CN105296486A

CN105296486A - 一种启动子文库构建方法和强启动子

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Publication number: CN105296486A
Application number: CN201510799249.8A
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 卢争辉; 周玉玲; 马延和
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2015-11-18
Filing date: 2015-11-18
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-11-18
Also published as: CN105296486B

Abstract

本发明涉及一种启动子文库，包括至少两个启动子，其中一个启动子包括SEQ？ID？NO.3所示的核苷酸序列，另一个启动子包括SEQ？ID？NO.4所示的核苷酸序列。在构建启动子文库时，以整合型载体pDG1730作为出发载体，插入转录终止子T1T2、T0以及报告基因，得到启动子探针载体pDGT-GFP；再选取四个在枯草杆菌中具有强转录强度的启动子作为出发启动子，设计24条在退火后能形成相同黏性末端的寡核苷酸引物，借助寡核苷酸退火,经载体连接转化得到启动子文库。通过测定转化子的相对荧光强度，筛选得到两个比强启动子P43和出发启动子更强的启动子，经筛选得到的启动子可用于增强蛋白的表达。

Description

一种启动子文库构建方法和强启动子

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种启动子文库及其构建方法以及获得的强启动子。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，因其在农业、医疗、食品生物技术和重组蛋白生产方面的贡献而广为人知。枯草芽孢杆菌是GRAS(generallyrecognizedassafe)菌株，无明显的密码子偏好性，可将表达的外源蛋白直接分泌到培养基中，便于后续纯化，且其转录、翻译、蛋白质折叠与分泌机制、遗传操作和大规模发酵等信息已被掌握，因而尤其引人注目。目前大约60％的市售酶由枯草芽孢杆菌生产。然而，枯草芽孢杆菌表达系统对非芽孢属来源的异源蛋白质的表达能力较差，限制了枯草芽孢杆菌表达系统的应用潜力。

为了进一步优化枯草芽孢杆菌表达系统，尤其是进一步提升枯草芽孢杆菌表达系统在生产工业酶制剂方面的应用价值，亟需提高枯草杆菌表达非芽孢属来源的蛋白质的能力。虽然目前已有多种策略成功用于提高外源蛋白质的表达量，如密码子优化、选择合适的RBS序列及构建多拷贝等。由于在原核生物中，基因的表达主要由转录水平控制，因此，通过筛选高效启动子，在转录水平提高外源蛋白的表达量仍然被认为是最有效、简单的方法。经检索发现目前还没有直接在枯草芽孢杆菌细胞中构建启动子文库的文献报道。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明在枯草芽孢杆菌细胞中构建启动子文库，并筛选出比目前常用强启动子如p43等更高效的启动子序列。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种启动子文库，包括至少两个启动子，其中一个启动子包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，另一个启动子包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

进一步地，其中一个启动子的序列为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，另一个启动子的序列为SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

本发明的有益效果是：本发明所述的启动子文库中含有可高效表达的启动子，可以应用于蛋白的表达。

一种启动子文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建枯草芽孢杆菌整合型启动子探针载体：从整合型载体pDG1730出发，在其多克隆位点处插入rrnBT1T2terminators-MCS-lambdaT0terminator，rrnBT1T2terminators-MCS-lambdaT0terminator的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，得到载体pDGT；在pDGT的MCS处插入报告基因GFPmut3，得到整合型启动子探针载体pDGT-GFP，并且在GFPmut3的上游具有两个Ⅱs型限制性内切酶BsmBI的识别序列；

2)以四个在枯草芽孢杆菌中具有强转录强度的启动子为出发启动子，依据启动子的-35区、-10区将每个启动子序列分为三段，根据每一部分的序列设计两条能相互配对的寡核苷酸引物，每个启动子共合成6条寡核苷酸引物，每个启动子3′端引物还包括RBS序列，所述RBS序列为aaaggaggtgataaa，并将区间分界点-35区和-10区所对应的保守核苷酸序列设计为接头，每一区间的寡核苷酸引物退火后形成相同的黏性末端，-35区的接头为-ttg，-10区的接头为-tataat；将二十四条寡核苷酸引物混合后退火，得到组合启动子混合片段，将组合启动子混合片段与BsmBI酶切后的启动子探针载体pDGT-GFP利用连接酶连接，得到酶连产物；酶连产物转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，涂布壮观霉素选择平板，经过夜培养后，得到启动子文库。

