CN103937842A - 一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法 - Google Patents

一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103937842A
CN103937842A CN201410146961.3A CN201410146961A CN103937842A CN 103937842 A CN103937842 A CN 103937842A CN 201410146961 A CN201410146961 A CN 201410146961A CN 103937842 A CN103937842 A CN 103937842A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
bacillus subtilis
suca
knocking out
alpha
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410146961.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103937842B (zh
Inventor
陈坚
刘龙
堵国成
李江华
嘎子侯赛因
侯颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201410146961.3A priority Critical patent/CN103937842B/zh
Publication of CN103937842A publication Critical patent/CN103937842A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103937842B publication Critical patent/CN103937842B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法，属于生物技术领域。其特征在于以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，敲除其基因组中sucA基因。是将sucA基因敲除，从而阻断胞内L-谷氨酸的分解途径，以此改造菌株高效转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸，从而解决了工业化α-酮戊二酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。

Description

一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种通过敲除sucA基因提高重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法，属于生物技术领域。
背景技术
α-酮戊二酸是三羧酸循环的重要中间体，对于协调细胞内碳代谢和氮代谢发挥重要作用。α-苯丙酮酸有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。在生物医学诊断中，α-酮戊二酸可作为酮戊二酸脱氢酶，天冬氨酸转氨酶及丙氨酸转氨酶的底物。α-酮戊二酸可作为合成聚乙烯的原材料，这种聚合物具有生物降解能力。传统α-酮戊二酸生产采用化学法，化学法的主要缺点是缺乏选择性，采用有毒的氰化物及金属铜，产率低，且污染环境。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。
L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。P.mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。
通过PCR和Cre/loxP定点重组系统结合进行基因重组操作，实现了枯草芽孢杆菌内不依赖载体构建的无痕敲除过程。
全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。之前的研究中我们已经成功构建了枯草芽孢杆菌全细胞催化剂，表达来源于P.mirabilis KCTC2566的改造的脱氨酶基因，α-酮戊二酸的产量为8.59g/L。但是由于全细胞催化剂本身对底物有一定吸收，用于胞内分解代谢消耗，从而影响了胞外底物转化生成α-酮戊二酸。
发明内容
本发明要解决的技术问题是解决全细胞催化剂本身对L-谷氨酸的吸收浪费，从而提高胞外转化L-谷氨酸的产量。是将sucA基因敲除，从而阻断胞内L-谷氨酸的分解途径，以此改造菌株高效转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸，从而解决了工业化α-酮戊二酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。本发明以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，敲除其基因组中sucA基因。
所述重组枯草芽孢杆菌为表达的改造后L-氨基酸脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌168。
所述改造后L-氨基酸脱氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的突变体为F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T
所涉及到的微生物有：P.mirabilis KCTC2566、B.subtilis168。
所涉及到的质粒有：p7Z6(pMD18-T containing lox71-zeo-lox66cassette)、pTSC(Emr Ampr;temperature sensitive in B.subtilis)，均系本实验室保存。
所述sucA基因敲除方法：PCR扩增sucA基因上下游约1000bp及抗性标记片段约1000bp，融合PCR制备打靶片段。将此融合产物转化枯草感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株。最后用温敏型质粒消去抗性。所述sucAGENBANK ID：939507。
所述微生物菌株的种子培养与发酵培养基：种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，自来水定容至100mL。发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌）。
本发明的有益效果：本发明成功实现了枯草芽孢杆菌内sucA基因的敲除，从而阻断了细胞对底物的吸收，进一步提高了胞外转化L-谷氨酸的产量，α-酮戊二酸的产量可达12.20g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成α-酮戊二酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产α-酮戊二酸的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产α-酮戊二酸，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
具体实施方式
材料与方法
种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，自来水定容至100mL。
发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/LK2HPO4的溶液。
α-酮戊二酸含量测定：将转化体系进行离心，弃上清，离心向细胞中加入50μLL-谷氨酸(100mM)，30min后，加入45μl三氯乙酸（20%），室温放置30min，终止反应。加入20μL DNP（20mM），室温放置15min，加入400μL NaOH（0.8M）终止反应。离心，取上清，酶标仪测定520nm的吸光度。
实施例1sucA基因的敲除
之前的研究中，通过枯草芽孢杆菌表达通过易错PCR或定点饱和突变改造的L-氨基酸脱氨酶基因（SEQ ID NO.1），提高了全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的转化率。
以此重组枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，以sucA-L-F和sucA-L-R为引物，PCR扩增sucA基因上游约1000bp，以sucA-R-F和sucA-R-R为引物，PCR扩增sucA基因下游约1000bp。以p7Z6为模板，以sucA-Z-F和sucA-Z-R为引物，扩增抗性标记片段Lox71-zeo-lox66约1000bp。对这三个片段进行融合PCR。融合PCR片段转化枯草芽孢杆菌，同源重组，筛选zeor转化子。温敏型质粒pTSC转化zeor转化子，促进lox71和lox66的接合，从而消除zeo抗性。通过50℃
培养12h，丢失温敏型质粒pTSC。从而得到了敲除sucA基因的菌株。
表1PCR所用引物
实施例2全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程
实施例1中的原始枯草芽孢杆菌和敲除sucA后的重组枯草芽孢杆菌接种种子培养基（氯霉素10mg/L），37℃，200rpm过夜培养。发酵在3L NBS发酵罐中进行，1%接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD600达到0.6，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后，8,000rpm低温离心10min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液洗两遍菌体。全细胞转化体系为：L-谷氨酸15g/L，全细胞催化剂20.0g/L，反应在20mM Tris-HCl(pH8.0)中进行，37℃，200rpm转化24h。
敲除sucA后的重组枯草芽孢杆菌，其α-酮戊二酸的产量可达12.20g/L；未敲除sucA的重组枯草芽孢杆菌，其α-酮戊二酸的产量为8.59g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法，其特征在于以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株，敲除其基因组中sucA基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组枯草芽孢杆菌为表达改造后L-氨基酸脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌168。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述改造后L-氨基酸脱氨酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的突变体为F110I/A255T/E31D/R228C/L249S/I351T。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于敲除重组枯草芽孢杆菌中sucA基因的方法为：通过PCR方法将sucA基因上下游约1000bp及抗性标记片段约1000bp融合，抗性标记片段两端含有突变的loxP位点；将此融合产物转化枯草感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株；最后用温敏型质粒消去抗性，实现无痕敲除。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于敲除sucA基因后此全细胞催化剂转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的产量为12.20g/L。
CN201410146961.3A 2014-04-11 2014-04-11 一种提高全细胞转化生产α‑酮戊二酸产量的方法 Active CN103937842B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410146961.3A CN103937842B (zh) 2014-04-11 2014-04-11 一种提高全细胞转化生产α‑酮戊二酸产量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410146961.3A CN103937842B (zh) 2014-04-11 2014-04-11 一种提高全细胞转化生产α‑酮戊二酸产量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103937842A true CN103937842A (zh) 2014-07-23
CN103937842B CN103937842B (zh) 2017-01-18

