CN107699560A - 针对淀粉酶bla的启动子文库及强启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种启动子文库，用于在枯草芽胞杆菌中高效表达淀粉酶BLA，所述文库的探针载体为整合型载体，以避免质粒拷贝数对文库表征的影响，在BLA表达框上下游均有强转录终止子，避免上下游遗传元件对BLA表达的影响，所述文库的构建方法包括寡核苷酸退火，IIs型限制性酶和连接酶同时酶切/酶连。为了提高探针载体整合效率及降低内源性淀粉酶AmyE的背景，在启动子文库转化枯草芽孢杆菌时，使用CRISPR/cas9系统在整合位点处引入DNA双链断裂。转化后涂布于底物平板，对水解圈大的转化子通过96孔板复筛，复筛后较强的转化子再通过摇瓶进一步复筛。经由上述步骤，得到比P43表达BLA更高效的启动子22个，其中7个杂合启动子的强度高于所有出发启动子。

Description

针对淀粉酶BLA的启动子文库及强启动子
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种针对目的基因的启动子文库及其构建方法以及获得的强启动子。
背景技术
α-淀粉酶是应用最早、应用范围最广、需求最大的工业酶制剂之一，在国内外酶制剂市场上占有重要地位。地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)来源的α-淀粉酶BLA属于耐高温淀粉酶，最适温度在90℃左右，应用于淀粉液化等工业中，及用于纺织退浆、洗涤等行业。
枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性、杆状土壤细菌。枯草芽孢杆菌具有很强的分泌能力，能将外源蛋白直接分泌到培养基中，不仅有效避免蛋白形成包涵体，且能够极大简化后续纯化步骤，降低生产成本。枯草芽孢杆菌不产脂多糖等内毒素，属于GRAS菌株，可用于生产食品、医药等相关蛋白及代谢产物。此外，目前已有很成熟的枯草芽孢杆菌遗传操作手段和大规模发酵技术。由于上述优点，枯草杆菌已成为最常用的工业酶表达宿主之一，由枯草芽孢杆菌生产的酶蛋白约占整个酶制剂市场份额的60％左右。因此，提高外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量，是进一步开发枯草芽孢杆菌细胞工厂，拓展枯草芽孢杆菌应用范围的关键问题。
目前有多种策略可用于提高外源蛋白的表达量，基因水平、转录水平、翻译水平及翻译后修饰等都可作为改造的靶点，如提高基因拷贝数、核糖体工程、密码子优化等。对于原核生物来说，筛选强启动子以提高目的基因转录本数量，是最简单、有效的方式。检索现有技术发现，已有在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等构建启动子文库筛选高效启动子的报道，但还没有直接在枯草杆菌中构建启动子文库的文献报道。申请人前期研究中构建了以GFP为报告基因的启动子文库，然而我们将筛选到的启动子用于表达目的基因时，基因的表达量很低，且表达量与启动子强度不成比例，暗示启动子具有一定的基因特异性，即以A基因为报告基因筛选到的强启动子用于表达B基因时，往往很难保证高效的表达量。因此，要使目的基因过表达，需要针对目的基因构建一个特定的启动子文库，继而从中筛选到高表达目的基因的启动子序列。
发明内容
为了实现α-淀粉酶BLA在枯草芽孢杆菌中的高效表达，本发明通过在枯草芽孢杆菌中构建针对BLA的特定启动子文库，筛选能高效表达BLA的强启动子。因此，本发明的目的在于提供一种针对α-淀粉酶BLA的启动子文库及其构建方法和应用。
为了实现本发明的目的，发明人创造性地采用寡核苷酸退火和金门克隆方法，通过出发启动子间的随机组合，获得BLA基因的组合启动子文库，并筛选到比P43启动子更有效地表达BLA的启动子序列。
在本发明的第一个方面，提供一种针对淀粉酶BLA的启动子文库，所述的启动子文库包括SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ IDNO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子。
需要说明的是，本发明中所述的“启动子”是指一段能够结合RNA聚合酶的核酸序列，能够将位于其下游的开放阅读框转录为mRNA。
进一步优选地，所述的启动子文库由SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子组成。