采用上述进一步方案的有益效果是：

本发明系首次在枯草芽孢杆菌中构建启动子文库，本发明通过自主构建整合型启动子探针载体，不仅解决了游离型质粒不稳定的缺陷，而且避免了质粒拷贝数对启动子文库表达量的影响。本发明采用寡核苷酸退火的方法进行启动子文库构建，充分利用了原核生物启动子结构的特点(保守的-35区和-10区)，经济节约且高效。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

本发明构建的启动子探针载体，是通过以整合型载体pDG1730(无启动子等表达元件)为出发载体，在pDG1730的多克隆位点处插入rrnBT1T2terminators-MCS-lambdaT0terminator，使整个表达单元处于一个相对独立的遗传环境中，然后根据文献报道，选取GFPmut3作为报告基因插入到MCS中，并且在GFPmut3的上游具有两个Ⅱs型限制性内切酶BsmBI的识别序列，得到启动子探针载体pDGT-GFP，其载体图谱如图1所示，整合型启动子探针载体pDGT-GFP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

上述启动子文库的构建方法中，所述四个出发启动子分别为Pveg1、Pveg2、Pn26和PlepA。

上述启动子文库的构建方法中，所述二十四条寡核苷酸引物的序列如下表所示：

序列号	序列
		SEQ ID NO.5	gatcttgaggaatcatagaatttttaatttaaattttatttg
SEQ ID NO.6	ataaaatttaaattaaaaattctatgattcctcaa
		SEQ ID NO.7	acaaaaatgggctcgtgttgtataat
SEQ ID NO.8	caacacgagcccatttttgtcaa

SEQ ID NO.9	aaatgtagtgaggtggaaaggaggtgataaa
		SEQ ID NO.10	catttttatcacctcctttccacctcactacatttattata
SEQ ID NO.11	gatcatatgatagggaacttttctctttcttgttttacattg
		SEQ ID NO.12	tgtaaaacaagaaagagaaaagttccctatcatat
SEQ ID NO.13	aatctttacaatcctattgatataat
		SEQ ID NO.14	tcaataggattgtaaagattcaa
SEQ ID NO.15	ctaagctagtgtatttaaaggaggtgataaa
		SEQ ID NO.16	catttttatcacctcctttaaatacactagcttagattata
SEQ ID NO.17	gatcttgaggaatcatagaattttgtcaaaataattttattg
		SEQ ID NO.18	taaaattattttgacaaaattctatgattcctcaa
SEQ ID NO.19	gatcttgaggaatcatagaattttgacttaaaaatttcagttg
		SEQ ID NO.20	ctgaaatttttaagtcaaaattctatgattcctcaa
SEQ ID NO.21	attctcatagtttgaaaaaggaggtgataaa
		SEQ ID NO.22	catttttatcacctcctttttcaaactatgagaatattata
SEQ ID NO.23	attgcaagcttgcaaaaaaggaggtgataaa
		SEQ ID NO.24	catttttatcacctccttttttgcaagcttgcaatattata
SEQ ID NO.25	cttaatcctacaattcttgatataat
		SEQ ID NO.26	tcaagaattgtaggattaagcaa
SEQ ID NO.27	acaacgtcttattaacgttgatataat
		SEQ ID NO.28	tcaacgttaataagacgttgtcaa

一种强启动子的筛选方法，包括以下步骤：以枯草芽孢杆菌中的强启动子p43为参照启动子，在上述的启动子文库中筛选荧光强度比以p43为启动子的转化子高的转化子；筛选得到的转化子经测序获得序列，具有不同启动子序列的转化子经培养后，分别测定筛选的转化子以及以p43为启动子的转化子在对数生长期与稳定生长期的相对荧光强度进行进一步验证。