Family

ID=51185711

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410146961.3A Active CN103937842B (zh) 2014-04-11 2014-04-11 一种提高全细胞转化生产α‑酮戊二酸产量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103937842B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105505975A (zh) * 2016-01-06 2016-04-20 武汉康复得生物科技股份有限公司 芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂盒
CN107287144A (zh) * 2017-07-19 2017-10-24 江南大学 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
WO2019104759A1 (zh) * 2017-11-30 2019-06-06 江南大学 一种热稳定性提高的l-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1292421A (zh) * 1999-08-20 2001-04-25 味之素株式会社 通过伴随有沉淀的发酵生产l－谷氨酸的方法
CN101563453A (zh) * 2006-12-19 2009-10-21 味之素株式会社 L-氨基酸的生产方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1292421A (zh) * 1999-08-20 2001-04-25 味之素株式会社 通过伴随有沉淀的发酵生产l－谷氨酸的方法
CN101563453A (zh) * 2006-12-19 2009-10-21 味之素株式会社 L-氨基酸的生产方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李迈: "若干中心代谢途径单基因敲除对大肠杆菌代谢影响的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》, 15 August 2007 (2007-08-15) *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105505975A (zh) * 2016-01-06 2016-04-20 武汉康复得生物科技股份有限公司 芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂盒
CN107287144A (zh) * 2017-07-19 2017-10-24 江南大学 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN107287144B (zh) * 2017-07-19 2020-01-21 江南大学 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
WO2019104759A1 (zh) * 2017-11-30 2019-06-06 江南大学 一种热稳定性提高的l-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103937842B (zh) 2017-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103911400B (zh) 一种采用全细胞转化生产α-酮戊二酸的方法
CN102093987B (zh) 微生物发酵生产低温植酸酶的方法
CN102816729B (zh) 一株盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用
CN104830815A (zh) 一种采用全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法
CN103642743A (zh) 一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法
CN103881954B (zh) 一株产γ-聚谷氨酸基因工程菌及其高产γ-聚谷氨酸方法
CN103789247B (zh) 一种全细胞转化生产α-酮异己酸的方法
CN105062997A (zh) 一种酶活提高的l-天冬酰胺酶突变体及其构建方法
CN108277190A (zh) 一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法
CN102392056A (zh) 一种基因工程菌株及利用该菌株生产二羟基丙酮的方法
CN104371966A (zh) 一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用
CN105238732A (zh) 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-瓜氨酸的方法
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
CN103937842A (zh) 一种提高全细胞转化生产α-酮戊二酸产量的方法
CN102093990B (zh) 微生物发酵生产低温淀粉酶的方法
CN104862264B (zh) 一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌
CN103555646B (zh) 一种共表达l-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌
CN105647846B (zh) 一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌
CN101469318B (zh) (r)-羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联促进(r)-苯基乙二醇的合成
KR20140145397A (ko) 1,3-프로판디올 생성 재조합 미생물 및 이를 이용한 1,3-프로판디올의 제조 방법
CN104830744A (zh) 利用sd-as序列偶联(r)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶制备(r)-苯乙二醇的方法
CN111394396B (zh) 一种微生物利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法
CN109517778B (zh) 一种枯草芽孢杆菌全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法
CN103865951A (zh) 酿酒酵母表达载体及其构建和应用
CN110591995A (zh) 一种共表达重组菌及其在合成呋喃羧酸中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant