CN108342371A - 一种新型阿魏酸酯酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种来源于土壤的新型阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将该酯酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，纯化后的重组酶(FAE‑Xuan)分子量大小为29kDa。FAE‑Xuan对底物阿魏酸甲酯的催化活性最高，酶活为40U/mg，其最适温度为30℃，最适pH为5.0。在pH 3.0‑10.0下反应4h后，该酶仍能保持75％以上的活性，显示出较强的pH稳定性。本新型阿魏酸酯酶FAE‑Xuan对金属离子和有机溶剂的耐受性较好。底物利用偏好性及系统发育分析表明FAE‑Xuan属于A型阿魏酸酯酶。本发明中FAE‑Xuan的这些良好酶学性质，使其在食品、制药和饲料等领域的工业生产中具有广泛的应用前景。

Description

一种新型阿魏酸酯酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用宏基因组文库功能筛选的方法从土壤样品中获得一种新型阿魏酸酯酶，其编码基因及其应用。

背景技术

阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，在植物细胞壁降解过程中起关键作用，能使阿魏酸和与之结合的单糖或低聚糖释放出来。释放出的阿魏酸具有许多良好的生理功能，如：抗癌、抗血栓、抗动脉粥样硬化和清除自由基等。此外，FAE在食品、制药、造纸和饲料工业也有广泛的应用前景。

FAE来源广泛，普遍存在于植物、真菌和细菌中，植物中的FAE一般含量较低，研究较少，而真菌和细菌中FAE较为丰富，研究比较深入。研究FAE的方法一般有直接发酵提取法和异源表达法，前者是以羟基肉桂酸酯类化合物(如阿魏酸酯、阿魏酸糖苷、对羟基-香豆酸酯、咖啡酸酯、介子酸酯等)为底物筛选产FAE的活性菌株，并从该菌株的发酵产物中得到FAE，然而，大多数野生菌株产FAE能力很低，如黑曲霉发酵后酶活仅在0.01-0.096U/mL之间，大大限制了该酶在工业中的应用；后者是通过基因工程方法，分子克隆FAE的基因并在合适的宿主中表达，然后分离纯化得到酶，与直接发酵提取法相比，异源表达法能显著提高酶的产量和酶的活性，目前已经有多种FAE在异源宿主(如大肠杆菌、丝状真菌、毕赤酵母等)中成功实现表达。

然而研究表明，在现有实验条件下仅有极少数的微生物可被培养，超过99％的微生物都是不可培养的，极大限制了新型阿魏酸酯酶的开发与利用。随着分子生物学和生物信息学的发展，宏基因组学技术逐渐成为研究不可培养微生物的有效手段。宏基因组学技术是不依赖培养为基础的微生物研究方法，该方法避开了传统微生物的分离培养问题，直接提取环境中的总DNA转化克隆到可培养的宿主中，形成重组DNA文库，使文库中既包含了可培养微生物的基因又包含了不可培养微生物的基因，文库基因经过筛选后，异源表达获得目标产物。

宏基因组学在新型FAE筛选和发现方面有多项成功报道，这些新酶大多来源于不可培养的未知微生物，与已知酶基因相比，序列相似性较低，活性更高。如Cheng等人采用宏基因组学方法，从荷斯坦奶牛瘤胃菌群中筛选到一种新的FAE FAE-SH1，编码酶蛋白与已知FAE相比，仅有56％的相似性，对4种羟基肉桂酸甲酯具有水解作用，说明该酶对底物具有宽广的特异性，酶经纯化后活性高达259.5U/mg，是现有最高FAE酶活性(来源于嗜酸乳杆菌L.acidophilus IFO13951)的251倍，该酶与木聚糖内切酶、葡聚糖酶、果胶酶一起使用，能够显著提高麦草中阿魏酸的释放量。这些优良的性质说明FAE-SH1在生物质降解、饲料生产和促进人体健康方面有巨大的潜力，充分说明宏基因组学是挖掘和发现新型FAE的一种有力工具。

发明内容

本发明从土壤宏基因组文库中筛选到一种新型阿魏酸酯酶基因，并对该基因进行了异源表达，重组酶具有较高的酶活、酸性、pH稳定性、对大多数金属离子和有机溶剂有耐受性等特点，可广泛应用于食品、制药与饲料等工业领域。

