CN111471664B - 阿魏酸酯酶BpFae、其编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开阿魏酸酯酶BpFae、其编码基因及其应用。所述阿魏酸酯酶BpFae的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。BpFae最适pH为4.5‑5.0，BpFae最适温度为50℃，BpFae对金属离子有良好的耐受性，多种表面活性剂对酶起到激活作用，其是一种具有应用潜力的阿魏酸酯酶。

Description

阿魏酸酯酶BpFae、其编码基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及阿魏酸酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

植物细胞壁中的碳水化合物组分是现存最大的可再生资源库，而每年在全球范围内会产生数百万吨的农业废弃物，这不仅造成了大量的资源浪费，同时给环境保护带来很大压力[Nieter,A.,et al.,Feruloyl esterases from Schizophyllum commune totreat food industry side-streams.Bioresource Technology,2016.220:p.38-46；Nieter,A.,et al.,A p-coumaroyl esterase from Rhizoctonia solani with apronounced chlorogenic acid esterase activity.N Biotechnol,2017.37(Pt B):p.

153-161.]。随着社会的高速发展，人类对能源利用的需求持续增加，同时不可再生资源日益减少。因此，人们可持续发展的意识不断增强，越来越多的研究关注可再生资源如生物质的开发与利用。生物质利用的关键是将木质纤维素转化为可发酵的低分子量碳源。而植物细胞壁的成分多样且结构复杂，诸多因素如纤维素的结晶度和聚合度等，使得生物质资源的利用变得困难。降解木质纤维素需要多种纤维素酶、半纤维素酶及相关辅助酶的协同作用[Oliveira,D.M.,et al.,Feruloyl esterases:Biocatalysts to overcomebiomass recalcitrance and for the production of bioactive compounds.BioresourTechnol,2019.278:p.408-423；Xu,Z.,T.Wang,and S.Zhang,Extracellular secretionof feruloyl esterase derived from Lactobacillus crispatus in Escherichia coliand its application for ferulic acid production.Bioresource Technology,2019.288.]，先前的工作主要集中在纤维素酶和半纤维素酶上，而对辅助酶的研究相对较少。在众多的辅酶中，能够水解多糖和羟基肉桂酸酯之间酯键的阿魏酸酯酶(FAEs)越来越受到关注。

阿魏酸酯酶(FAEs，EC 3.1.1.73)是羧酸酯酶的一个亚类，通过水解羟基肉桂酸和植物多糖之间的酯键[Schulz,K.,et al.,A type D ferulic acid esterase fromStreptomyces werraensis affects the volume of wheat dough pastries.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2018.102(3):p.1269-1279；Topakas,E.,C.Vafiadi,and P.Christakopoulos,Microbial production,characterization and applicationsof feruloyl esterases.Process Biochemistry,2007.42(4):p.497-509]，从木质纤维素中释放羟基酚酸，如阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸和芥子酸，另外还可以通过酯化及转酯作用合成羟基肉桂酸酯衍生物。因此，阿魏酸酯酶在各种工业领域中具有广泛的应用潜力[Dilokpimol,A.,et al.,Diversity of fungal feruloyl esterases:updatedphylogenetic classification,properties,and industrial applications.BiotechnolBiofuels,2016.9:p.231.]。例如，在纸浆漂白过程中添加阿魏酸酯酶可以有效降低能耗[Record,E.,et al.,Overproduction of the Aspergillus niger feruloyl esterasefor pulp bleaching application.Appl Microbiol Biotechnol,2003.62(4):p.349-55.]；在饲料中添加阿魏酸酯酶，可以改善主链降解酶的可及性，从而促进纤维素的消化并且提高植物营养素的生物利用度[Dilokpimol,A.,et al.,Biotechnol Biofuels,2016.9:p.231]；在生物乙醇制备过程中，阿魏酸酯酶是木质纤维素完全水解所必需的辅助酶。另外，阿魏酸酯酶在食品工业中也有广泛用途，例如去除异味，增强调味品和酒精饮料的香气[Dilokpimol，A.，et al.，Biotechnol Biofuels，2016.9:p.231]，以及在烘焙过程中改善面团的流变性等[Schulz,K.,et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2018.102(3):p.1269-1279]。

阿魏酸酯酶的另一重要应用是在降解生物质的同时释放阿魏酸。阿魏酸因具有特殊的结构特性，被广泛应用在多个领域。在化妆品工业中，阿魏酸被当作抗氧化剂、紫外线吸收剂和脱色剂[Zdunska,K.,et al.,Antioxidant Properties of Ferulic Acid andIts Possible Application.Skin Pharmacol Physiol,2018.31(6):p.332-336.]；此外，阿魏酸还具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗血栓形成、抗癌和降胆固醇等医疗功能，因此也被广泛应用在医疗领域[Ou,S.and K.Kwok,Ferulic acid:pharmaceutical functions,preparation and applications in foods.J Sci Food Agric,2004.84(11):p.1261-1269.]。而在食品工业中，阿魏酸的天然抗菌和抗氧化活性，使得它成为一种优良的保鲜剂。

自然界中的阿魏酸酯酶广泛存在于植物及微生物中，主要来源为微生物。无论在工业和农业当中，阿魏酸酯酶都具有很大的应用潜力。迄今为止，研究人员已经从微生物中分离和鉴定了80多种阿魏酸酯酶，其中主要来源于真菌，细菌来源的阿魏酸酯酶数量有限。另外，由野生型菌株分泌的阿魏酸酯酶活性相对较低且产酶过程耗时较长[Yang,S.,etal.,Biochemical characteristics and gene cloning of a novel thermostableferuloyl esterase from Chaetomium sp.J Mol Catal B Enzym,2013.97:p.328-336；Donaghy,J.,P.F.Kelly,and A.M.McKay,Detection of ferulic acid esteraseproduction by Bacillus spp.and lactobacilli.Appl Microbiol Biotechnol1998.50:p.257-260；Rumbold,K.,et al.,Purification and properties of a feruloylesterase involved in lignocellulose degradation by Aureobasidiumpullulans.Appl Environ Microbiol,2003.69(9):p.5622-6.]。此外，与丰富的基因资源相比，目前进行分离和特性表征的阿魏酸酯酶仍然非常有限。

发明内容

针对上述需求，本发明以吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)B1213为研究对象，对该菌株来源的阿魏酸酯酶进行生物信息学分析，最终克隆表达一种新的阿魏酸酯酶BpFae，并进行诱导表达和酶活性测定而完成本发明。

由此本发明提供一种阿魏酸酯酶BpFae，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

相应地，本发明还提供所述的阿魏酸酯酶BpFae的编码基因。优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，本发明提供含有所述基因的表达载体，优选为诱导表达载体，例如以pMD-18T、pET-28a等为出发载体。更进一步地，提供含有所述表达载体的重组细胞。

另一方面本发明还提供含有阿魏酸酯酶BpFae的融合蛋白，优选地其与标签蛋白融合，更优选地与GST融合为GST-BpFae融合蛋白，或者与组氨酸标签融合成为组氨酸标签-BpFae融合蛋白。相应地，本发明还提供所述的融合蛋白的编码序列。

再一方面，本发明提供所述的阿魏酸酯酶BpFae的应用，包括其在木质纤维素降解中作为辅助酶的应用，其可以从木质纤维素中释放羟基酚酸，如阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸和芥子酸。所述应用还包括进一步分离出产生的的阿魏酸，而制备的阿魏酸可用于化妆品工业中，用作抗氧化剂、紫外线吸收剂和脱色剂；应用于医疗领域，起到抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗血栓形成、抗癌和降胆固醇等医疗功能；应用于食品工业中，作为优良的保鲜剂等。

本发明首次克隆到本发明的基因，并通过研究找到正确的表达具有酶活性的诱导表达途径。并且对该酶的酶学性质研究结果表明，其最适pH为4.5-5.0，在中性偏酸性的条件下保持稳定；最适温度为50℃；阿魏酸酯酶BpFae对金属离子有良好的耐受性，多种表面活性剂对酶起到激活作用。因此，阿魏酸酯酶BpFae是一种新的非常有研究价值和应用潜力的阿魏酸酯酶。

附图说明

图1以麦麸为碳源时Burkholderia pyrrocinia B1213产FAE的历程。

图2 BpFae与三种序列一致性最高且结构已知的酯酶之间多序列比对。

图3 BpFae与其他细菌来源的阿魏酸酯酶之间的系统发育关系。

图4 BpFae与其他真菌来源的阿魏酸酯酶之间的系统发育关系.