通过上述方法，可以快速获得比p43启动子更高效的启动子。

一种强启动子，包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，优选地，所述强启动子的序列为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。上述序列可以用于蛋白表达，尤其是枯草芽孢杆菌中外源蛋白的高效表达，本发明对于高效表达的方式没有具体限制，例如，在进行高效表达时可以以游离型表达载体的形式也可以整合到染色体上等等。

一种强启动子，包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，优选地，所述强启动子的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。上述序列可以用于蛋白表达，尤其是枯草芽孢杆菌中外源蛋白的高效表达，本发明对于高效表达的方式没有具体限制，例如，在进行高效表达时可以以游离型表达载体的形式也可以整合到染色体上等等。

附图说明

图1为本发明所述启动子探针载体pDGT-GFP的图谱；

图2为本发明所述的启动子文库构建策略的示意图；

图3为本发明所述的强启动子筛选的结果，纵坐标代表相对荧光强度，横坐标代表不同的启动子，其中“43”代表P43；“1-1-1”代表Pveg1；“2-2-2”代表Pveg2；“3-3-3”代表Pn26；“4-4-4”代表PlepA；“4-1-3”、“4-1-1”、“2-3-3”、“1-2-3”、“3-3-2”、“1-2-2”、“3-2-3”、“2-2-3”、“3-4-1”、“3-3-1”、“1-3-1”、“2-4-2”分别代表从启动子文库中筛选得到的转化子；“PS”代表启动子强度。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明以无启动子等表达元件的整合型载体pDG1730为出发载体，在pDG1730的多克隆位点处插入rrnBT1T2terminators-MCS-lambdaT0terminator，得到载体pDGT，随后在pDGT的多克隆位点处插入报告基因GFPmut3，使报告基因的表达单元处于一个相对独立的遗传环境中，不受上、下游遗传背景的影响，得到启动子探针载体pDGT-GFP。然后查阅文献资料，选择4个在枯草芽孢杆菌中具有较高强度的启动子作为出发启动子，以启动子保守的-35区和-10区为节点将每个启动子分为三段，通过寡核苷酸退火方法使不同启动子之间进行随机组合，得到启动子文库。最后借助蓝光仪和荧光强度分析法筛选出两个强启动子。

实施例1构建启动子探针载体

整合型载体pDG1730为本领域的常用载体，其相关信息可以参照文献Guérout-FleuryAM,FrandsenN,StragierP.PlasmidsforectopicintegrationinBacillussubtilis.Gene,1996,180(1):P.57-61.本实施例中使用的整合型载体pDG1730保存在湖北大学工业生物技术湖北省重点实验室，可以为公众获得。

GFPmut3基因的序列信息可以参照文献Cormack,B.P.,R.H.Valdivia,andS.Falkow,FACS-optimizedmutantsofthegreenfluorescentprotein(GFP).Gene,1996.173(1):p.33-38.

1、选择出发载体

以无启动子等表达元件的整合型载体为出发载体，因为pDG1730是整合型载体，它将目的基因(启动子与GFP)整合到宿主染色体中，随染色体一同复制，所以它的拷贝数始终为1，且能稳定存在，不仅解决了游离型质粒不稳定的缺陷，而且避免质粒拷贝数不同对文库报告基因表达量的影响。

2、构建质粒pDGT

首先用BamHI和EcoRI酶切质粒pDG1730，0.7％琼脂糖凝胶回收后，与大小为431bp的片段rrnBT1T2terminators-MCS-lambdaT0terminator(经BglII和EcoRI酶切后回收的DNA片段))于16℃酶连3h，转化大肠杆菌DH5α，得到含有质粒pDGT的转化子。

3、构建质粒pDGT-GFP

在pDGT的rrnBT1T2terminators-MCS-lambdaT0terminator区域中的多克隆位点处(MCS)插入报告基因GFPmut3，选取的酶切位点为BsmBI和HindIII，将PCR扩增的GFPmut3与酶切回收后的载体pDGT酶连，转化大肠杆菌DH5α，得到启动子探针载体pDGT-GFP，其质粒图谱如图1所示，构建的启动子探针载体pDGT-GFP使报告基因GFPmut3处于一个独立的遗传背景中，可以有效避免前后遗传背景对文库表征的影响。