本发明的第一个目的在于提供一种新型阿魏酸酯酶。

本发明的第二个目的在于提供编码上述新型阿魏酸酯酶的基因。

本发明的第三个目的在于提供上述基因的宏基因组学筛选方法。

本发明的第四个目的在于提供含有上述新型阿魏酸酯酶基因的表达载体。

本发明的第五个目的在于提供一种重组阿魏酸酯酶的制备方法。

本发明的第六个目的在于提供用于新型阿魏酸酯酶的基因的特异性扩增引物。

本发明的第七个目的在于提供上述新型阿魏酸酯酶在食品、制药和饲料工业中的应用。

本发明采取的技术方案如下：

一种新型阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

编码上述新型阿魏酸酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述编码新型阿魏酸酯酶的基因的宏基因组学筛选方法，包括以下步骤：提取土壤总DNA,构建cosmid宏基因组文库，利用功能筛选法及亚克隆策略获得编码阿魏酸酯酶的基因。

进一步的，其具体步骤为，提取土壤总DNA,并纯化,构建cosmid宏基因组文库；利用底物筛选平板筛选阳性克隆子，HPLC验证其阿魏酸酯酶活性；提取阳性克隆子质粒DNA，利用BamHI进行部分酶切，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coli DH5α；使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆，经测序和BlastP比较，从而筛选获得编码阿魏酸酯酶的基因。

更进一步的，所述编码阿魏酸酯酶的基因的宏基因组学筛选方法：

提取土壤样品DNA,采用cosmid(Epicentre)试剂盒构建宏基因组文库。按照试剂盒说明书，土壤DNA经末端修复酶修复、与pWEB载体连接、经λ-噬菌体包装后，每个克隆子可插入35-40kb的基因片段，于大肠杆菌E.coli EPI 100中表达，将文库以大约5000个克隆子为单位分装成亚文库，加入15％甘油贮藏，以备筛选。

在培养基中加入过膜后的阿魏酸甲酯作为筛选底物。将复制的文库进行适当稀释涂布，经培养后，观察筛选平板上是否出现相应的透明圈，并挑取能够产生透明圈的克隆子，将其接种于含有阿魏酸甲酯的LB液体培养基中过夜摇菌，取部分发酵液上清进行HPLC分析。若发酵液中存在阿魏酸，则证明该克隆子具有阿魏酸酯酶活性。

提取阳性克隆子质粒DNA，利用BamHI进行部分酶切，电泳后回收1-5kb大小的DNA片段，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coli DH5α。使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆。测定阳性亚克隆序列，获得阿魏酸酯酶编码基因fae-xuan。

一种含有编码上述新型阿魏酸酯酶的基因的表达载体。

进一步的，所述表达载体源于pET-28a。

一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，包括以下步骤：制备上述表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述重组阿魏酸酯酶。

进一步的，具体步骤为，将编码新型阿魏酸酯酶的基因的PCR扩增产物经NcoI和HindIII双酶切，与pET-28a载体连接，得到pET-28a表达载体；用pET-28a表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物中分离纯化，获得重组阿魏酸酯酶。

更进一步的，所述重组阿魏酸酯酶的制备方法：

利用引物fae-f(5’-CATGCCATGGGCATGCGTGCAGGGGGGAG-3’)和fae-r(5’-CCCAAGCTTCCGGCCGCTCAGCCAGT-3’)扩增fae-xuan，上下游引物下划线处分别表示NcoI和HindIII的酶切位点。扩增片段经NcoI和HindIII双酶切后，连接至相同酶切的pET-28a表达载体中，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。

用于编码上述新型阿魏酸酯酶的基因的特异性扩增的引物，包括以下两条序列：

上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGCGTGCAGGGGGGAG-3’(SEQ ID No.3)；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCCGGCCGCTCAGCCAGT-3’(SEQ ID No.4)。

上述新型阿魏酸酯酶在食品、制药和饲料工业中的应用。

在食品、制药工业的应用中，由于阿魏酸广泛存在于植物的细胞壁中，可在阿魏酸酯酶的作用下从植物细胞壁中显著释放，释放出的阿魏酸可以作为抗氧化剂用于油脂的抗氧化，此外阿魏酸还具有抗肿瘤、消炎、促进伤口愈合等功能，因此，本发明提供的阿魏酸酯酶为食品工业和制药工业提供了新的选择。