图5 DS同源建模法构建BpFae三维结构。

图6凝胶电泳验证目的基因BpFae。

图7SDS-PAGE分析pET28a载体表达各组分。其中，M：分子量Marker。1、3、5和7泳道：空白载体对照，BL21(DE3)-pET-28a；泳道2、4、6和8：BL21(DE3)-pET-28a-BpFae。泳道1和2：培养基的上清液；泳道3和4：总蛋白；泳道5和6：粗酶液；泳道7和8：沉淀。预测His-BpFae的分子量为59kDa，与在凝胶中观察到的结果一致。

图8SDS-PAGE分析pCold-TF载体表达各组分。其中，M：分子量Marker。1、3、5和7泳道：空白载体对照，BL21(DE3)-pCold-TF；泳道2、4、6和8：BL21(DE3)-pCold-TF-BpFae。泳道1和2：培养基的上清液；泳道3和4：总蛋白；泳道5和6：粗酶液；泳道7和8：沉淀。预测融合蛋白TF-BpFae的分子量为111kDa，与在凝胶中观察到的结果一致。

图9融合蛋白GST-BpFae表达。其中，a:SDS-PAGE分析pGEX-4T-1载体表达各组分。M：分子量Marker。1、3、5和7泳道：空白载体对照，BL21(DE3)-pCold-TF；泳道2、4、6和8：BL21(DE3)-pCold-TF-BpFae。泳道1和2：培养基的上清液；泳道3和4：总蛋白；泳道5和6：粗酶液；泳道7和8：沉淀。b，各组分酶活分析。

图10不同粗酶液的阿魏酸酯酶酶谱分析。以阿魏酸甲酯为底物，样品为各表达载体经诱导表达获取的粗酶液。其中，1：pGEX-4T-1-BpFae；2：pCold-TF-BpFae；3：pET-28a-BpFae。

图11 BpFae的最适反应pH及pH稳定性。

图12 BpFae的最适反应温度及温度稳定性。

具体实施方式

下面通过具体的实施方式或实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明。

下述实施例中对相关的操作或方法若无特别说明，都是本领域常规操作或方法。对试剂和仪器若无特别说明，则是常规可获得或商业途径可以购买得到的。

试验材料

菌株：菌株B.pyrrocinia B1213从土壤中分离得到，经鉴定并于2016年7月21日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC，No.12806(见中国专利申请CN201610880271.X)。大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)(Takara，日本)分别用于质粒制备和蛋白质表达。质粒pET28a，pCold-TF，pGEX-4T-1用于构建表达载体。

试剂：EZgene质粒提取试剂盒和E.Z.N.A.凝胶提取试剂盒分别购自美国Biomiga公司和美国Omega Bio-tek公司。用于基因操作的限制酶和其他试剂均购自日本Takara公司。

阿魏酸甲酯和阿魏酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。所有其它化学品均为分析纯。

培养基：以下培养基的配制方法主要参考文献[Golotin,V.A.,et al.,Optimization of cold-adapted alpha-galactosidase expression in Escherichiacoli.Protein Expr Purif,2016.123:p.14-8]。

LB培养基(1L)：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl；

SOB培养基(1L)：5酵母提取物，20胰蛋白胨，0.5NaCl，10ml 0.25mol/L KCl溶液，5ml 2mol/L MgCl2˙6H2O；

发酵培养基(1L)：1.3g(NH4)2SO4，0.37g KH2PO4，0.25g MgSO4·7H2O，0.07gCaCl2·2H2O，0.02g FeCl3，1.0g yeast extract，10％去淀粉麦麸，pH 6.0，115℃灭菌20min。

下述实验中，数据测定中每种处理重复三次，结果表示为平均值±标准偏差。所有统计分析均使用OriginPro 8.6和Excel 2016完成。

实施例一：B.pyrrocinia B1213液态发酵产阿魏酸酯酶

以去淀粉麦麸为底物，采用液态发酵法生产阿魏酸酯酶。配置好的发酵培养基分装于250mL三角瓶中，每瓶50mL，将培养24h的种子液按照4％(v/v)的接种量接种于50mL的发酵培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养5天，每隔24小时取样一次，4℃、10000rpm离心10min，收集上清液并检测其pH、蛋白质浓度和FAE酶活力。

由图1可以看出，FAE的活性在B.pyrrocinia B1213生长的早期阶段不断增加，在培养4天后达到最高水平(26.24U/L)，直到第5天保持不变。发酵液中蛋白质浓度的变化与FAE活性的变化一致。

实施例二：BpFae生物信息学分析

通过(http://www.expasy.ch)在线预测阿魏酸酯酶BpFae的理论分子量和等电点；通过Signal P分析预测蛋白BpFae是否存在信号肽；通过MEGA X和ESPript3(http:// espript.ibcp.fr)进行多序列比对；系统发生树同样由MEGA X并采用Neighbor-Joining方法构建；采用Discovery Studio软件，根据同源建模法构建蛋白BpFae的三维结构。采用PyMOL(http://pymol.org)对BpFae的三维模型进行渲染与展示。

通过分析发现其中存在一个1719bp的开放阅读框(ORF)，编码一个假想的573个氨基酸的阿魏酸酯酶，命名为BpFae。在线预测其分子量为59.04kDa，pI为5.09。SignalP 4.1分析表明BpFae存在19个氨基酸的信号肽。BpFae的分子量大于大多数细菌来源的阿魏酸酯酶(27-45kDa)。此外，BpFae和三种结构已知的酯酶之间进行多序列比对(图2)，表明BpFae存在酯酶当中高度保守的“Gly-x-Ser-x-Gly”模体。另外，BpFae具有典型的Ser-Asp-His催化三联体结构(Ser 209，His 492，Asp 455)。

实施例三：BpFae克隆表达

1、BpFae基因克隆

前期对菌株B.pyrrocinia B1213进行了全基因组测序及功能基因注释。采用细菌基因组抽提试剂盒提取该菌株总DNA。根据编码BpFae蛋白的基因序列设计引物F/R(表1)，用于目的基因克隆。以基因组DNA为模板，扩增目的基因BpFae。PCR反应体系(50μL)包含5μLLA-Taq缓冲液，5μL dNTP(2.5mM)，1μL基因组DNA，1μL F引物(10mM)，1μL R引物(10mM)，0.5μL LA-Taq聚合酶(2.5UμL^–1)，加水至50μL。扩增条件：95℃预变性5min，30个循环：94℃变性30s，65℃退火1.5min，72℃延伸1min；72℃再延伸10min。用质量分数1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，然后将PCR产物连接到pMD-18T载体，并送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。结果表明，通过PCR扩增得到B.pyrrocinia B1213的BpFae基因，并将其成功克隆到载体pMD18-T中，通过凝胶电泳验证目的基因BpFae(图6)。

表1 PCR扩增引物

注：酶切位点BamH I由实线划出，Sal I由虚线划出。

克隆的基因的序列比对由MEGA X软件完成并通过ESPript 3程序可视化。进行序列比对的三种酯酶分别为来自Ideonella sakaiensis的MHETase-6QG9；来自Aspergillusoryzae的AoFae-6G21和FaeB-3WMT。保守的G-X-S-X-G模体和催化三联体(S209，D492和H455)分别由方框和星星标出。

使用MEGA X，并采用neighbor-joining算法构建系统发育树a(图3)显示了BpFae与细菌来源的阿魏酸酯酶之间的进化关系。结果显示，细菌来源的阿魏酸酯酶可以分为多个类群。另外，BpFae与其他阿魏酸酯酶序列的两两比对结果显示，序列之间的一致性均小于20％；BpFae与来自于Sorangium cellulosum的ScFAE1和ScFAE2亲源关系较近，但与这两种阿魏酸酯酶之间的序列一致性也分别只有14％和12％，这表明BpFae是一种新的细菌来源的阿魏酸酯酶。

另外，选取部分典型的真菌来源阿魏酸酯酶，并包含了部分细菌来源的阿魏酸酯酶，仍由MEGA X，采用neighbor-joining算法构建系统发育树(图4)。结果显示，大多数真菌阿魏酸酯酶被分为A、B、C和D类，这与之前文献报道的分类特征相一致。相比之下，大多数细菌来源的阿魏酸酯酶被归类为一种特殊类型，不包括任何来自真菌的阿魏酸酯酶，这表明细菌与真菌来源的阿魏酸酯酶在一级结构上存在显著差异。有趣的是，BpFae既没有被归类为典型的真菌阿魏酸酯酶，也没有被归类为细菌阿魏酸酯酶，而是和MHTEase被归为同一分支，与C型FAEs具有比较近的亲源关系。

以I.sakaiensis来源的MHETase晶体结构为模板，该蛋白与BpFae序列一致性为45.1％，通过Discovery Studio进行三维结构同源建模。结果显示，BpFae由两个结构域组成：一个催化结构域(氨基酸残基38-237和432-573)包含Ser209-His455-Asp492催化三联体，另一个lid结构域(氨基酸残基238-431)覆盖活性位点。催化结构域为典型的α/β水解酶折叠，lid结构域插入在α/β水解酶折叠的第7条β折叠股和第15个α螺旋之间。

以Ideonella sakaiensis来源的MHETase晶体结构(PDB ID 6QG9)为模板。如图5中显示了催化域(青色)和盖子域(红色)。BpFae具有典型的α/β水解酶折叠和Ser-Asp-His催化三联体(S209，D492和H455)。

2、表达载体构建

以含有BpFae基因的重组质粒pMD-18T-BpFae为模板，设计引物A1/A2，D1/D2和X1/X2(表1)，PCR扩增带有酶切位点(SaI I和BamH I)和相应表达载体同源片段的BpFae基因。分别对质粒pET-28a，pCold-TF和pGEX-4T-1进行双酶切。使用NovoRec plus一步PCR克隆试剂盒(Novoprotein，上海)，将PCR产物分别连接到不同表达载体上，分别将其成功克隆到表达载体pET-28a，pCold-TF和pGEX-4T-1中。将成功构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。

3、诱导表达

分别将测序成功的重组质粒转入表达宿主大肠杆菌BL21中，接种在100mL含有抗性的LB液体培养基中(对于质粒pGEX-4T-1-BpFae和pCold-TF-BpFae加入100μg/mL的氨苄青霉素，而对于质粒pET28a-BpFae需加入40μg/mL的卡那霉素)，于37℃，220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入0.1mM IPTG进行诱导，并分别在20℃(pGEX-4T-1-BpFae和pET28a-BpFae)和15℃(pCold-TF-BpFae)下再培养20小时。

将培养液在4℃以9400×g离心10min，分离培养基上清液与细胞。加裂解缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.0)将离心所得的细胞进行重悬。通过超声处理(100W，20kHz：开2s，停3s；总时间：15min)裂解细胞。取细胞裂解液为总蛋白；将细胞裂解液以15,000×g离心15min，上清液为粗酶液，沉淀物为不溶组分。

通过SDS-PAGE检测蛋白的表达：将20μL样品与5μL 5×SDS上样缓冲液混匀煮沸后，进行SDS-PAGE分析。浓缩胶浓度为4.5％，分离胶浓度为10％，100V恒压电泳。

酶活的测定方法：用磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.0)将阿魏酸甲酯(25mM，溶于DMSO)稀释至1mM，作为底物溶液。取450μL底物溶液于37℃下预热5min，然后加50μL稀释的酶液，混合后在37℃下反应10min。加入500μL乙腈终止反应。通过高效液相色谱分析底物及产物，采用UV检测器，色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C-18色谱柱。样品通过0.22μm过滤器过滤，待测。流动相为7：3(v/v)的溶剂A(乙腈)和溶剂B(水和乙酸，99：1，v/v)组成，并以0.6mL/min的恒定流速进行洗脱。检测波长为320nm，温度为35℃。将阿魏酸酯酶酶活单位(U)定义为在上述标准条件下1分钟内释放1μmol阿魏酸所需的酶量。

将构建成功的pET28a-BpFae重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，诱导表达。SDS-PAGE结果显示(图7)，目的蛋白条带出现在60kDa附近，但该条带只存在于总蛋白组分和沉淀组分样品中，而在上清中不存在。表明重组目的蛋白在表达过程中形成包涵体。酶活测定结果显示，仅总蛋白组分(0.005U/mL)和上清液(0.005U/mL)有极低酶活力。

将构建成功的pCold-TF-BpFae重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，诱导表达。融合蛋白TF-BpFae的理论分子量为111kDa。SDS-PAGE结果显示(图8)，与pET28a-BpFae系统的表达相比，在TF和冷休克启动子cspA的辅助下，融合蛋白TF-BpFae实现了可溶性表达。但是，酶活测定表明可溶性蛋白的酶活仍然很低(0.04U/mL)，尽管融合蛋白TF-BpFae的活性高于pET28a-BpFae。考虑到分子伴侣TF的存在可能影响蛋白质功能，为此，去除了融合标签TF，但酶活没有发生改变，仍然很低(数据未显示)。这表明目的蛋白即使实现了可溶性表达，但蛋白错误折叠导致没有活性。

将构建成功的pGEX-4T-1-BpFae重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，诱导表达。融合蛋白GST-BpFae的理论分子量为85kDa左右，但SDS-PAGE结果显示(图9)在该处并没有蛋白条带，而在60kDa左右出现疑似目的蛋白条带，这与没有融合GST标签的目标蛋白大小一致，并且大多数目标蛋白实现了可溶性表达。导致这一现象的原因可能是GST融合标签在表达过程中被水解或以其他机制裂解。酶活测定结果显示，总蛋白酶活为0.60U/mL，粗酶液酶活为0.40U/mL，而沉淀中也有少量酶活(0.16U/mL)。粗酶液酶活分别是重组菌pET-28a-BpFae和pCold-TF-BpFae所表达的BpFae粗酶液酶活的80倍和10倍。

4、BpFae酶谱分析

使用Tris-Gly缓冲液(25mM Tris，200mM甘氨酸，pH 8.3，含10％甘油)将粗酶液稀释两倍。对蛋白样品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)，分离胶浓度为7.5％。采用Tris-Gly缓冲液，将电泳槽置于冰水混合物中进行低温电泳，防止蛋白变性。电泳结束，用蒸馏水洗涤凝胶3次，然后用MOPS缓冲液(2.5mM，pH 7.2)平衡30min。然后将平衡好的凝胶浸泡在MOPS缓冲液中，含有阿魏酸甲酯5mM，酚红0.02％，37℃下保温20分钟后检测活性。在有阿魏酸酯酶存在的位置会显出黄色条带。

为了进一步验证不同载体表达目的蛋白的阿魏酸酯酶的活性，对三种融合BpFae的粗酶液进行酶谱分析(图10)。结果显示，只有pGEX-4T-1-BpFae显示出黄色条带，与酶活测定结果一致，因此pGEX-4T-1-BpFae实现了目的蛋白的可溶性及活性表达。

实施例四：重组BpFae的纯化以进行酶学性质研究

1、重组BpFae的纯化

由于表达载体pGEX-4T-1-BpFae在诱导表达过程中，融合蛋白GST-BpFae的N端GST标签被破坏，因此构建了在目的蛋白C端添加6*His标签的重组质粒进行诱导表达。

以含有BpFae基因的重组质粒pMD-18T-BpFae为模板，设计引物

His-S：5'-GGTTCCGCGTGGATCCTTGAACAGAAAATCTGCAT-3'，

His-A：5'-GGCCGCTCGAGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGCGGCAACTGAAGCT-3'。PCR扩增带有酶切位点(SaI I和BamH I)、C端6*His标签和表达载体pGEX-4T-1同源片段的BpFae基因。对质粒pGEX-4T-1进行双酶切。使用NovoRec plus一步PCR克隆试剂盒(Novoprotein，上海)，将PCR产物连接到表达载体pGEX-4T-1上。

将测序成功的重组质粒转入表达宿主大肠杆菌BL21中，采用LB培养基对重组菌株进行活化，然后接种在100mL含有100μg/mL氨苄青霉素的SOB液体培养基中，初始pH为5.0，于37℃培养4h，加入0.05mM IPTG进行诱导，摇床转速240rpm，于26℃下再培养24小时。将培养液在4℃以9400×g离心10min，收集细胞。加裂解缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.0)将离心所得的细胞进行重悬。通过超声处理(100W，20kHz：开2s，停3s；总时间：15min)裂解细胞。将细胞裂解液以15,000×g离心15min，上清液即为BpFae粗酶液。

首先，采用平衡缓冲液(20mM磷酸钠，0.3M NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-HisTrap HP柱(GE Healthcare，美国)及

蛋白纯化系统。洗脱缓冲液为20mM磷酸钠，0.3M NaCl，500mM咪唑，pH 8.0，采用线性洗脱的方式洗脱重组蛋白BpFae。将纯化得到的目的蛋白，透析除去咪唑。通过SDS-PAGE分析蛋白质纯度。采用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。纯化后的BpFae用于酶学性质研究。

2、BpFae最适pH及pH稳定性

以阿魏酸甲酯为底物，考察BpFae的最适反应pH。选择pH 2.0-12.0的缓冲液(50mM)：Gly-HCl缓冲液(pH 2.0-3.5)，柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0-6.5)，磷酸盐缓冲液(pH6.0-8.0)，巴比妥酸盐缓冲液(pH 6.0-7.5)，Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.5)，CAPS缓冲液(pH 10.0-11.0)，NaH₂PO₄缓冲液(pH 11.0-12.0)和Tris-HCl缓冲液(pH 8.0-8.5)，采用如上所述方法测定酶活。

为了研究BpFae的pH稳定性，将BpFae置于上述不同pH的缓冲液中37℃保温30min，然后置于冰水混合物中冷却30min，测定阿魏酸酯酶残余活性。

结果显示，BpFae的最适反应pH为4.5-5.0，当pH为4.0-5.5时，还保留了85％以上的酶活。另外，pH稳定性测定显示，BpFae在中性或者偏酸性的条件下更稳定。当pH为3.5-6.5时，BpFae仍可以保持大于80％的酶活。

3、BpFae最适反应温度及温度稳定性

以阿魏酸甲酯为底物，柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH 5.0)为反应缓冲液，考察不同反应温度(30-75℃)对BpFae酶活的影响。为了考察酶的热稳定性，将重组BpFae在不同温度(20至65℃)下保温30min，然后在冰上冷却30min，并在标准测定条件下测量残余的阿魏酸酯酶活性。

