CN102286442A - 一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法 - Google Patents

一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法，将经活化的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)CGMCC No.3.5835接种于培养液中，并在25～30℃下发酵培养2～6天；其中，所述的培养液由玉米粉或麸皮与基础液体培养基组成。采用本方法，以玉米粉为发酵培养基的主要原料，烟曲霉通过液体发酵在第4～5天产阿魏酸酯酶酶活稳定达到98U/L以上。本发明原料来源广泛，菌株生长繁殖快；工艺简单，条件温和，易于控制；且产阿魏酸酯酶酶活较高，稳定性好，酶活测定方便，为阿魏酸酯酶的工业化生产提供新思路。

Description

一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法
技术领域
本发明属于生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法。
背景技术
阿魏酸(Ferulic acid，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)大量存在于植物和食品原料中，研究发现，阿魏酸在抗氧化性、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突变和防癌等方面均表现出较强的活性。植物细胞壁木质素中，阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸类物质以酯键方式与半纤维素支链形成致密网状交联结构，从空间上限制了动物或微生物对植物细胞壁的有效降解。除了纤维素酶、β-糖苷酶参与降解纤维素和半纤维素分子外，越来越多研究表明，阿魏酸酯酶、木聚糖酶等可以协同降解致密网状交联结构。
阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterase)又称肉桂酸酯酶，它是一种羧酸酯酶，属胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键。用阿魏酸酯酶处理植物性原料，能将有药用价值和保健功能的阿魏酸游离出来，同时，植物性原料通过阿魏酸酯酶的处理细胞壁会变得疏松，后续作为饲料工业的原料更容易被禽畜消化利用。为此，研究高酶活阿魏酸酯酶的获得和制备方法具有重要意义。
研究表明，真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、乳酸菌、热纤梭菌等。各种微生物分泌的阿魏酸酯酶在氨基酸序列、肽链的结构、物化性质和催化特性上都有所不同，其中，由黑曲霉(Aspergillus niger)得到的两种阿魏酸酯酶FAEA和FAEB受到研究者普遍关注。
公开号为CN101200712A的发明专利申请公开了一种固态发酵生产阿魏酸酯酶的方法，以汽爆处理植物秸秆和麸皮为发酵培养基主要原料，以筛选获得的黑曲霉为菌种，通过固态发酵生产方式生产阿魏酸酯酶。目前，工业上对阿魏酸酯酶的需求很大，应用于工业的阿魏酸酯酶也主要由黑曲霉生产，由于黑曲霉的阿魏酸酯酶对高温、酸或碱等条件耐受性不足，一定程度上限制了阿魏酸酯酶在工业上的应用。因此，筛选高产阿魏酸酯酶的微生物菌株并研究相关的发酵培养体系，有利于阿魏酸酯酶更广泛的工业化应用。
发明内容
本发明提供了一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法，以玉米粉或麸皮为发酵原料，利用烟曲霉通过微生物发酵法生产阿魏酸酯酶，工艺简单，条件温和，阿魏酸酯酶活性高。
将经活化的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)CGMCC No.3.5835接种于培养液中，并在25～30℃下发酵培养2～6天；
其中，所述的培养液由玉米粉或麸皮与基础液体培养基组成。
发酵液经离心操作，取上清液，即得到含阿魏酸酯酶的酶液。
所述的烟曲霉CGMCC No.3.5835购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No.3.5835。该烟曲霉经过鉴定属于半知菌纲(Fungi Imperficti)，壳霉目(Sphaeropsidales)，杯霉科(Discellaceae)，曲霉属(Aspergillus)。在马铃薯(PDA)固体培养基上，菌株生长较满，形成淡绿色或绿色孢子。
接种时，可以先制备浓度为1×106～1×108个/mL的烟曲霉CGMCC No.3.5835孢子悬浮液，将该孢子悬浮液接种到培养液中，接种量优选为30～150mL/1L培养液。
所述的玉米粉或麸皮的粒径优选为40～60目。
优选的，以体积1L计，所述的基础液体培养基包括：KH2PO4 1～4g，Na2HPO4·7H2O 1～6g，NaCl 0～0.2g，酵母粉5～10g，MgSO4·7H2O 0.1～0.3g，CaCl2 0～0.05g。
所述的培养液中玉米粉或麸皮的质量百分比浓度为1～3％。
在所述的发酵培养条件下，玉米粉能更好地诱导烟曲霉表达和分泌阿魏酸酯酶。
所述发酵培养的温度优选为28℃，时间优选为4～5天。在该发酵培养条件下，烟曲霉发酵玉米粉或麸皮产阿魏酸酯酶活性最高。
所述的培养液可以置于摇床中进行发酵培养，摇床转速优选为120～150rpm，更优选为140rpm，这样更有利于微生物细胞的分散及其与发酵原料之间的充分接触。
本发明方法以烟曲霉为发酵微生物，以玉米粉或麸皮为发酵培养基主要原料，在适宜的培养条件下通过液体发酵方式生产阿魏酸酯酶，取得了较理想的产酶效果。烟曲霉对外界条件耐受性强，生长繁殖快；玉米粉或麸皮等原料来源广泛；同时，该法操作简便，易于控制，生产周期短，条件温和，安全可靠，且产阿魏酸酯酶活性较高，稳定性好，酶活测定快捷方便，为阿魏酸酯酶的工业化生产提供新思路。
附图说明
图1为本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
实施例1玉米粉诱导下微生物发酵生产阿魏酸酯酶比较
(1)培养液的制备：取KH2PO4 3g，Na2HPO4·7H2O 6g，NaCl 0.1g，酵母粉8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2 0.05g，粉碎至40目的玉米粉20g，加入1000mL水中，加热混匀，获得培养液；将培养液分装到250mL锥形瓶中，每个锥形瓶含30mL培养液。
(2)菌株的活化：将在4℃下保藏的烟曲霉接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于28℃下活化培养3天；将活化后的烟曲霉用接种针刮入无菌水中，振荡制得烟曲霉孢子悬浮液，烟曲霉孢子悬浮液中烟曲霉孢子浓度为1×106个/mL。上述烟曲霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No.3.5835。
(3)酶液的制备：向30mL培养液中加入1mL烟曲霉孢子悬浮液，于28℃、转速140rpm的摇床中发酵培养5天；发酵后的培养液于4℃、10000rpm下离心2min，上清液稀释10倍待用。
(4)阿魏酸酯酶酶活的测定：取50mM阿魏酸甲酯溶于10mL色谱纯的甲醇，加入90mL柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH6.0)稀释10倍得底物溶液；取2mL底物溶液加热至40℃，再加入1mL步骤(3)制得的酶液，继续在40℃下反应30min；加热至95℃，维持10min终止反应，室温下冷却得到待测酶液。
采用薄层色谱法(TLC)定性分析待测酶液中是否含有阿魏酸，对其中含有阿魏酸的待测酶液再利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行定量测定，换算即可得到阿魏酸酯酶的酶活值。酶活的定义：在40℃，pH6.0条件下，每分钟水解底物阿魏酸甲酯产生1μmoL阿魏酸所需要的酶量为一个酶活力单位。
采用薄层色谱法(TLC)对酶解反应产物阿魏酸进行定性分析，包括：取待测酶液，加等体积的乙酸乙酯进行萃取，静置分层，取上层清液，用毛细管点样器进行点样；将硅胶板放入展开剂中进行展开，展开剂为甲苯∶乙酸＝4∶1(v∶v)，晾干；之后放入碘蒸气中熏蒸一段时间，观察斑点颜色。通过比对阿魏酸标准品与待测酶液样品在硅胶板上的迁移距离(Rf值)，从而定性判断待测酶液样品中是否含有阿魏酸。
采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对酶解反应产物阿魏酸进行定量分析，包括：取阿魏酸标准品溶于甲醇，制成1mg/mL的标准溶液，依次稀释成100mg/L，50mg/L，10mg/L，8mg/L，4mg/L，2mg/L，1mg/L标准溶液；.取配制好的阿魏酸系列标准溶液各1mL于洁净干燥的进样瓶中，进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，阿魏酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线；经统计处理得阿魏酸的线性回归方程为：A＝42710C+16602(R2＝0.9992)。根据同样的方法，对待测酶液进行检测，峰面积值代入线性回归方程即得阿魏酸的含量。色谱条件：色谱柱为C18反相柱(250×4.6mm，4μm)，流动相为乙腈∶0.5％甲酸＝30∶70(v∶v)，流速1.0mL/min，检测波长317nm，柱温30℃，进样量10μL，跑样时间30min。
对比例1-11
将实施例1中的烟曲霉分别用黑曲霉(Aspergillus niger)DN1、黑曲霉DN2、黑曲霉QH12、黑曲霉ZJU、臭曲霉(Aspergillus foetidus)QH、臭曲霉GQ1、点青霉(Penicillium notatum)ALI、浅根霉(Rhizopus ssp)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、康氏木霉(Trichoderma koningii)ZJU、黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc)U11替代(上述菌株为利用常规方法分离得到的试验材料，无特异性要求)，其余步骤相同，以玉米粉为培养基主要原料发酵生产阿魏酸酯酶，具体结果见表1。
表1玉米粉诱导下不同微生物发酵生产阿魏酸酯酶比较
Figure BDA0000088532850000051
从上表可以看出，烟曲霉产阿魏酸酯酶的酶活显著高于黑曲霉或其它菌株，说明烟曲霉更利于阿魏酸酯酶的表达和分泌。
实施例2-5玉米粉诱导下不同发酵时间对烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的影响
(1)培养液的制备：取KH2PO4 3g，Na2HPO4·7H2O 6g，NaCl 0.1g，酵母粉8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2 0.05g，粉碎至60目的玉米粉20g，加入1000mL水中，加热混匀，获得培养液；将培养液分装到250mL锥形瓶中，每个锥形瓶含30mL培养液。
(2)菌株的活化：将在4℃下保藏的烟曲霉(来源同上)接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于28℃下活化培养3天；将活化后的烟曲霉用接种针刮入无菌水中，振荡制得烟曲霉孢子悬浮液，烟曲霉孢子悬浮液中烟曲霉孢子浓度为1×106个/mL。
(3)酶液的制备：向30mL培养液中加入1mL烟曲霉孢子悬浮液，于28℃、转速140rpm的摇床中发酵培养6天；
