CN105505975A - 芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂盒，该芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒的基因组中含有：仅一种正筛选标记的抗性基因；能在大肠杆菌中复制的复制子；能在芽胞杆菌中复制的温敏型复制子；至少一个I-Scel酶切位点；仅一种显色蛋白基因；其中，抗性基因和显色蛋白基因前的启动子均为芽胞杆菌中的组成型启动子。本发明还提供一种用于提高上述质粒敲除或敲入效率的辅助质粒，其基因组中含有的抗性基因和显色蛋白基因不同于上述敲除/入质粒。采用上述两种质粒，可以连续或迭代修饰芽胞杆菌基因组中一个或多个目的DNA序列，应用于芽胞杆菌的遗传改造、代谢过程研究、功能基因组研究和工业化应用研究等多种领域。
Description
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，具体涉及芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂盒。
背景技术
芽胞杆菌(Bacillus)是细菌的一科，指能形成芽胞(内生胞子)的杆菌或球菌，包括芽胞杆菌属、芽胞乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽胞八叠球菌属等，它们对外界有害因子抵抗力强，分布广。芽胞杆菌种属中有许多被美国FDA认定为GRAS(GenerallyRecognizedasSafe)菌株，在工业、农业、食品及医疗等领域都有着重要的应用价值。芽胞杆菌各属拥有各自生物学特性，通过分子遗传育种，可以选育出特定功能强势的菌种，应用于工农业生产各个方面。芽胞杆菌基因敲除技术是研究基因功能的重要手段，利用该技术进行分子生物学研究有利于加深对芽胞杆菌代谢调控机制的认识。近年来随着大量芽胞杆菌的基因组数据的公布，采用基因工程学育种的方法改造菌种成为当下遗传育种研究的热点，芽胞杆菌遗传学研究和代谢工程研究迫切需要一种快速，无痕和高效的基因敲除和敲入的载体工具。
传统基因敲除质粒载体构建方法是将待敲除基因上下游DNA片段和抗性基因片段分别通过酶切连接或无缝克隆的方法整合到基因敲除骨架载体上，其最大的弊端是最终的敲除菌株的基因组中会留下抗性基因和其它载体片段，对该菌株进一步的基因敲除和筛选不利，限定了敲除菌株的应用范围，如带有外源抗性基因和载体片段的敲除菌株不适合于食品类产品的生产。
为了实现基因的无痕敲除，更好地筛选发生同源重组的阳性转化子，早期的研究者开发了一系列基于正负筛选系统的基因无痕敲除方法。这类方法一般分为两步，第一步采用正筛选标记验证敲除载体与基因组发生了单交换或双交换，第二步，迫使基因组发生第二次同源重组，通过负筛选标记筛选阳性克隆子。常用的正筛选标记有：抗生素抗性基因，黄嘌呤/鸟嘌呤转移酶基因，次黄嘌呤转移酶基因，胸腺嘧啶转移酶基因，嘌呤霉素乙酰转移酶等。常用的负筛选标记有mazF、upp、blaI、ysbC、hwel、SacB等，其中在芽胞杆菌基因无痕敲除中应用较多的是mazF(大肠毒性蛋白基因)和upp(尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因)。来自于大肠杆菌的毒性蛋白基因mazF用时间长了之后会累计产生抗mazF敏感性菌株，且敲除构建载体过程比较复杂，mazF的泄漏表达会使大肠杆菌致死，使得敲除载体易于发生基因突变或缺失。而upp的应用需要首先敲除宿主的内源基因，通用性较差，且嘧啶类似物5-氟尿嘧啶(5FU)的纯度和稳定性对阳性克隆子的筛选非常大，筛选工作量较大。此外，这类敲除质粒一般不能在芽胞杆菌中自主复制，与基因组发生同源重组多数情况下是利用同源双交换的原理，而且芽胞杆菌的转化效率普遍较低，发生单交换的效率都比较低，发生双交换的概率更低，鉴定和验证的工作量大，实际操作过程比较费时费力。
此外，利用来源于金黄色酿脓葡萄球菌的质粒pE194中的温敏型复制子构建的敲除质粒实现芽胞杆菌中基因的无痕敲除也有成功的例子(QiG,KangY,LiL,XiaoA,ZhangS,WenZ,XuD,ChenS,Deletionofmeso-2,3-butanediolDehydrogenaseGenebudCforEnhancedD-2,3-butanediolProductioninBacilluslicheniformis,Biotechnol.Biofeul,2014,7:16).这类敲除质粒能够在芽胞杆菌中复制，而且能通过升高温度胁迫敲除质粒与基因组发生同源单交换，增加了与基因组发生同源重组的概率。但发生同源单交换的菌株在筛选同源双交换时只能依靠重复序列的自发重复剪接，效率比较低，筛选工作量大，周期长。
发明内容
为了解决现有技术中基因敲除或敲入概率低、筛选鉴定和验证工作量大、成功率低、周期长等问题，本发明提供了一种芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒。本发明还提供了一种用于增强敲除或敲入效率的辅助质粒。本发明还提供了一种基因敲除或敲入方法。本发明还提供了一种基因敲除或敲入试剂盒。
本发明提供的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，该质粒的基因组中含有：
仅一种正筛选标记的抗性基因，该抗性基因的启动子为双功能启动子；
能在大肠杆菌中复制的复制子；
能在芽胞杆菌中复制的温敏型复制子；
至少一个I-Scel酶切位点；
仅一种显色蛋白基因，该显色蛋白基因的启动子为组成型启动子；
所述双功能启动子是指既能在大肠杆菌中启动基因表达，也能在芽胞杆菌中启动基因表达的启动子。
所述的组成型启动子，是指在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。