本发明所述针对淀粉酶BLA的启动子文库，其中的SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子具有依次增强启动目的基因表达的强度。各启动子启动目的基因表达的强度呈现梯度分布，用于在不同强度下指导目的基因表达。启动子文库的获得可保证对所调控的目的基因表达进行梯度调节，实施可控基因扰动和系统分析。
在本发明的第二个方面，提供一种载体，所述的载体含有SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48或SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列，作为启动子元件。
在本发明的第三个方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的载体；或者，所述的宿主细胞的基因组中整合有SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48或SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列的核酸。
在本发明的第四个方面，提供一种针对淀粉酶BLA的强启动子，所述的强启动子选自如下的一种：SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ IDNO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子。
在本发明的第五个方面，提供一种启动子文库的用途，即上述的启动子文库在提供不同强度类型启动子中的应用，所述的启动子可操作性地与目的基因连接，能不同程度的促进高表达淀粉酶BLA基因。
需要说明的是，所述的“可操作地与目的基因连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子的引导，从而，启动子被“可操作地连接”到该核酸序列上。另外，所述的“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。本发明对合适的目的基因限定为淀粉酶BLA基因。
在本发明的第六个方面，提供一种针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，该方法包括如下步骤：
1)选择6个已表征的枯草杆菌启动子序列作为出发启动子，以其-35区的保守序列ttg和-10区的保守序列tawwt为节点，将启动子分为三个区域，每个区域设计一对互补的寡核苷酸序列，即每个启动子设计6条寡核苷酸引物，退火后得到对应的DNA双链片段，不同启动子对应的片段均含有相同的粘性末端，将退火后的片段混合后，加入连接酶，不同启动子的三个区域可通过-35区和-10区随机连接，得到组合启动子片段；
2)将步骤1)得到的启动子片段与淀粉酶BLA探针载体酶连，得到针对BLA的组合启动子载体；
3)建立枯草芽孢杆菌CRISPR/cas9系统，构建cas9蛋白表达载体和靶向整合位点AmyE的sgRNA载体；
4)将步骤3)得到的cas9蛋白表达载体转化枯草芽孢杆菌，转化子制备感受态，同时添加IPTG诱导cas9蛋白的表达，使cas9蛋白在整合位点AmyE引入DNA双链断裂，然后将步骤2)得到的组合启动子载体和步骤3)得到的sgRNA载体同时转化感受态，涂布于含有抗生素选择的平板，得到特定针对淀粉酶BLA的启动子文库；
步骤1)中，所述的出发启动子是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的启动子；所述的寡核苷酸序列为SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示核苷酸序列。
步骤1)中设计的寡核苷酸序列，其核苷酸序列为下表：
进一步优选地，如上所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其中步骤2)中所述的淀粉酶BLA探针载体为整合型载体pDGT-BLA，或其他避免游离性质粒拷贝数对文库表征影响的整合型载体。
进一步优选地，如上所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其中步骤3)所述的cas9蛋白表达载体是将cas9蛋白连接到pHT01载体上而得，所述的sgRNA载体是合成p242-BsmBI/BsmBI-sgRNA片段，并连接到pHY300PLK载体上而得。
再进一步优选地，如上所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其中步骤3)所述的sgRNA载体上连接有靶向AmyE的靶向核苷酸序列，所述的靶向AmyE的核苷酸序列为GCAGTTACGGCAGTCAATTT。