在饲料工业中的应用中，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，将阿魏酸从植物细胞壁中游离出来，从而破坏了细胞壁的骨架结构，使得植物性的原材料更加疏松，更容易被牲畜消化吸收，提高饲料利用率。

所述重组阿魏酸酯酶的酶学性质表征：

将异源表达所获得的重组酶纯化后，进行酶催化动力学分析，包括K_m,V_max,k_cat,k_cat/K_m值的测定，及常规酶学性质的表征，包括底物特异性、最适温度及热稳定性、最适pH及pH稳定性、不同金属离子和有机溶剂的影响等。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种来源于土壤的新型阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将该酯酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，纯化后的重组酶(FAE-Xuan)分子量大小为29kDa。FAE-Xuan对底物阿魏酸甲酯的催化活性最高，酶活为40U/mg，其最适温度为30℃，最适pH为5.0。在pH 3.0-10.0下反应4h后，该酶仍能保持75％以上的活性，显示出较强的pH稳定性。本新型阿魏酸酯酶FAE-Xuan对金属离子和有机溶剂的耐受性较好。底物利用偏好性及系统发育分析表明FAE-Xuan属于A型阿魏酸酯酶。本发明中FAE-Xuan的这些良好酶学性质，使其在食品、制药和饲料等领域的工业生产中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1.实施例1中阿魏酸酯酶活性克隆子初筛。

图2.实施例1中克隆子发酵液高效液相色谱图。

a：实验组；b：不含目的基因的对照组。

图3.实施例3中SDS-PAGE检测纯化后的阿魏酸酯酶FAE-Xuan图谱。

1：空载对照；2：粗酶液；3：纯化后的酶FAE-Xuan；M：蛋白Marker。

图4.实施例4中阿魏酸酯酶FAE-Xuan最适温度及热稳定性和最适pH及pH稳定性折线图。

A：温度对FAE-Xuan活性的影响；B：FAE-Xuan的热稳定性；C：pH对FAE-Xuan活性的影响；D：FAE-Xuan的pH稳定性。

图5.实施例4中金属离子和有机溶剂对阿魏酸酯酶FAE-Xuan活性影响柱状图。

图6.实施例4中阿魏酸酯酶FAE-Xuan的系统发育树。

图7.实施例4中阿魏酸酯酶FAE-Xuan的多序列比对。

图8.实施例4中阿魏酸酯酶FAE-Xuan三级结构图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不是对本发明的限制。

实施例1：土壤宏基因组文库中阿魏酸酯酶基因的筛选

1.平板法初筛

制备FAE筛选培养基，在LB液体培养基中加入1.5％(v/v)的阿魏酸甲酯(溶于二甲基甲酰胺，10％w/v)，高温高压灭菌后，在适宜温度(50-60℃)加入终浓度为100mg/L的氨苄青霉素，用力摇匀使得阿魏酸甲酯分布均匀，立即在超净台倒平板。每块筛选平板上涂布cosmid文库菌液，37℃培养1-2天，观察菌落周围透明圈的形成(图1)。

2.复筛

初筛后克隆子接种于LB液体培养基中，37℃条件下过夜培养后，12000g离心8min收集菌体。用无菌水洗涤菌体3次后，重悬于去离子水中。取菌悬液接种到含1％阿魏酸甲酯的培养基中，菌种接种量为2％(v/v)，进行发酵，发酵条件为30℃，48h，震荡频率为150r/min。发酵液于12000g离心10min，取上清用于高效液相色谱检测。色谱条件：采用ZorbaxSB-C₁₈色谱柱，流动相为甲醇-1％冰醋酸，柱温40℃，检测波长320nm，进样量10μL，流速为1mL/min。发酵液检测到阿魏酸表明成功筛选到具有阿魏酸酯酶活性的克隆子(图2)。

3.亚克隆

复筛得到的阳性克隆子经过夜培养后提取质粒，利用BamHI进行部分酶切，电泳后切胶回收1-5kb大小的DNA片段，连接至载体pUC118并转化至E.coli DH5α。使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆。

4.阳性亚克隆序列测定及分析

使用载体pUC118自带的M13引物序列进行测序，开放阅读框预测使用在线分析工具ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，BlastP程序检索预测蛋白的同源序列(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。将获得的阿魏酸酯酶基因命名为fae-xuan。

实施例2：阿魏酸酯酶基因的克隆

1.PCR扩增

利用引物fae-f(5’-CATGCCATGGGCATGCGTGCAGGGGGGAG-3’)和fae-r(5’-CCCAAGCTTCCGGCCGCTCAGCCAGT-3’)扩增阿魏酸酯酶基因fae-xuan，上下游引物下划线处分别表示NcoI和HindIII的酶切位点。PCR反应体系(25μL)：超纯水9.5μL，Mix12.5μL,上下游引物各1μL，阳性亚克隆质粒DNA1μL。PCR反应条件：94℃4min；94℃30s，60℃45s，72℃1min，35个循环；72℃10min。将PCR产物电泳，割胶回收，得到纯化的PCR产物。2.酶切

将纯化回收的PCR产物进行双酶切，酶切时间3h。酶切体系为：NcoI5μL，HindIII5μL，10×K Buffer 10μL，0.1％BSA 10μL，PCR产物5μg，无菌水加至100μL。割胶回收得到纯化的经双酶切的PCR产物。

对pET28a质粒DNA进行双酶切，酶切时间3h。酶切体系为：NcoI5μL，HindIII5μL，10×K Buffer 10μL，0.1％BSA 10μL，pET28a质粒DNA5μg，无菌水加至100μL。割胶回收得到纯化的经过双酶切的pET28a载体。

3.连接

将经过双酶切的PCR产物和pET28a载体按照3:1的摩尔比例进行连接。连接温度为16℃，连接时间为12h。

4.转化及筛选

取10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入900μL LB液体培养基，150rpm，37℃震荡培养45min。培养物2500g离心5min，去掉600μL上清，用剩余培养基将菌体重悬并涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养后挑取单菌落。单菌落于5mL LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。将获得的阳性克隆进行测序，测序结果与fae-xuan的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)比对，结果完全正确，确认得到带有fae-xuan基因的pET28a质粒，命名为pET28a-fae-xuan。

实施例3：阿魏酸酯酶FAE-Xuan的异源表达与纯化

1.转化

取实施例2得到的pET28a-fae-xuan质粒10μL加入到100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰上孵育30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入900μL LB液体培养基，150rpm，37℃震荡培养45min。培养物2500g离心5min，去掉600μL上清，用剩余培养基将菌体重悬并涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37℃过夜培养后挑取单菌落。由此得到含有pET28a-fae-xuan的大肠杆菌BL21(DE3)。

2.表达

将重组菌接种至含有卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm培养12h。取1.5mL菌液接种至150mL新鲜LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD_600nm为0.6左右，添加IPTG至其终浓度为0.3mM，于30℃、180rpm继续培养12h。

3.纯化

将诱导表达12h左右的菌液于4℃、15000rpm条件下离心15min收集菌体，PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶(200mg/mL)静置20min后超声破碎(冰水浴，超声1s间隔2s，30min)，于4℃、15000rpm条件下离心30min，取上清即得到粗酶液。将得到的粗酶液，过Ni次氮基三乙酸琼脂糖超流动柱进行纯化，经10倍体积的清洗液(pH 8.0的PBS，20mM咪唑)清洗后，利用洗脱液(pH 8.0的PBS，500mM咪唑)将蛋白从柱子上洗脱下来。纯化后的蛋白利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测(图3)。

实施例4：阿魏酸酯酶FAE-Xuan的酶学性质表征

1.酶活测定

取900μL pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配置的0.5mM阿魏酸甲酯溶液，加入100

μL酶液(稀释30倍)，30℃下反应10min，320nm下测定吸光度。酶活单位定义：反应条件下，每分钟降解阿魏酸甲酯生成1μmol阿魏酸所需酶量。

2.最适温度及热稳定性

在pH 5.0条件下，测定温度梯度4℃、10℃、20℃、30℃、37℃、45℃、50℃时酶水解阿魏酸甲酯的活力，再缩小温度区间，逐步确定酶水解的最适温度。同时在相同反应体系下，将酶液放置于30℃、40℃、50℃水浴中保温4h，期间每隔1h测定残余酶活，结果如图4所示。在4-30℃范围内，酶活力随温度的升高而升高，并在30℃酶活达到最高，过了30℃以后，酶活力随着温度的升高急剧下降，到50℃几乎完全失活。该酶在大于40℃保温4h后，酶活也急剧降低。