优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2~13中的任意一条所示。这些启动子均选自芽胞杆菌：如P43(SEQIDNO.2)，Pamy(SEQIDNO.3)，PliaG(SEQIDNO.4)，PyxiE(SEQIDNO.5)，Pcwp(SEQIDNO.6)，P2(SEQIDNO.7)，P5(SEQIDNO.8)，PlepA(SEQIDNO.9)，PyrkA(SEQIDNO.10)，Pveg(SEQIDNO.11)，PgsiB(SEQIDNO.12)或Pcry3Aa(SEQIDNO.13)。
优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述抗性基因为卡那霉素基因Kan、氯霉素基因Cm、四环素基因Tet、红霉素基因Erm或博来霉素基因Shble。
优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述显色蛋白基因为绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因，所述红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
优选地，上述芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒中，所述温敏型复制子的核苷酸序列如SEQIDNO.14~16中的任意一条所示。
其中SEQIDNO.14的序列来自pE194质粒(源自金黄色酿脓葡萄球菌)的复制子；SEQIDNO.15的序列来自pWV01质粒(源自乳酸乳球菌)的复制子；SEQIDNO.16的序列来自以上两种质粒复制子的突变形式。
本发明提供的一种辅助质粒，用于辅助提高以上任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒的基因敲除或敲入效率，该质粒的基因组中含有：
仅一种正筛选标记的抗性基因，且该抗性基因以上任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组中的正筛选标记的抗性基因不同，该抗性基因的启动子为双功能启动子；
能在芽胞杆菌中复制的温敏型复制子；
能在大肠杆菌中复制的复制子；
内切酶I-Scel基因；
仅一种显色蛋白基因，且与芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组中的显色蛋白基因不同，该显色蛋白基因的启动子为组成型启动子；
所述双功能启动子是指既能在大肠杆菌中启动基因表达，也能在芽孢杆菌中启动基因表达的启动子；
其中，启动内切酶I-Scel基因表达的启动子是芽胞杆菌中的诱导型启动子。
所述诱导型启动子是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平，即其启动基因转录的功能需要经过条件诱导。
内切酶I-Scel是一种由内含子编码的归位内切酶，该内含子存在于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的线粒体中。
优选地，上述辅助质粒中，所述内切酶I-Scel基因的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；辅助质粒（温敏型）中的显色蛋白基因为绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、bgaB基因（显蓝色）、邻苯二酚2,3-双加氧酶显色标志基因xylE（显黄色）或酪氨酸酶-黑色素报告基因melM（显黑色）。
辅助质粒中的两种复制子与芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组中的两种复制子相同。其中温敏型复制子核苷酸序列如SEQIDNO.14~16任意一条所示。
优选地，上述辅助质粒中，所述诱导型启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.18~25中任意一条所示。
本发明提供的一种芽胞杆菌基因无痕敲除/入方法，当需要敲除目的基因时，包括以下步骤：
（1）分别扩增待敲除基因的上、下游同源臂，通过重叠PCR方法连接在一起，克隆至以上任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组，测序验证正确的质粒转化芽胞杆菌，在含有质粒中抗性基因对应的抗生素培养基上42~44℃条件下培养，并设置用于检测质粒中显色基因表达情况的显色条件，筛选出发生同源单交换的菌株；
（2）将以上任一所述的辅助质粒转化到发生同源单交换的菌株中，在含有辅助质粒中抗性基因对应的抗生素培养基上42~44℃条件下培养，设置诱导型启动子的诱导条件，以及检测辅助质粒中显色基因表达的显色条件，筛选出目的基因敲除的阳性克隆子进行鉴定；
（3）将成功实现目的基因敲除的阳性克隆子接种到培养液中在42~45℃条件下进行培养，每8~12小时接种传代一次，传代2次后，取样在固体培养基上划线培养，挑取无显色的菌落分别点种在抗性和无抗性培养平板上，在无抗性培养平板上生长且在抗性培养平板上不生长的克隆子即为最终的无痕敲除目的基因的阳性菌株；
当需要敲入目的基因时，只需要将步骤（1）中克隆至芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组的核苷酸序列替换为扩增后的待敲入目的基因及其上、下游同源臂即可，其他步骤相同。
以上所述的培养基、培养液均为常规市售或自行配制的适用于芽胞杆菌生长的培养基质。
本发明提供的一种芽胞杆菌基因敲除/入试剂盒，其包括以上任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，以及以上任一所述的辅助质粒；该试剂盒应用于枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、短短小芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、嗜热芽胞杆菌或苏云金杆菌中的基因无痕敲除或敲入。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明使用显色基因优选荧光蛋白基因和抗性基因作为双正筛选标记，第一步转化阳性筛选率达到100%，通过菌株颜色的变化筛选同源双交换的菌株简单方便。
本发明中采用的两个质粒都带有温敏型复制子，可以使含有I-SceI酶切位点的敲除/入质粒和表达I-SceI酶的温敏型辅助质粒在芽胞杆菌中复制，通过高温培养胁迫含有I-SceI酶切位点的敲除/入质粒与基因组上的同源序列发生同源重组，与不能在芽胞杆菌中复制的敲除/入质粒相比显著提高了分子内重组的效率，表达I-SceI酶的温敏型辅助质粒在筛选到双交换的阳性克隆子后能通过1~2次的高温传代培养迫使质粒完全丢失；
本发明中采用的两个大肠杆菌-芽胞杆菌的穿梭质粒都只有一种抗性基因，在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中表达时可使用同一种抗生素筛选，易于基因操作和质粒转化。
本发明的方法中使用了表达I-SceI酶的温敏型辅助质粒，胞内诱导表达产生的归位内切酶可以识别整合到芽胞杆菌基因组上载体片段中的一个或多个I-SceI酶切位点，引起基因组中双链DNA的断裂，诱发细胞产生SOS应激响应，并同时提高分子内基因重组效率，更快完成同源双交换过程，提高了基因无痕敲除/入的效率。
本发明的方法可以连续或迭代修饰芽胞杆菌基因组中一个或多个目的DNA序列，包括无痕敲除或敲入一个或多个目的DNA片段至基因组，改变基因组上一个或多个基因，可应用于芽胞杆菌的遗传改造、代谢过程研究、功能基因组研究和工业化应用研究等。
附图说明
图1本发明的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组结构示意图；
图2本发明的辅助质粒基因组结构示意图，辅助质粒为表达I-SceI酶的芽胞杆菌-大肠杆菌温敏型穿梭质粒；
图3利用同源单交换和同源双交换实现基因无痕敲除的过程图；
图4芽胞杆菌基因无痕敲除质粒pEBKS194-GFP+质粒的构建；
图5表达I-SceI酶的温敏型辅助质粒pTISWts-RFP的构建；
图6平板置于紫外光下筛选敲除质粒转化成功的阳性克隆子；A：CICC10073(pKS194GFP-aprEUD)菌株；B：WB800N(pKS194GFP-amyE-UaprD)菌株；
图7双交换菌株的筛选；A和B分别是卡拉霉素抗性平板和无抗性，筛选aprE基因无痕敲除的克隆子；C和D分别是卡拉霉素抗性平板和无抗性，筛选14580apr基因无痕敲入的克隆子。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中用到的枯草芽胞杆菌CICC10073来源为CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心，http://www.china-cicc.org/)；本发明所用到的原始质粒pE194、地衣芽胞杆菌ATCC21415和地衣芽胞杆菌ATCC14580来源为ATCC(美国模式培养物集存库,http://www.atcc.org/)；枯草芽胞杆菌168菌株和pMUTIN-GFP+质粒来源为BGSC(BacillusGeneticStockcenter,http://www.bgsc.org/)；质粒pHT01和pHIS1525以及枯草芽胞杆菌WB800N来源为MoBiTec公司(http://www.mobitec.com/)；pHY300PLK质粒和大肠杆菌DH5α来源于Takara公司(http://www.takara.com.cn/)；pWEBK15载体来源于专利CN201410430501.3。
Pamy启动子，红色荧光蛋白基因和trpA序列合并一起全基因合成，红色荧光蛋白基因根据芽胞杆菌密码子偏爱性进行优化；来源于pWV01质粒的温敏型复制子序列直接进行全基因合成；Pcry3Aa启动子序列和归位内切酶I-SceI基因序列全基因合成。来源于枯草芽胞杆菌的启动子从枯草芽胞杆菌168菌株基因组扩增，其它来源启动子序列全基因合成。
本发明中用到的所有的PhusionDNA聚合酶、限制性内切酶(DpnI，BglII，EcoRI等)、DNA连接酶、磷酸化酶等分子生物学试剂从Thermofisher公司购买(http://www.thermofisher.com/cn/zh/home/brands/thermo-scientific.html)；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(http://www.vazyme.com/)；其它常用生化试剂均是市售分析纯。PCR产物回收和胶回收DNA的方法均采用omega公司的试剂盒的方法。
表1扩增引物与测序引物
| 名称 | 序列(5’-3’ ) | 编号 | 长度(bp) |
| F1 | agatctTAGGGATAACAGGGTAAT TTTTCTACGGGGTCTGACGCTC | SEQ ID NO.26 | 46 |
| R1 | agatctGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCC | SEQ ID NO.27 | 30 |
| P1 | ATCCGGCAAACAAACCACC | SEQ ID NO.28 | 19 |
| F2 | gaattc TAGGGATAACAGGGTAAT ACAGGGATAAAATCGGCGGC | SEQ ID NO.29 | 44 |
| R2 | gaattcGAGCTCAGCATTATTGAGTG | SEQ ID NO.30 | 25 |
| P2 | TGTATTCCATGCCCGTAATG | SEQ ID NO.31 | 20 |
| F3 | TAGGGATAACAGGGTAAT TGAGCAAAAGGCCAGCAAAAG | SEQ ID NO.32 | 39 |
| R3 | CATGTCAGGTGGCACTTTTC | SEQ ID NO.33 | 20 |
| P3 | GAGAAAGGCGGACAGGTATC | SEQ ID NO.34 | 20 |
| F4 | CGAGGCAAAAGCTTGGGAAGGAAATGATGACCTCG | SEQ ID NO.35 | 35 |
| R4 | AAGGAGACATGAACGATGGCTAGCAAAGGAGAAGAAC | SEQ ID NO.36 | 37 |
| F5 | CGTTCATGTCTCCTTTTTTATGTAC | SEQ ID NO.37 | 25 |
| R5 | CAAGCTTTTGCCTCGAGCTCG | SEQ ID NO.38 | 21 |
| P4 | CGTGTCTTTCTTGGAATTGTG | SEQ ID NO.39 | 21 |
| P5 | ACAAACATCACCCTCTTGC | SEQ ID NO.40 | 19 |
| F6 | GGAACGAAAACTCACCAAATTTGAGCGTGTGGGAC | SEQ ID NO.41 | 35 |
| R6 | TCCAAGAAAGACACGCGATTATGTCTTTTGCGCAG | SEQ ID NO.42 | 36 |
| R7 | GTGAGTTTTCGTTCCACTGA | SEQ ID NO.43 | 20 |
| P6 | ATCCGGCAAACAAACCACC | SEQ ID NO.44 | 19 |
| F8 | CTATTTAGTTATTTGTTTGGTCAC | SEQ ID NO.45 | 24 |
| R8 | TTCAACAAACGGGCCATATTG | SEQ ID NO.46 | 21 |
| F9 | GGCCCGTTTGTTGAACGATTTTTTATTAAAACGTC | SEQ ID NO.47 | 35 |
| R9 | CAAATAACTAAATAGGATCATTTTGTTTATTGCA | SEQ ID NO.48 | 35 |
| P7 | CAATAATGAGGGCAGACG | SEQ ID NO.49 | 18 |
| P8 | TTAGTTGCTGAAAGGTGCG | SEQ ID NO.50 | 19 |
| F10 | GTGAGTTTTCGTTCCACTGA | SEQ ID NO.51 | 20 |
| R10 | ACCTGACGTCTAAGAAACCA | SEQ ID NO.52 | 20 |
| F11 | TCTTAGACGTCAGGTACTGGCTGAAAACATTGAGC | SEQ ID NO.53 | 35 |
| R11 | GGAACGAAAACTCACAAAAAAGCCCGCTCATTAGG | SEQ ID NO.54 | 35 |
| P9 | GATTACGCGCAGACCAAAAC | SEQ ID NO.55 | 20 |
| P10 | TGGTTTCTTAGACGTCAGGT | SEQ ID NO.56 | 20 |
| F12 | TTGTCATTTCCTCCTTTGAT | SEQ ID NO.57 | 20 |
| R12 | ACGTCTAAGAAACCAGAGCTCGGTACCCGGTTGA | SEQ ID NO.58 | 34 |
| F13 | CCTTTCAGCAACTAAGACTCTAGAGGATCCTTAT | SEQ ID NO.59 | 34 |
| R13 | AGGAGGAAATGACAAATGCATCAAAAAAACCAGGT | SEQ ID NO.60 | 35 |
| F14 | CGTGTCTTTCTTGGAGATGAAGCCAATATTCCGGCT | SEQ ID NO.61 | 36 |
| R14 | ATGTTCCGGCGCATTCTCT | SEQ ID NO.62 | 19 |
| F15 | AATGCGCCGGAACATCAAAGACATCAGATGCGGC | SEQ ID NO.63 | 34 |
| R15 | CAAGCTTTTGCCTCGCCATCCTTCGGCAAATCCTC | SEQ ID NO.64 | 35 |
| P11 | TAGAAGGGCGGCATGATCT | SEQ ID NO.65 | 19 |
| P12 | CTGCTGCTGGGATTACACAT | SEQ ID NO.66 | 20 |
| F16 | CGTGTCTTTCTTGGACGATCAGACCAGTTTTTAAT | SEQ ID NO.67 | 35 |
| R16 | ATGTTTGCAAAACGATTCA | SEQ ID NO.68 | 19 |
| F17 | TCATGTGAAAGGCGTTCGACATGGATGAGCGATG | SEQ ID NO.69 | 34 |
| R17 | CAAGCTTTTGCCTCGTCAATGGGGAAGAGAACCG | SEQ ID NO.70 | 34 |
| F18 | TCGTTTTGCAAACATGGCATCAGGAAAAAGCCGC | SEQ ID NO.71 | 34 |
| R18 | ACGCCTTTCACATGAGCT | SEQ ID NO.72 | 18 |
| F19 | CGTGTCTTTCTTGGACTACACCCTTTCATTGACAG | SEQ ID NO.73 | 35 |
| R19 | ATGAAATCAGCTCATGTGA | SEQ ID NO.74 | 19 |
| F20 | ATGAGCTGATTTCATCAAGCGGCAAAGAAACGATC | SEQ ID NO.75 | 35 |
| R20 | CAAGCTTTTGCCTCGAAGCGGTATGCTCTATGGAC | SEQ ID NO.76 | 35 |
实施例1含有I-SceI酶切位点的敲除质粒pEBKS194-GFP+
如本发明内容所述，含有I-SceI酶切位点的敲除质粒可以有多种组合形式，本例子以其中一种质粒形式pEBKS194-GFP+的构建过程进行详细说明。所有引物序列见表1。
载体pWEBKS3的构建
以CN201410430501.3专利中的表达质粒pWEBK15（该质粒的抗生素抗性基因仅有卡那霉素抗性基因一种）为模板，使用磷酸化后的上下游引物F1和R1进行全质粒PCR扩增，扩增产物在37℃经限制性内切酶DpnI过夜消化后回收，用BglII酶切后连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P1测序验证载体中增加了第一个I-SceI酶切位点，测序正确的载体命名为pWEBKS1。
以pWEBKS1载体为模板，以磷酸化后的上下游引物F2和R2进行全质粒PCR扩增，扩增产物经DpnI酶过夜消化(37℃)后回收，扩增产物用EcoRI酶切后连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P2测序验证载体中增加了第二个I-SceI酶切位点，测序正确的载体命名为pWEBKS2。
以pWEBKS2载体为模板，以磷酸化后的上下游引物F3和R3进行全质粒PCR扩增，扩增产物经DpnI酶过夜消化(37℃)后回收，进行平末端连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P3测序验证载体中增加了第三个I-SceI酶切位点，测序正确的载体命名为pWEBKS3。
（1）载体pEBKS-GFP+的构建
以pMUTIN-GFP+质粒（该质粒基因组中显色蛋白基因仅有绿色荧光蛋白基因一种）为模板，用上下游引物F4和R4扩增Cycle3GFP基因；以pWEBKS3为模板，引物F5和R5扩增载体片段，基因片段和载体片段的扩增产物经DpnI酶过夜消化(37℃)后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选克隆子，挑取紫外光下有绿色荧光的克隆子，用引物P4和P5进行PCR验证和测序验证，测序成功的载体命名pEBKS-GFP+。
（2）敲除质粒pEBKS194-GFP+的构建
以pE194质粒为模板，以引物F6和R6扩增载体温敏型复制子194ts基因片段；以载体pEBKS-GFP+为模板，引物P4和R7扩增载体片段，基因片段和载体片段的扩增产物经DpnI酶过夜消化(37℃)后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P5和P6进行测序验证，测序成功的载体命名为pEBKS194-GFP+，图谱见图4。
实施例2表达I-SceI酶的温敏型质粒pTISWts-RFP的构建
如本发明内容所述，表达I-SceI酶的温敏型辅助质粒可以有多种组合形式，本例子以其中一种质粒形式pEBTWts-RFP的构建过程进行详细说明。所有引物序列见表1。
（1）载体pHYWVts的构建
以pHY300PLK载体（该质粒的抗生素抗性基因有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性）为模板，以引物F8和R8扩增载体片段；以合成的温敏型复制子DNA片段（SEQIDNO.16）为模板，用引物F9和R9扩增温敏型复制子WVts基因片段，基因片段和载体片段的扩增产物经DpnI酶过夜消化(37℃)后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在10μg/mL四环素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P7和P8进行测序验证，测序成功的载体命名pHYWVts。
（2）载体pTWVts-RFP的构建
以载体pHYWVts为模板，以引物F10和R10扩增载体片段；以全基因合成的融合片段（SEQIDNO.3和SEQIDNO.1两段DNA片段连接产物）为模板，用引物F11和R11扩增PamyRFPtrpA基因片段（即淀粉酶基因启动子，红色荧光蛋白编码基因和trpA基因终止子的融合基因），基因片段和载体片段的扩增产物经DpnI酶过夜消化(37℃)后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在10μg/mL四环素抗性平板上筛选克隆子，挑取紫外光下有红色荧光的克隆子，用引物P9和P10进行测序验证，测序成功的载体命名pTWVts-RFP。
（3）温敏型辅助质粒pTISWts-RFP的构建
以质粒pTWVts-RFP为模板，以P8和P10为上下游引物扩增载体片段；以pHIS1525质粒为模板，用引物F12和R12扩增木糖启动子抑制基因xylR和木糖启动子基因xylA的融合基因片段；以全基因合成的含有I-SceI基因的质粒为模板，引物F12和R12扩增I-SceI基因片段；所有基因片段和载体片段的扩增产物经DpnI酶过夜消化(37℃)后回收，用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和两个基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在10μg/mL四环素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物F8和R10进行测序验证，测序成功的载体命名pTISWts-RFP，图谱见图5。
实施例3枯草芽胞杆菌CICC10073菌株中aprE基因的敲除
（1）敲除载体pKS194GFP-aprEUD的构建
采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取芽胞杆菌的基因组DNA作为基因扩增的模板(参照文献：微生物学报,2006,46(1):7-12.)；以枯草芽胞杆菌CICC10073基因组DNA为模板，以引物F14和R14为引物扩增aprE基因的上游同源臂aprE-UP，以引物F15和R15为引物扩增aprE基因的下游同源臂aprE-down；以pEBKS194-GFP+质粒为模板，以引物F4和R6扩增载体片段，载体片段的扩增产物在37℃经DpnI酶消化过夜后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和两个基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P11和P12进行测序验证，测序成功的载体命名为pKS194GFP-aprEUD。
（2）敲除质粒pKS194GFP-aprEUD转化
提取pKS194GFP-aprEUD质粒，将其电转到枯草芽胞杆菌CICC10073中，感受态细胞制备和电转化方法参照以下文献：JMicrobiolMeth.1999,34(3):183-191；BiotechnolLett.2011,33:1047–1051；Anal.Biochem.2012,424:127–129；转化的细胞涂布到含有20μg/mL卡那霉素抗性的LB固体平板上30℃培养16h，将其置于紫外光下，挑取平板上显绿色荧光的克隆子(图6A)，接种到LB液体培养基中于42~45℃培养，每8~12h接种传代一次，菌落PCR和测序验证单交换的克隆子，获得发生同源单交换的菌株CICC10073(pKS194GFP-aprEUD)。
（3）温敏型辅助质粒pTISWts-RFP的转化和双交换验证
将质粒pTISWts-RFP电转化到发生同源单交换的菌株CICC10073(pKS194GFP-aprEUD)中，在10μg/mL四环素抗性平板上进行筛选,30℃培养16h左右；将平板置于紫外光下，将无荧光和微弱黄色荧光的克隆子接种到LB液体培养基中，30℃诱导培养8~12h后取样，进行平板划线；再将平板置于紫外光下，挑取显红色荧光的克隆子分别点在20μg/mL卡那霉素抗性LB平板和无抗性LB平板上培养12h，挑取3~5个卡那霉素抗性平板上不长的克隆子(图7A和7B)，进行PCR鉴定和测序鉴定，筛选aprE基因发生无痕敲除的克隆子。
（4）温敏型辅助质粒pTISWts-RFP的丢失
将aprE基因发生无痕敲除的克隆子接种到无抗性的LB液体培养基中，42℃，220rpm培养12~24h，从12h开始每6~8h传代转接一次，同时取样在无抗平板上进行划线，置37℃恒温培养箱培养12h，将平板置于紫外光下，挑取无荧光的克隆子分别点在10μg/mL四环素抗性LB平板和无抗性LB平板上培养12h，挑取3~5个四环素平板上不长的克隆子进行PCR鉴定和测序鉴定。按以上步骤传代2次，温敏型质粒pTISWts-RFP的丢失率100%，最终的菌株命名为CICC10073(ΔaprE)。
在第(2)步得到单交换的克隆子后，不转入温敏型辅助质粒pTISWts-RFP，直接进行高温(42~45℃)连续传代培养20次(约3周)，通过基因组中同源序列自发地同源双交换也可以筛选到无痕敲除的克隆子，而按照本发明中所述的方法转入温敏型质粒pTISWts-RFP，一次诱导培养即筛选到aprE基因无痕敲除的克隆子，高温传代2次温敏型质粒pTISWts-RFP完全丢失，一周之内就可以得到最终菌株CICC10073(ΔaprE)，敲除效率明显提高，且省去大量的PCR验证和平板筛选工作。
实施例4枯草芽胞杆菌WB800N中amyE基因位点敲入地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶apr基因
（1）敲入载体pKS194GFP-amyE-UaprD的构建
以枯草芽胞杆菌WB800N的基因组DNA为模板，用引物F16和R16扩增amyE基因上游同源臂amyE-U，用引物F17和R17扩增amyE基因下游同源臂amyE-D；以地衣芽胞杆菌ATCC14580的基因组DNA为模板，用引物F18和R18扩增碱性蛋白酶apr基因(包括启动子和终止子，记为14580apr)；以pEBKS194-GFP+质粒为模板，以引物F4和R6扩增载体片段，载体片段的扩增产物在37℃经DpnI酶消化过夜后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和两个基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P11和P12进行测序验证，测序成功的载体命名为pKS194GFP-amyE-UaprD；
（2）敲入质粒pKS194GFP-amyE-UaprD转化
提取pKS194GFP-amyE-UaprD质粒，将其电转化到枯草芽胞杆菌WB800N菌株中，涂布到含有20μg/mL卡那霉素抗性的LB固体平板上30℃培养16h，将其置于紫外光下，挑取平板上绿色荧光的克隆子(图6B)，接种到LB液体培养基中于42~45℃培养，每8~12h接种传代一次，菌落PCR和测序验证单交换的克隆子；传代2次，筛选到发生单交换的克隆子，即发生同源单交换的菌株WB800N(pKS194GFP-amyE-UaprD)；
（3）温敏型辅助质粒pTISWts-RFP的转化和双交换验证
将辅助质粒pTISWts-RFP电转化到发生同源单交换的菌株WB800N(pKS194GFP-amyE-UaprD)中，在10μg/mL四环素抗性平板上进行筛选，30℃培养16h左右；将平板置于紫外光下，将无色和微弱黄色荧光的克隆子接种到LB液体培养基中，30℃诱导培养8~12h后取样，进行平板划线；再将平板置于紫外光下，挑取显红色荧光的克隆子分别点在20μg/mL卡那霉素抗性LB平板和无抗性LB平板上培养12h，挑取3~5个卡那霉素抗性平板上不长的克隆子(图7C和7D)，进行PCR鉴定和测序鉴定，筛选地衣芽胞杆菌ATCC14580的aprE基因发生无痕敲入的克隆子。
（4）温敏型质粒pTISWts-RFP的丢失
将aprE基因发生无痕敲除的克隆子接种到无抗性的LB液体培养基中，42℃，220rpm培养12~24h，从12h开始每6~8h传代转接一次，同时取样在无抗平板上进行划线，置37℃恒温培养箱培养12h，将平板置于紫外光下，挑取无荧光的克隆子分别点在10μg/mL四环素抗性LB平板和无抗性LB平板上培养12h，挑取3~5个四环素平板上不长的克隆子进行PCR鉴定和测序鉴定。按以上步骤传代2次，温敏型质粒pTISWts-RFP的丢失率100%，最终的菌株命名为WB800N(14580apr)。
实施例5地衣芽胞杆菌ATCC21415菌株中apr基因的敲除
（1）敲除载体pKS194GFP-21415aprUD的构建
提取地衣芽胞杆菌ATCC21415基因组DNA作为模板，以表1的F19和R19为引物扩增21415apr基因的上游同源臂21415apr-UP，以F20和R20为引物扩增21415apr基因的下游同源臂21415apr-down；以pEBKS194-GFP+质粒为模板，以引物F4和R6扩增载体片段，载体片段的扩增产物在37℃经DpnI酶消化过夜后回收，采用无缝克隆试剂盒的操作说明对载体片段和两个基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选阳性克隆子，用引物P11和P12进行测序验证，测序成功的载体命名为pKS194GFP-21415aprUD。
（2）敲除质粒pKS194GFP-21415aprUD转化
提取pKS194GFP-21415aprUD质粒，将其电转化到地衣芽胞杆菌ATCC21415中，感受态细胞制备和电转化方法参照以下文献:JMicrobiolMeth.1999,34(3):183-191；BiotechnolLett.2011,33:1047–1051；Anal.Biochem.2012,424:127–129；转化的细胞涂布到含有20μg/mL卡那霉素抗性的LB固体平板上30℃培养16h，将其置于紫外光下(图5B)，挑取平板上显绿色荧光的克隆子到LB液体培养基中于42~45℃培养，每8~12h接种传代一次，菌落PCR和测序验证单交换的克隆子。
（3）温敏型辅助质粒pTISWts-RFP的转化和双交换验证
将质粒pTISWts-RFP电转化到发生同源单交换的菌株ATCC21415(pKS194GFP-21415aprUD)中，在10μg/mL四环素抗性平板上进行筛选，30℃培养16h左右；将平板置于紫外光下，将无色和微弱黄色荧光的克隆子接种到LB液体培养基中，30℃诱导培养8~12h后取样，进行平板划线；再将平板置于紫外光下，挑取显红色荧光的克隆子分别点在20μg/mL卡那霉素抗性LB平板和无抗性LB平板上培养12h，挑取3~5个卡那霉素抗性平板上不长的克隆子，进行PCR鉴定和测序鉴定，筛选21415apr基因发生无痕敲除的克隆子。
（4）温敏型辅助质粒pTISWts-RFP的丢失
将21415apr基因发生无痕敲除的克隆子接种到无抗性的LB液体培养基中，42℃，220rpm培养12~24h，从12h开始每6~8h传代转接一次，同时取样在无抗平板上进行划线，置37℃恒温培养箱培养12h，将平板置于紫外光下，挑取无荧光的克隆子分别点在10μg/mL四环素抗性LB平板和无抗性LB平板上培养12h，挑取3~5个四环素平板上不长的克隆子进行PCR鉴定和测序鉴定。按以上步骤传代2次，温敏型质粒pTISWts-RFP的丢失率100%，最终的菌株命名为ATCC21415(Δapr)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCELISTING
<110>武汉康复得生物科技股份有限公司
<120>芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒、方法和试剂盒
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ccgcacgagacatgacaaatgtcatataggaggcatgatgtgtgctactacaaaagactt240
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acgcctttcacatgagct18
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cgtgtctttcttggactacaccctttcattgacag35
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atgaaatcagctcatgtga19
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<213>人工序列
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<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>76
caagcttttgcctcgaagcggtatgctctatggac35
Claims (10)
1.芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，其特征在于，该质粒的基因组中含有：
仅一种正筛选标记的抗性基因，该抗性基因的启动子为双功能启动子；
能在大肠杆菌中复制的复制子；
能在芽胞杆菌中复制的温敏型复制子；
至少一个I-Scel酶切位点；
仅一种显色蛋白基因，该显色蛋白基因的启动子为组成型启动子；
所述双功能启动子是指既能在大肠杆菌中启动基因表达，也能在芽胞杆菌中启动基因表达的启动子。
2.根据权利要求1所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，其特征在于，所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2~13中的任意一条所示。
3.根据权利要求1所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，其特征在于，所述抗性基因为卡那霉素基因Kan、氯霉素基因Cm、四环素基因Tet、红霉素基因Erm或博来霉素基因Shble。
4.根据权利要求1所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，其特征在于，所述显色蛋白基因为绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因，所述红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
5.根据权利要求1所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，其特征在于，所述温敏型复制子的核苷酸序列如SEQIDNO.14~16中的任意一条所示。
6.一种辅助质粒，用于辅助提高权利要求1~5任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒的基因敲除或敲入效率，其特征在于，该质粒的基因组中含有：
仅一种正筛选标记的抗性基因，且该抗性基因与权利要求1~5任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组中的正筛选标记的抗性基因不同，该抗性基因的启动子为双功能启动子；
能在芽胞杆菌中复制的温敏型复制子；
能在大肠杆菌中复制的复制子；
内切酶I-Scel基因；
仅一种显色蛋白基因，且与芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组中的显色蛋白基因不同，该显色蛋白基因的启动子为组成型启动子；
所述双功能启动子是指既能在大肠杆菌中启动基因表达，也能在芽胞杆菌中启动基因表达的启动子；
其中，启动内切酶I-Scel基因表达的启动子是芽胞杆菌中的诱导型启动子。
7.根据权利要求6所述的辅助质粒，其特征在于，所内切酶I-Scel基因的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；辅助温敏型质粒中的显色蛋白基因为绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、bgaB基因、邻苯二酚2,3-双加氧酶显色标志基因xylE或酪氨酸酶-黑色素报告基因melM。
8.根据权利要求6所述的辅助质粒，其特征在于，所述诱导型启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.18~25中任意一条所示。
9.一种芽胞杆菌基因无痕敲除/入方法，其特征在于，当需要敲除目的基因时，包括以下步骤：
（1）分别扩增待敲除基因的上、下游同源臂，通过重叠PCR方法连接在一起，克隆至权利要求1~5任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组，测序验证正确的质粒转化芽胞杆菌，在含有质粒中抗性基因对应的抗生素培养基上42~44℃条件下培养，并设置用于检测质粒中显色基因表达情况的显色条件，筛选出发生同源单交换的菌株；
（2）将权利要求6~8任一所述的辅助质粒转化到发生同源单交换的菌株中，在含有辅助质粒中抗性基因对应的抗生素培养基上42~44℃条件下培养，设置诱导型启动子的诱导条件，以及检测辅助质粒中显色基因表达的显色条件，筛选出目的基因敲除的阳性克隆子进行鉴定；
（3）将成功实现目的基因敲除的阳性克隆子接种到培养液中在42~45℃条件下进行培养，每8~12小时接种传代一次，传代2次后，取样在固体培养基上划线培养，挑取无显色的菌落分别点种在抗性和无抗性培养平板上，在无抗性培养平板上生长且在抗性培养平板上不生长的克隆子即为最终的无痕敲除目的基因的阳性菌株；
当需要敲入目的基因时，只需要将步骤（1）中克隆至芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒基因组的核苷酸序列替换为扩增后的待敲入目的基因及其上、下游同源臂即可，其他步骤相同。
10.一种芽胞杆菌基因敲除/入试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~5任一所述的芽胞杆菌基因无痕敲除/入质粒，以及权利要求6~8任一所述的辅助质粒；该试剂盒应用于枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、短短小芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、嗜热芽胞杆菌或苏云金杆菌中的基因无痕敲除或敲入。
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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