为了确定半衰期，分别将目的蛋白BpFae在45℃下保温2h，在50℃下保温1h，在各个时间点取样，并根据标准方法测定残余酶活。相对酶活为残余酶活相对于初始酶活的百分比。

结果表明BpFae的最适反应温度为50℃(图12)，在55℃时酶活开始迅速下降，在65℃时几乎降为零。温度稳定性结果显示，在pH 5.0条件下，于45℃保温1h，该酶只损失了25％的活性。但当温度高于45℃时，BpFae的热稳定性迅速降低。另外，考察了BpFae在45℃和50℃下的半衰期。结果显示，当温度为45℃时，BpFae的半衰期为80.6min，而当温度为50℃时，半衰期下降至14.3min。

4、金属离子及其他试剂对BpFae活性的影响

为了研究金属离子对BpFae活性的影响，将酶在含终浓度1mM的不同添加剂的缓冲液中于37℃保温30分钟，测定残留的阿魏酸酯酶活性。所考察的添加剂分别为金属离子(FeCl₃，KCl，CaCl₂，NaCl，ZnCl₂，LiCl₂，MgSO₄，Ag₂SO₄，CuSO₄和BaSO₄)，有机溶剂(甲醇，乙醇，异戊醇，DMSO)，去污剂(Triton X-100，Tween 20，SDS)和抑制剂(DTT，PMSF，EDTA)。在没有额外添加剂的缓冲液中保温的BpFae活性作为对照，其值为100％。

结果显示(见表2)，BpFae对大多数金属离子有良好的耐受性。Ag⁺抑制BpFae活性的43％，而Cu²⁺抑制BpFae活性的16％。Fe³⁺可稍微提高BpFae的活性。如表3所示，在其他试剂中，DMSO，Tween-20和Triton-100能够显著增加BpFae的活性。而SDS和PMSF则完全抑制了BpFae的活性。

表2金属离子对BpFae酶活影响

表3其他试剂对BpFae酶活影响

对该酶的酶学性质研究结果表明，BpFae最适pH为4.5-5.0，在中性偏酸性的条件下保持稳定；BpFae最适温度为50℃，BpFae对金属离子有良好的耐受性，多种表面活性剂对酶起到激活作用。综上，BpFae是一种新的非常有研究价值和应用潜力的阿魏酸酯酶。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 阿魏酸酯酶BpFae、其编码基因及其应用