实施例2启动子文库的构建

1、引物的设计以及合成

选择四个已经报道的相对比较强的启动子Pveg1、Pveg2、Pn26和PlepA作为出发启动子。

启动子Pveg1的序列如SEQIDNO.29所示，为ttgaggaatcatagaattttgtcaaaataattttattgacaacgtcttattaacgttgatataatattgcaagcttgcaaaa。

启动子Pveg2的序列如SEQIDNO.30所示，为ttgaggaatcatagaatttttaatttaaattttatttgacaaaaatgggctcgtgttgtataataaatgtagtgaggtgg。

启动子Pn26的序列如SEQIDNO.31所示，为ttgaggaatcatagaattttgacttaaaaatttcagttgcttaatcctacaattcttgatataatattctcatagtttgaa。

启动子PlepA的序列如SEQIDNO.32所示，为atatgatagggaacttttctctttcttgttttacattgaatctttacaatcctattgatataatctaagctagtgtattta。

依据文库构建策略(如图2所示)，以启动子保守序列-35区和-10位为节点，将每个启动子分为三个区间，依据启动子三个区间的序列信息，每个区间对应两条互补配对的寡核苷酸引物，故每个启动子对应6条人工合成的寡核苷酸引物，并将区间分界点-35和-10所对应核苷酸设计为接头，每一区间的寡核苷酸引物退火后形成相同的黏性末端(-35区为-ttg，-10区为-tataat)。同时，RBS序列(aaaggaggtgataaa)置于启动子3′端引物上，且在启动子的5′和3′端形成与启动子探针载体酶切后形成的黏性末端互补的接头(接头位于序列的两端)。

引物在金斯瑞生物科技有限公司合成，具体序列信息如表1所示。RBS序列(aaaggaggtgataaa)置于启动子3′端引物上。

表1引物序列

序列号	引物名称	引物序列
			SEQ ID NO.5	Pveg_2-1	gatcttgaggaatcatagaatttttaatttaaattttatttg
SEQ ID NO.6	Pveg_2-2	ataaaatttaaattaaaaattctatgattcctcaa
			SEQ ID NO.7	Pveg_2-3	acaaaaatgggctcgtgttgtataat
SEQ ID NO.8	Pveg_2-4	caacacgagcccatttttgtcaa
			SEQ ID NO.9	Pveg_2-5	aaatgtagtgaggtggaaaggaggtgataaa
SEQ ID NO.10	Pveg_2-6	catttttatcacctcctttccacctcactacatttattata
			SEQ ID NO.11	PlepA-1	gatcatatgatagggaacttttctctttcttgttttacattg
SEQ ID NO.12	PlepA-2	tgtaaaacaagaaagagaaaagttccctatcatat
			SEQ ID NO.13	PlepA-3	aatctttacaatcctattgatataat
SEQ ID NO.14	PlepA-4	tcaataggattgtaaagattcaa
			SEQ ID NO.15	PlepA-5	ctaagctagtgtatttaaaggaggtgataaa

SEQ ID NO.16	PlepA-6	catttttatcacctcctttaaatacactagcttagattata
			SEQ ID NO.17	Pveg-1	gatcttgaggaatcatagaattttgtcaaaataattttattg
SEQ ID NO.18	Pveg-2	taaaattattttgacaaaattctatgattcctcaa
			SEQ ID NO.19	Pn26-1	gatcttgaggaatcatagaattttgacttaaaaatttcagttg
SEQ ID NO.20	Pn26-2	ctgaaatttttaagtcaaaattctatgattcctcaa
			SEQ ID NO.21	Pn26-5	attctcatagtttgaaaaaggaggtgataaa
SEQ ID NO.22	Pn26-6	catttttatcacctcctttttcaaactatgagaatattata
			SEQ ID NO.23	Pveg-5	attgcaagcttgcaaaaaaggaggtgataaa
SEQ ID NO.24	Pveg-6	catttttatcacctccttttttgcaagcttgcaatattata
			SEQ ID NO.25	Pn26-3	cttaatcctacaattcttgatataat
SEQ ID NO.26	Pn26-4	tcaagaattgtaggattaagcaa
			SEQ ID NO.27	Pveg-3	acaacgtcttattaacgttgatataat
SEQ ID NO.28	Pveg-4	tcaacgttaataagacgttgtcaa