3.最适pH及pH稳定性

在30℃条件下，使用pH 3.0-10.0的缓冲液测定在不同pH条件下的酶活力，根据酶活大小确定最适pH。将酶溶液分别加到pH 3.0-10.0、梯度为一个pH单位的缓冲液中，4℃放置4h。在相同酶反应体系下测定残余酶活，结果如图4所示。该酶在pH 4.0-6.0范围内具有65％以上的最大酶活，在pH 5.0时酶活性最大，表明该酶适用于酸性条件。在pH 3.0-10.0条件下放置4h后，该酶仍能保持75％以上的残余酶活，表明FAE-Xuan具有宽的pH稳定性。

4.底物特异性及酶催化动力学分析

根据上述酶活测定方法，比较FAE-Xuan对不同底物的水解能力，包括阿魏酸甲酯(MFA)、芥子酸甲酯(MSA)、对香豆素甲酯(MpCA)、咖啡酸甲酯(MCA)，同时计算其相关动力学参数，结果见下表。FAE-Xuan对MFA的催化活性最高，MSA次之，对MpCA的催化活性较弱，对MCA则完全没有活性。

表1 FAE-Xuan的底物特异性及动力学参数

5.金属离子和有机溶剂对FAE-Xuan活性的影响

反应体系内分别加入Cu²⁺、Ba²⁺、K⁺、Na⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、EDTA、SDS、DMSO、丙酮(Acetone)、异丙醇(isopropanol)、DMF，在最适条件下测定FAE-Xuan酶活。以不参加任何化合物的反应体系作为空白独照(control)，其酶活定义为100％，结果如图5所示。K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酶活影响较小，而Cu²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺对酶活有抑制作用。除了异丙醇和DMF外，该酶对其余所测有机溶剂均表现出良好的耐受性。

6.FAE-Xuan系统发育树分析

将FAE-Xuan及其他已知类型的FAE氨基酸序列利用MEGA 6.0软件构建系统发育树(图6)。结果表明FAE-Xuan与A型FAE位于一个独立的进化分支上，结合该酶的底物偏好性，将FAE-Xuan归于A型FAE家族。

7.FAE-Xuan多序列比对

利用在线工具Clustal Omega对FAE-Xuan及其同源序列进行多序列比对(图7)。结果表明FAE-Xuan具有一个保守的五肽基序G-X-S-X-G，和其他阿魏酸酯酶相似，亲核氨基酸S⁸⁴位于五肽基序中，并与D²⁰³和H²²⁴共同构成了阿魏酸酯酶的催化三联体。

8.FAE-Xuan三级结构预测

利用在线工具SWISS-MODEL以TtEst为模板同源建模，对FAE-Xuan三级结构进行预测(图8)。结果表明，FAE-Xuan具有一个典型的α/β水解酶折叠，由帽子结构域和催化结构域组成。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种新型阿魏酸酯酶及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase)

<400> 1

atgcgtgcag gggggagcat ccagggcgtt gcaagccggt gtgcgagcgg ccaaagccgc 60

gccgtgcgcg cgcccgtgat cctgctgccc ggcctgctct gtgatgccgc cttgtggcgg 120

ccgcaggtcg aagcgctggc cggcgagatg gcggcgggaa tcgccgacct gaccctcgac 180

gagacggtcg cggacatggc cgaacgcgtg ctcgcagtgg cgccgccgcg cttcgcgctc 240

gcgggcctgt cgatgggcgg ctatgtcgcc ttcgagatca tgcgccgcgc gccggaacgg 300

gtcgaccggc tcgccctgtt cgcgaccagc gcggcgccgg acacgccgga acagtccgcg 360

gcgcgcaagc gctacatgga gtcgctaaag ctcggccgat tcctcggagt cggccgcaag 420

ctgttgccgc ggctcgtcga caggtcgcac ctgcacgggc cggtcggcga cacggtgcgg 480

gcgatggccg aacgggtcgg gggcgaggcg ttcctgcgcc aacagaaggc catcctgaca 540

cggccggaca gccggccgac cctggagacg atcaaagtgc cgacgatcgt tgcggtcggc 600

gacggcgacg tgctgacgcc gcccgcgcaa tcgcgcgcga tccgcgacgg aataaagggc 660

tcgaccctgc acgtgctgcc ggggtgcggg catctgccgg cgctcgagcg gccggagcgc 720

gtgatcgcct tgatgcgaga ctggctgagc ggccggtag 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 阿魏酸酯酶(Feruloyl esterase)