<160> 10

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 1722

<212> DNA

<213> Burkholderia pyrrocinia：BpFae

<220>

<223>

<400> 1

ttgaacagaa aatctgcatt cctctgcatt gcgccgctgt ccgccgcgat gctcgccggt 60

tgcggcggcg acgattcggt cagctccgcg cccacgcacc tgagcgcggc gacgccggcc 120

gcgatggcgc agacctgcga cgcgctcgcc gcgaagcttg cgtatgcgaa cacgtcgttc 180

acgtcggtga cgaccgcggc cgccggcgcg ctgacggtgg ccggccagcc gatcgccgag 240

cactgcgtga tcgaagggaa catgaaccag cgcgtgagcg cggtggacgg ccagacctat 300

gcgatcggct tcgagatgcg cttgccgaag gcgtggaacg gccgcttctt ctaccaggcg 360

aacggcgggc tcgacggcaa cgtcgtgacc gcgaccggcg agatcggcgg cggcgggccg 420

ctgaccgatg cgctgaacca gggcttcgcg gtgatcagct cggattccgg gcacagtgcc 480

gcacagaacc cgctgttcgg cctcgatccg caggcgcggc tcgactacgg ctacggcgcc 540

gtcgatgcgc tgacgccgat ggcgaagcag gtgatccgtc tcgcctacgg caaggcgccc 600

gaccgcagct atttcggcgg ctgctcgaac ggcgggcgtc acgcgatggt cacggccgtg 660

cgcaacccgg gcgactacga cggcattatc gcgggcgatc cgggcttcca tttgccgaag 720

gcggcgatcg gcgagatgta cggcgcgcag cagttcgcga agatcgcgtc ggcgacgggg 780

tcgaacgggc tgccggacat ccgcagcggc ttcaccgatg ccgagcgcca gttcgtcggc 840

gcgaagatcc tcgacaaatg cgatgcgctc gacggcgtgg ccgacgggat ggtgcaggac 900

gtcgccgcgt gccaggcgca cttcagcgtc gagacggaca tcccgacctg cgcgaacggc 960

acgcgcaccg gcgcatgcct gacgcctgcg cagaaaaccg cgctcgagaa cgtgttcgcc 1020

ggggcgcgca acagcgcggg cacggcgctt tatgcgagct ttccgtacga tccgggcgtg 1080

gccggcggcg gctgggctgc gtggaagcaa tcgaattcca tcacgctcga tccggtcgcg 1140

atggcgttca cgttcatgtc gccgccgaaa agcaccgcga cgctcgcgaa cctgcccggt 1200

ttcgcgctcg gcttcgacat ggacaacgat gcgccggcga tcttcgcgac gagcggcgtg 1260

tacacgcaat ccgcgtggtc gttcatgacg ccgcccgacg agacgaacct ggccgcgctg 1320

aagtcgcgcg gcgcgaagct gctcgtctat cacggcaccg gcgacccggt gttctcgttc 1380

aacgacacga gcgactggta ccagcgggtc gcgcaggcga atggcggcga tgcgtcgagt 1440

ttcgcgcgct tctacccggt gcccgggatg aaccactgcg cgggcgggcc ggcggccgac 1500

cagttcgaca tgctgacgcc gctcgtcgcg tgggtcgagc aggggcaggc gcccgccgcg 1560

atcgtggccg ctgcgcgcga tgcgaccaac gcggtgccga acgcggacgt gcccgcgtcg 1620

tggggggccg ggcgcacgcg tccgctgtgt ccgtatccgc aggtggcgcg ctacaacggc 1680

tcgggcgacg tgaattcggc ggcgagcttc agttgccgct ga 1722

<210>2

<211>573

<212> PRT

<213> Burkholderia pyrrocinia：BpFae

<220>

<223>

<400> 2

MNRKSAFLCI APLSAAMLAG CGGDDSVSSA PTHLSAATPA AMAQTCDALA AKLAYANTSF 60

TSVTTAAAGA LTVAGQPIAE HCVIEGNMNQ RVSAVDGQTY AIGFEMRLPK AWNGRFFYQA 120

NGGLDGNVVT ATGEIGGGGP LTDALNQGFA VISSDSGHSA AQNPLFGLDP QARLDYGYGA 180

VDALTPMAKQ VIRLAYGKAP DRSYFGGCSN GGRHAMVTAV RNPGDYDGII AGDPGFHLPK 240

AAIGEMYGAQ QFAKIASATG SNGLPDIRSG FTDAERQFVG AKILDKCDAL DGVADGMVQD 300

VAACQAHFSV ETDIPTCANG TRTGACLTPA QKTALENVFA GARNSAGTAL YASFPYDPGV 360

AGGGWAAWKQ SNSITLDPVA MAFTFMSPPK STATLANLPG FALGFDMDND APAIFATSGV 420

YTQSAWSFMT PPDETNLAAL KSRGAKLLVY HGTGDPVFSF NDTSDWYQRV AQANGGDASS 480

FARFYPVPGM NHCAGGPAAD QFDMLTPLVA WVEQGQAPAA IVAAARDATN AVPNADVPAS 540

WGAGRTRPLC PYPQVARYNG SGDVNSAASF SCR 573

<210>3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 3

ttgaacagaa aatctgcatt cctct 25

<210>4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 4

tcagcggcaa ctgaagctcg 20

<210>5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 5

atgggtcgcg gatccttgaa cagaaaatct gcat 34

<210>6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400>6

cgcaagcttg tcgactcagc ggcaactgaa gct 33

<210>7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 7

taccctcgag ggatccttga acagaaaatc tgcat 35

<210>8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400>8

tagactgcag gtcgactcag cggcaactga agct 34

<210>9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400> 9

ggttccgcgt ggatccttga acagaaaatc tgcat 35

<210>10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列：引物

<220>

<223>

<400>10

ggccgctcga gtcgactcag cggcaactga agct 34

Claims (11)

1.一种阿魏酸酯酶BpFae，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的阿魏酸酯酶BpFae的编码基因。

3.如权利要求2所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.含有如权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，其为诱导表达载体。

6.含有如权利要求5所述重组表达载体的重组细胞，且所述重组细胞是非动物品种和植物品种。

7.含有如权利要求1所述的阿魏酸酯酶BpFae的融合蛋白。

8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，其与标签蛋白融合。

9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，其与组氨酸标签蛋白融合。

10.编码如权利要求7或8所述的融合蛋白的基因。

11.如权利要求1所述的阿魏酸酯酶BpFae在木质纤维素降解中作为辅助酶的应用。

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