将上述表1中每条寡核苷酸引物均稀释到100mM，各取1μL，以LAbuffer(试剂购自Takara公司)作为缓冲液，混合均匀后，进行退火反应,得到组合启动子混合片段。

退火反应条件如下：

其中，“-1℃/cycle”指每个循环降低1℃。

2、酶连转化

采用DNALigationKitVer.2.1试剂盒进行酶连，所述试剂盒购自购自Takara公司。反应体系如下：

注：solutionⅠ为DNALigationKitVer.2.1试剂盒自带的溶液，其中已经含有T4DNA连接酶与相应的缓冲液。

反应步骤：取6μL步骤1的退火后的组合启动子混合片段与2μL实施例1中的酶切后的启动子探针载体pDGT-GFP于16℃条件下酶连3h，得到酶连产物。

酶连产物直接转化枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞。转化体系：1μL酶连产物添加到100μLSCK6感受态细胞中，感受态制备的方法参考文献ZhangXZ,ZhangYHP.Simple,fastandhigh‐efficiencytransformationsystemfordirectedevolutionofcellulaseinBacillussubtilis.Microbialbiotechnology,2011,4(1):P.98-105.转化混合物于37℃振荡培养90min，涂布到含有壮观霉素的LB培养基上，于37℃静置培养过夜。

实施例3筛选启动子文库中的强启动子

以目前枯草芽孢杆菌表达系统中常用的强启动子p43(WangPZ,DoiRH.Overlappingpromoterstranscribedbybacillussubtilissigma55andsigma37RNApolymeraseholoenzymesduringgrowthandstationaryphases[J].JournalofBiologicalChemistry,1984,259(13):8619-8625.)作为参照启动子，直接把长有转化子的平板置于蓝光仪里面，可以看到有荧光的转化子，通过蓝光仪筛选荧光强度比p43强的转化子，通过菌落PCR扩增筛选到的转化子的启动子区，送公司测序。

PCR扩增的反应体系：

10×Pyrobest buffer	1μL
		dNTP(2.5mM)	1μL
正向引物(10μM)	0.5μL
		反向引物(10μM)	0.5μL
Pyrobest	0.2μL
		转化子的菌液	0.5μL
ddH2O	补足至10μL

其中，正向引物为AmyE_F，序列如SEQIDNO.33所示，为cgcgatttccaatgaggttaagagt；反向引物为GFP_R，序列如SEQIDNO.34所示，为aattaagcccaagctttcacttgtacagctcgtccatgc。

其中，10×Pyrobestbuffer、Pyrobest、dNTP(2.5mM)均购自Takara公司(CodeNo.:R005A)。

空白对照：将以上体系中的转化子菌液模板换成未转化的枯草芽孢杆菌SCK6，其他不变。

PCR扩增反应条件：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min20s，25个循环；72℃，7min；12℃，保温。

测序结果显示共得到12个杂合启动子，然后用96孔荧光板分析初筛到的转化子(12个杂合启动子与4个出发启动子)与参照启动子p43。

具体分析初筛到的转化子的步骤为：

1)配制LB培养基，LB培养基组成成分为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L；

2)将初筛的转化子在LB培养基中培养过夜，得到转化子菌液；

3)按1:500(v/v)的比例分别将0.4μL转化子菌液分别接种于含有200μLLB的96孔荧光板中，每个转化子设置3个平行，将荧光板在37℃振荡培养，每隔1h用荧光酶标仪测OD600和荧光值，荧光仪激发波长为488nm，发射波长为511nm；

4)分别计算每个转化子在对数生长期(培养4h)与稳定期(培养12h)的相对荧光强度(荧光值/OD600)，并参照文献(Alper,H.,etal.,Tuninggeneticcontrolthroughpromoterengineering.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2005.102(36):p.12678-12683.)计算每个启动子的强度且作图分析，分析结果如图3所示。结果表明，筛选到的两个重组启动子P1-3-1和P2-4-2，其转录强度均高于四个出发启动子，且在稳定期的相对荧光强度分别是启动子P43的11.7倍和12倍，更有效地促进外源蛋白的表达量。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种启动子文库，其特征在于，包括至少两个启动子，其中一个启动子包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，另一个启动子包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