其中，分别在第3、4、5、6天取样，样品于4℃、10000rpm下离心2min，上清液稀释10倍待用。
(4)阿魏酸酯酶酶活的测定：取50mM阿魏酸甲酯溶于10mL色谱纯的甲醇，加入90mL柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH6.0)稀释10倍得底物溶液；取2mL底物溶液加热至40℃，再加入1mL步骤(3)制得的酶液，继续在40℃下反应30min；加热至95℃，维持10min终止反应，室温下冷却得到待测酶液；采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)定量测定待测酶液中的阿魏酸含量，换算得到阿魏酸酯酶的酶活值，具体结果见表2。
表2玉米粉诱导下不同发酵时间对烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的影响
  序号   发酵时间(天)   阿魏酸含量(mg/L)   酶活(U/L)
  实施例2   3   11.802224303   60.77668419
  实施例3   4   19.084336221   98.27661682
  实施例4   5   19.094380707   98.32834187
  实施例5   6   17.137344884   88.2503985
由表2结果可知，在玉米粉诱导下，烟曲霉发酵4天或5天产阿魏酸酯酶酶活显著高于发酵3天和发酵6天的酶活，稳定达到98U/L以上；说明此条件下，烟曲霉发酵4～5天产酶效果最好。
实施例6-9麸皮诱导下不同发酵时间对烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的影响
(1)培养液的制备：取KH2PO4 3g，Na2HPO4·7H2O 6g，NaCl 0.1g，酵母粉8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2 0.05g，粉碎至60目的麸皮20g，加入1000mL水中，加热混匀，获得培养液；将培养液分装到250mL锥形瓶中，每个锥形瓶含30mL培养液。
(2)菌株的活化：将在4℃下保藏的烟曲霉(来源同上)接种于马铃薯琼脂斜面培养基上，于28℃下活化培养3天；将活化后的烟曲霉用接种针刮入无菌水中，振荡制得烟曲霉孢子悬浮液，烟曲霉孢子悬浮液中烟曲霉孢子浓度为1×106个/mL。
(3)酶液的制备：向30mL培养液中加入1mL烟曲霉孢子悬浮液，于28℃、转速140rpm的摇床中发酵培养6天；
其中，分别在第3、4、5、6天取样，样品于4℃、10000rpm下离心2min，上清液稀释10倍待用。
(4)阿魏酸酯酶酶活的测定：取50mM阿魏酸甲酯溶于10mL色谱纯的甲醇，加入90mL柠檬酸盐缓冲液(0.1M，pH6.0)稀释10倍得底物溶液；取2mL底物溶液加热至40℃，再加入1mL步骤(3)制得的酶液，继续在40℃下反应30min；加热至95℃，维持10min终止反应，室温下冷却得到待测酶液；采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)定量测定待测酶液中的阿魏酸含量，换算得到阿魏酸酯酶的酶活值，具体结果见表3。
表3麸皮诱导下不同发酵时间对烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的影响
  序号   发酵时间(天)   阿魏酸含量(mg/L)   酶活(U/L)
  实施例6   3   5.3614844299   27.60947747
  实施例7   4   5.8527042847   30.13906115
  实施例8   5   5.2604073987   27.08897162
  实施例9   6   4.8869117303   25.16561991
从上表可以看出，在麸皮诱导下，烟曲霉发酵4天产阿魏酸酯酶酶活最高，达到30U/L左右。
对比表2和表3，发现不同原料诱导下烟曲霉发酵产阿魏酸酯酶的酶活有显著差异，以玉米粉为原料的产酶效果优于以麸皮为原料的产酶效果。

Claims (7)

1.一种烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶的方法，包括：
将经活化的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)CGMCC No.3.5835接种于培养液中，并在25～30℃下发酵培养2～6天；
其中，所述的培养液由玉米粉或麸皮与基础液体培养基组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玉米粉或麸皮的粒径为40～60目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以体积1L计，所述的基础液体培养基包括：KH2PO4 1～4g，Na2HPO4·7H2O 1～6g，NaCl 0～0.2g，酵母粉5～10g，MgSO4·7H2O 0.1～0.3g，CaCl2 0～0.05g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养液中玉米粉或麸皮的质量百分比浓度为1～3％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的接种为：将浓度为1×106～1×108个/mL的烟曲霉CGMCC No.3.5835孢子悬浮液接种到培养液中，接种量为30～150mL/1L培养液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为28℃，时间为4～5天。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养液置于摇床中进行发酵培养，摇床转速为120～150rpm。
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