<400> 2

Met Arg Ala Gly Gly Ser Ile Gln Gly Val Ala Ser Arg Cys Ala Ser

1 5 10 15

Gly Gln Ser Arg Ala Val Arg Ala Pro Val Ile Leu Leu Pro Gly Leu

20 25 30

Leu Cys Asp Ala Ala Leu Trp Arg Pro Gln Val Glu Ala Leu Ala Gly

35 40 45

Glu Met Ala Ala Gly Ile Ala Asp Leu Thr Leu Asp Glu Thr Val Ala

50 55 60

Asp Met Ala Glu Arg Val Leu Ala Val Ala Pro Pro Arg Phe Ala Leu

65 70 75 80

Ala Gly Leu Ser Met Gly Gly Tyr Val Ala Phe Glu Ile Met Arg Arg

85 90 95

Ala Pro Glu Arg Val Asp Arg Leu Ala Leu Phe Ala Thr Ser Ala Ala

100 105 110

Pro Asp Thr Pro Glu Gln Ser Ala Ala Arg Lys Arg Tyr Met Glu Ser

115 120 125

Leu Lys Leu Gly Arg Phe Leu Gly Val Gly Arg Lys Leu Leu Pro Arg

130 135 140

Leu Val Asp Arg Ser His Leu His Gly Pro Val Gly Asp Thr Val Arg

145 150 155 160

Ala Met Ala Glu Arg Val Gly Gly Glu Ala Phe Leu Arg Gln Gln Lys

165 170 175

Ala Ile Leu Thr Arg Pro Asp Ser Arg Pro Thr Leu Glu Thr Ile Lys

180 185 190

Val Pro Thr Ile Val Ala Val Gly Asp Gly Asp Val Leu Thr Pro Pro

195 200 205

Ala Gln Ser Arg Ala Ile Arg Asp Gly Ile Lys Gly Ser Thr Leu His

210 215 220

Val Leu Pro Gly Cys Gly His Leu Pro Ala Leu Glu Arg Pro Glu Arg

225 230 235 240

Val Ile Ala Leu Met Arg Asp Trp Leu Ser Gly Arg

245 250

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg gcatgcgtgc aggggggag 29

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttc cggccgctca gccagt 26

Claims (10)

1.一种新型阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.编码权利要求1所述新型阿魏酸酯酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求2所述编码新型阿魏酸酯酶的基因的宏基因组学筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：提取土壤总DNA,构建cosmid宏基因组文库，利用功能筛选法及亚克隆策略获得编码阿魏酸酯酶的基因。

4.根据权利要求3所述的宏基因组学筛选方法，其特征在于，其具体步骤为，提取土壤总DNA,并纯化,构建cosmid宏基因组文库；利用底物筛选平板筛选阳性克隆子，HPLC验证其阿魏酸酯酶活性；提取阳性克隆子质粒DNA，利用BamHI进行部分酶切，连接至载体pUC118并转化至大肠杆菌E.coli DH5α；使用相同的底物筛选平板筛选阳性亚克隆，经测序和BlastP比较，从而筛选获得编码阿魏酸酯酶的基因。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的基因。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体源于pET-28a。

7.一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备权利要求5或6所述的表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述重组阿魏酸酯酶。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将权利要求2所述基因的PCR扩增产物经NcoI和HindIII双酶切，与pET-28a载体连接，得到pET-28a表达载体；用pET-28a表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物中分离纯化，获得重组阿魏酸酯酶。

9.用于权利要求2所述编码新型阿魏酸酯酶的基因的特异性扩增的引物，其特征在于，包括以下两条序列：

上游引物：5’-CATGCCATGGGCATGCGTGCAGGGGGGAG-3’(SEQ ID No.3)；

下游引物：5’-CCCAAGCTTCCGGCCGCTCAGCCAGT-3’(SEQ ID No.4)。

10.权利要求1所述新型阿魏酸酯酶在食品工业、制药工业和饲料工业中的应用。