asp Tyr Pro

325 330 335

Pro Ile Val Thr Leu Ile Ser Gly Gly Thr Lys Asp Ser Ile Val Gly

340 345 350

Val Phe Pro Lys Ser Tyr His Asp Ile Leu Thr Thr Asn Glu Gln Asp

355 360 365

His Ile Trp Val Glu Val Pro Glu Ala Asp His Asp Gly Thr Ala Leu

370 375 380

Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn Phe Ile Gln Thr Ala Phe Gly Ala Leu Asp

385 390 395 400

Asn

<210> 16

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gagtgttggt ctgaagagta cggttaccca tgttgtcaag aaactagaga tgttgttaag 60

actgatgagg ctggtgcttg gggtattgag aacggtgaat ggtgtggtat ttctaagatt 120

gaatctgatg ctgaggacgt cattgaatcc ggttctgact ctgataacga tgatgaattg 180

ttggatactt cagacgttgc tgaaatcgtt gaaccaactg aatcaactgt tccagaagtt 240

ccagaagttc ctggtattcc agagaaccca ttcggtgaat ctccattccc aggtggtgct 300

ggtgaagaaa ttcaatggaa cgctaacgct aactacactc cagctgaaat tccaaacact 360

gctgtttctg agtacatgtc taagttggtc gttaaggatt actgtccagc tgatgtttct 420

tccccacaag aaggtgttga gtacccaact gctgaaaaga ttacctacta ctcaaacact 480

actgctaacg agagaaagat gaacgttatc ttgccagttg gttacactga gtctaagaag 540

tacccagttt tgtacttctt gcacggtatt atgggtgacg aagatacaat gctgttgact 600

ggtccagaca ctatcgctat tcctactaac ttgattaact ctggtttggc taaggagatg 660

atcattgttt tgccaaacca atacgcccca gctccaggta ccgagatccc acctgccttg 720

actcaagaat acttcgatgg ttatgacaac ttcattaacg aattggtcaa cgacattatg 780

ccatacattg agtctaacta ctcagttgcc actggtagag aaaacactgc tgttgctggt 840

ttttccatgg gtggtagaaa ctctctttac attggttaca agagatccga tctgttcggt 900

tacgtcggtg ctttctcccc agcccctggt gttgttccag gtgacgattt ctctggtcac 960

caccctggtt tgttcaaggt tgaatctgag ttccgtaccg attacccacc aattgttact 1020

ttgatttctg gtggtaccaa ggattctatc gttggtgttt ttccaaagtc ctaccacgac 1080

attttgacta ctaacgaaca agatcacatt tgggttgaag ttccagaagc tgatcatgac 1140

ggtactgctt tggattctgg ttactacaac ttcatccaaa ctgctttcgg tgctttggat 1200

aac 1203

<210> 17

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Glu Leu Ala Lys Asn Tyr Leu Lys Lys Ile Lys Ile Ile Asn Pro

1 5 10 15

Cys Pro Thr Asn Leu Leu Leu Arg His Ala Gly Val Ser Tyr Gly Asn

20 25 30

Ile Ile Arg Asp Lys Tyr Tyr Ser Lys Thr Ile Asn Asp Ile Lys Pro

35 40 45

Ile Thr Leu Ile Leu Pro Lys Asp Phe Lys Glu Asn Lys Thr Tyr Pro

50 55 60

Val Leu Tyr Leu Leu His Gly Leu Phe Ser Thr Glu Glu Ser Leu Leu

65 70 75 80

Glu Asp Gly Tyr Asn Ala Asp Asn Ile Leu Phe Asn Leu Ile His Glu

85 90 95

Lys Glu Ala Lys Asp Met Ile Leu Ala Leu Pro Asn Gln Tyr Thr Pro

100 105 110

Val Asn Gly Lys Tyr Phe Thr Pro Ala Phe Asp Gln Lys His Tyr Asp

115 120 125

Gly Tyr Asp Asn Phe Ile Asn Asp Leu Val His Asp Ile Met Pro Phe

130 135 140

Met Glu Lys Asn Tyr Pro Ile Ala Lys Gly Arg Glu Asn Thr Ala Ile

145 150 155 160

Ser Gly Phe Ser Met Gly Gly Arg Asn Ser Leu Tyr Ile Gly Tyr Thr

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Gly Tyr Val Gly Ala Phe Ser Pro Ala Pro Gly

180 185 190

Val Thr Pro Gly Arg Asp Ile Tyr Asn Glu Leu Lys Gly Leu Phe Lys

195 200 205

Glu Ser Glu Phe Arg Val Lys Asp Glu Lys Leu Thr Pro Lys Val Ser

210 215 220

Leu Ile Cys Gly Gly Thr Asn Asp Phe Ile Val Gly Asn Thr Pro Glu

225 230 235 240

Lys Tyr His Lys Ile Leu Glu Lys Asn Lys Gln Pro His Val Trp Tyr

245 250 255

Pro Ile Pro Gly Ala Asp His Asp Thr Asp Ala Phe Thr Ser Gly Tyr

260 265 270

Tyr Asn Phe Val Thr Ser Ile Phe Asp Ile Leu Asn Lys Lys Lys Asn

275 280 285

<210> 18

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atggagttgg ctaagaacta cttgaagaag attaagatca ttaacccatg tccaactaac 60

ttgttgttga gacacgctgg tgtttcttac ggtaacatta ttagagacaa gtactactct 120

aagactatta acgatattaa gccaattact ttgattttgc caaaggactt caaggaaaac 180

aagacttacc ctgttttgta cttgttgcac ggtttgttct ccaccgagga atctttgttg 240

gaggacggtt acaacgctga taacattttg ttcaacttga ttcacgaaaa ggaggctaag 300

gatatgattt tggcattgcc aaaccaatac accccagtca acggaaagta cttcacccca 360

gctttcgacc aaaagcacta cgatggttac gataacttca ttaacgattt ggttcatgac 420

attatgcctt tcatggaaaa gaactaccca atcgctaagg gtagagagaa cactgccatt 480

tctggtttct ctatgggtgg tagaaactct ttgtacatcg gatacactag accagacttg 540

ttcggttacg tcggagcttt ctccccagcc ccaggagtca ctccaggtag agatatctac 600

aacgagttga agggtttgtt caaggagtct gagttcagag ttaaggatga gaagttgact 660

ccaaaggttt cattgatttg tggtggaacc aacgatttca tcgttggtaa caccccagaa 720

aagtaccaca agatcttgga aaagaacaag caaccacacg tttggtaccc aattccaggt 780

gctgatcacg atactgatgc tttcacctcc ggttactaca atttcgttac ttctattttc 840

gacattttga acaagaagaa gaac 864

Claims

1.阿魏酸酯酶突变体N.7-16，其特征在于，所述阿魏酸酯酶突变体N.7-16的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，其是由氨基酸序列为SEQ ID No.2的阿魏酸酯酶的第16位氨基酸由赖氨酸变为精氨酸获得的。

2.权利要求1所述的阿魏酸酯酶突变体N.7-16的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

3.根据权利要求1所述的阿魏酸酯酶突变体N.7-16，其特征在于，所述阿魏酸酯酶突变体N.7-16的比酶活力明显高于所述阿魏酸酯酶的比酶活力。

4.权利要求1所述的阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的反应pH为6-8，反应温度为37-54℃；Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺能够明显抑制阿魏酸酯酶活性。

6.权利要求1所述的阿魏酸酯酶突变体N.7-16或者权利要求4所述的阿魏酸酯酶在用于制备降解阿魏酸甲酯的制剂中的应用。