与现有技术相比，本发明提供的启动子文库及其构建方法以及获得的强启动子具有如下优点和进步：
(1)本发明通过大量筛选获得了一系列杂合启动子，它们启动目的基因表达的强度呈现梯度分布，从而建立了针对淀粉酶BLA的启动子文库；
(2)本发明通过构建启动子文库，将“开量”式微调基因表达成为可能，在代谢分析和改造中，突破了原来只能通过基因敲除和过表达两种非“开”即“关”的手段来实现对细胞基因型的扰动，即可通过对目标基因表达进行梯度式的精确微调来分析和控制其对表型和代谢流分布的影响。
(3)本发明在构建启动子文库的时候引入CRISPR/cas9系统，靶向整合位点AmyE，既避免了枯草芽孢杆菌内源淀粉酶的干扰，也提高了文库构建的效率。
(4)本发明得到的强启动子相比目前枯草芽孢杆菌表达系统中常用的强启动子p43，其在表达淀粉酶BLA方面更高效。
附图说明
图1为启动子探针载体pDGT-BLA的图谱；
图2为Cas9蛋白表达载体pHT01-cas9的图谱；
图3为sgRNA表达载体pHY300PLK-P242-AmyE-sgRNA的图谱；
图4本发明文库构建和强启动子筛选流程图；
图5为本发明所述的强启动子筛选的结果，纵坐标代表酶活，横坐标代表不同的启动子，“5-2-5”、“3-3-5”、“1-1-5”、“2-3-5”、“1-2-5”、“3-2-3”、“1-6-6”分别代表从启动子文库中筛选得到的针对BLA的强启动子。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1构建启动子探针载体
整合型载体pDG1730为本领域的常用载体，其相关信息可以参照文献Guérout-Fleury AM,Frandsen N,Stragier P.Plasmids for ectopic integration in Bacillussubtilis.Gene,1996,180(1):P.57-61。本实施例中使用的整合型载体pDGT为本申请人构建，可参见专利CN 105296486A。地衣芽孢杆菌淀粉酶BLA在NCBI中的登录号为WP_003179447.1。将BLA克隆到pDGT载体上，得到探针载体pDGT-BLA。
具体方法如下：以地衣芽孢杆菌基因组为模板，通过引物对(bla-F1:Cgggatccgagacgatgaaacaacaaaaacggctttacg和bla-R1:CCCAAGCTTCTATCTTTGAACATAAATTGAAACCGACC)扩增，PCR反应体系：10×Pfu buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，2μl；正向引物(10μM)，2μl；反向引物(10μM)，2μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH2O至50μl。PCR扩增程序：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，90s，30个循环；72℃，5min；4℃，∞。PCR片段琼脂糖凝胶回收(Gene Mark公司试剂盒，下同)，与质粒pDGT分别使用BamH I和Hind III酶切，酶切体系为：Hind IIIⅠ，0.5μl；BamHⅠ，0.5μl；10×buffer，5μl；DNA片段，30μl(约3μg)。37℃处理2h后，片段使用溶液回收，载体使用琼脂糖凝胶回收。回收后的片段和载体使用T4DNA ligase酶连，酶连体系为：酶切片段与酶切载体摩尔比为1：3；10×T4DNA ligasebuffer，1μl；T4DNA ligase，0.5μl；加ddH2O至10μl,25℃反应1.5h。酶连产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和测序验证后得到启动子探针载体pDGT-BLA，其质粒图谱如图1所示，构建的启动子探针载体pDGT-BLA使报告基因BLA前后均有强转录终止子，使其处于一个独立的遗传背景中，可以有效避免前后遗传背景对文库表征的影响，且载体pDGT-BLA是整合型载体，整合位点为AmyE，可有效避免游离性载体拷贝数变化对文库表征的影响。
实施例2启动子文库的构建
启动子文库构建策略的示意图参见图4。选择六个已经报道的相对比较强的启动子Pveg1、Pveg2、Pn26，PlepA，PtrnQ和PserA作为出发启动子(SEQ ID 1-6)，由于原核生物启动子具有保守的-35区和-10区，以-35区和-10区为节点将每个启动子分为上中下游三个区域，每个区域设计一对互补的磷酸化寡核苷酸引物，即每个启动子序列设计6条，共36条磷酸化的寡核苷酸序列(SEQ ID 7-42)，互补的引物退火后，不同启动子的同一区域具有相同的黏性末端(ttg和tawwt)，可相互随机组合，产生启动子组合文库。不同启动子使用同一RBS序列(aaaggaggtgataaa)。
将合成的寡核苷酸引物稀释到100mM，各取4.5μL，以LA buffer(试剂购自Takara公司)作为缓冲液，混合均匀后，进行退火反应,得到组合启动子混合片段。
退火反应条件如下：
其中，“-1℃/cycle”指每个循环降低1℃。将上述退火后的寡核苷酸混合，与探针载体进行反应，反应体系：启动子片段6μl，探针载体15μl，Taq DNA ligase buffer 3μl，Taq DNA ligase 3μl,BsmB I 3μl。在50℃反应3h。
实施例3CRISPR/cas9系统的构建
构建Cas9蛋白表达载体pHT01-cas9和sgRNA表达载体pHY300PLK-P242-AmyE-sgRNA(载体图谱分别参见图2和图3)。
1)cas9基因用DNA Polymerase进行PCR，模板为将Cas9基因克隆至pHT01载体得到pHT01-cas9。扩增cas9的引物为：cas9-F：CGCGGATCCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCA，cas9-R：gctctagaTCCTGATGAGCCTGAGCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTC，PCR反应体系：2×PrimeSTAR Mix，25μl；正向引物(10mΜ)，2.5μl；反向引物(10mΜ)，2.5μl；模板，0.5μl；加ddH2O至50μl。扩增条件为：98℃，10s；55℃，5s；72℃，20s；28x；72℃，5min；4℃，∞。将cas9片段和pHT01载体用Xba I和BamH I酶切。酶切体系为：XbaⅠ，0.5μl；BamHⅠ，1.5μl；10×buffer，5μl；PCR回收产物，30μl。37℃处理2h后，用1％的琼脂糖凝胶回收。将酶切回收后的cas9片段和pHT01载体用T4连接酶进行酶连，酶连体系为：10×T4DNA ligase buffer，1μl；T4DNAligase，0.5μl；酶切片段与酶切载体摩尔比1:3；加ddH2O至10μl。酶连产物转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证阳性克隆，测序验证后，得到重组载体pHT01-cas9。
2)人工合成(上海生工生物工程股份有限公司)基因序列P242-BsmBI/BsmB I-sgRNA：
aagcttgctctagatatttttttgccaaagctgtaattgaggaatcatagaatttttaatttaaattttatttgaatctttacaatcctattgatataataaatgtagtgaggtggaggagacgcgcgtctccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttcttcagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttggactagtccgggatcccgaattc
该基因序列包括P242启动子，两个BsmBⅠ酶切位点和sgRNA骨架。对合成的基因序列和pHY300PLK载体用EcoRⅠ和Hind Ⅲ进行酶切处理，酶切体系为：EcoRⅠ，0.5μl；Hind Ⅲ，1.5μl；10×buffer，5μl；合成序列，30μl。37℃处理2h后，用1％的琼脂糖凝胶回收获得酶切产物。将酶切后的载体和片段酶连，酶连体系为：酶切载体与酶切片段的摩尔比为1:3；10×T4DNA ligase buffer，1μl；T4DNA ligase，0.5μl；加ddH2O至10μl，25℃反应2h。酶连产物转化大肠杆菌DH5α菌株，转化子将菌落PCR、测序验证后，得到重组载体pHY-P242-BsmBI/BsmBI-sgRNA。设计靶向AmyE的向导RNA序列(GCAGTTACGGCAGTCAATTT)，根据向导RNA序列合成两条互补的引物，将两条引物退火，同时使用BsmBI酶切载体pHY-P43-BsmBI/BsmBI-sgRNA。酶切体系为：BsmBⅠ，0.5μl；10×buffer，5μl；pHY-P242-BsmBI/BsmBI-sgRNA质粒，30μl，加ddH2O至50μl。55℃处理2h后，用1％的琼脂糖凝胶回收获得酶切载体。将退火后的引物与酶切后的pHY-P242-BsmBI/BsmBI-sgRNA质粒酶连，转化大肠杆菌，验证后得到靶向载体：pHY300PLK-P242-AmyE-sgRNA。
实施例4启动子文库的转化