2.一种启动子文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)以四个在枯草芽孢杆菌中具有强转录强度的启动子为出发启动子，依据启动子的-35区、-10区将每个启动子序列分为三段，根据每一部分的序列设计两条能相互配对的寡核苷酸引物，每个启动子共合成6条寡核苷酸引物，启动子序列3′端引物还包括RBS序列，所述RBS序列为aaaggaggtgataaa，并将区间分界点-35区和-10区所对应的保守核苷酸序列设计为接头，每一区间的寡核苷酸引物退火后形成相同的黏性末端，-35区的接头为-ttg，-10区的接头为-tataat；将二十四条寡核苷酸引物混合后退火，得到组合启动子混合片段，组合启动子混合片段与BsmBI酶切后的启动子探针载体pDGT-GFP利用连接酶连接，得到酶连产物；酶连产物转化枯草芽孢杆菌感受态细胞，涂布壮观霉素选择平板，得到启动子文库。

3.根据权利要求2所述一种启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤1)中，整合型启动子探针载体pDGT-GFP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

4.根据权利要求2所述一种启动子文库的构建方法，其特征在于，所述四个出发启动子分别为Pveg1、Pveg2、Pn26和PlepA。

5.根据权利要求2所述一种启动子文库的构建方法，其特征在于，所述二十四条寡核苷酸引物的序列如下表所示：

序列号序列 SEQ ID NO.5 gatcttgaggaatcatagaatttttaatttaaattttatttg SEQ ID NO.6 ataaaatttaaattaaaaattctatgattcctcaa SEQ ID NO.7 acaaaaatgggctcgtgttgtataat SEQ ID NO.8 caacacgagcccatttttgtcaa SEQ ID NO.9 aaatgtagtgaggtggaaaggaggtgataaa SEQ ID NO.10 catttttatcacctcctttccacctcactacatttattata SEQ ID NO.11 gatcatatgatagggaacttttctctttcttgttttacattg SEQ ID NO.12 tgtaaaacaagaaagagaaaagttccctatcatat SEQ ID NO.13 aatctttacaatcctattgatataat SEQ ID NO.14 tcaataggattgtaaagattcaa SEQ ID NO.15 ctaagctagtgtatttaaaggaggtgataaa SEQ ID NO.16 catttttatcacctcctttaaatacactagcttagattata SEQ ID NO.17 gatcttgaggaatcatagaattttgtcaaaataattttattg SEQ ID NO.18 taaaattattttgacaaaattctatgattcctcaa SEQ ID NO.19 gatcttgaggaatcatagaattttgacttaaaaatttcagttg SEQ ID NO.20 ctgaaatttttaagtcaaaattctatgattcctcaa SEQ ID NO.21 attctcatagtttgaaaaaggaggtgataaa SEQ ID NO.22 catttttatcacctcctttttcaaactatgagaatattata SEQ ID NO.23 attgcaagcttgcaaaaaaggaggtgataaa SEQ ID NO.24 catttttatcacctccttttttgcaagcttgcaatattata

SEQ ID NO.25 cttaatcctacaattcttgatataat SEQ ID NO.26 tcaagaattgtaggattaagcaa SEQ ID NO.27 acaacgtcttattaacgttgatataat SEQ ID NO.28 tcaacgttaataagacgttgtcaa

。

6.一种强启动子的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：以枯草芽孢杆菌中的强启动子p43为参照启动子，在权利要求2至5任一项得到所述的启动子文库中筛选荧光强度比以p43为启动子的转化子高的转化子；筛选得到的转化子经测序获得序列，经培养后，分别测定筛选的转化子以及以p43为启动子的转化子在对数生长期与稳定生长期的相对荧光强度进行进一步验证。

7.一种强启动子，其特征在于，包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。

8.一种权利要求7所述的强启动子在蛋白表达中的应用。

9.一种强启动子，其特征在于，包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。

10.一种权利要求9所述的强启动子在蛋白表达中的应用。