制备枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞。感受态制备的方法参考文献(李信志,卢争辉,周玉玲,等.枯草芽孢杆菌SCK6超级感受态的制备和转化条件优化[J].生物工程学报,2017,33(4):692-698)。pHT01-cas9转化SCK6感受态细胞，得到SCK6/pHT01-cas9，按上述方法制备该细胞的感受态，在制备感受态时，过夜培养物转接后，加入0.5mM IPTG诱导cas9蛋白的表达，转化体系：10μL实施例2中的酶连产物和200ng左右的pHY300PLK-P242-AmyE-sgRNA添加到300μL感受态细胞中，转化混合物于37℃振荡培养90min，涂布到含有壮观霉素的LB培养基上，于37℃静置培养过夜，得到启动子文库。
实施例5筛选启动子文库中的强启动子
以目前枯草芽孢杆菌表达系统中常用的强启动子p43(Wang P Z,Doi RH.Overlapping promoters transcribed by bacillus subtilis sigma 55and sigma37RNA polymerase holoenzymes during growth and stationary phases[J].Journalof Biological Chemistry,1984,259(13):8619-8625.)作为参照启动子，将转化子点种到可溶性淀粉底物平板上(LB培养基中加入1％的可溶性淀粉和0.01％的台盼蓝染料)，观察水解圈大小，将水解圈较大的克隆转接到96孔板中，震荡培养过夜，离心后，取适量上清液稀释，加入底物反应30min，再通过DNS法测量还原糖的量，将活性高的克隆挑选出来，通过菌落PCR扩增筛选到的转化子的启动子区，送公司测序。
PCR扩增的反应体系：
10×Pyrobest buffer 1μL
dNTP(2.5mM) 1μL
正向引物(10μM) 0.5μL
反向引物(10μM) 0.5μL
Pyrobest 0.2μL
转化子的菌液 0.5μL
ddH2O 补足至10μL
其中，正向引物为AmyE_F，为CGCGATTTCCAATGAGGTTAAGAGT；反向引物为BLA_2R，为CGACTTCAACCGCGGTTACATCTTC。
其中，10×Pyrobest buffer、Pyrobest、dNTP(2.5mM)均购自Takara公司(CodeNo.:R005A)。
空白对照：将以上体系中的转化子菌液模板换成未转化的枯草芽孢杆菌SCK6，其他不变。
PCR扩增反应条件：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，80s，25个循环；72℃，7min；12℃，保温。
测序结果显示共得到22个杂合启动子，将不同杂合启动子菌株接种于含有1ml LB培养基的10ml摇菌管中，过夜培养，离心后，取上清液，适当稀释后，以1％可溶性淀粉(50mMTris-HCl，pH 7.0)作为底物，测量淀粉酶活性，强启动子筛选的结果参见图5，得到比P43表达BLA更高效的启动子22个，其中7个杂合启动子(SEQ ID NO.43-49)强度显著高于所有出发启动子(SEQ ID NO.1-6)，前者的强度是后者的3-5倍。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 针对淀粉酶BLA的启动子文库及强启动子
<160> 49
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
ttgaggaatc atagaatttt gtcaaaataa ttttattgac aacgtcttat taacgttgat 60
ataatattgc aagcttgcaa aa 82
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
ttgaggaatc atagaatttt taatttaaat tttatttgac aaaaatgggc tcgtgttgta 60
taataaatgt agtgaggtgg 80
<210> 3
<211> 81
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 3
ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttgc ttaatcctac aattcttgat 60
ataatattct catagtttga a 81
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 4
atatgatagg gaacttttct ctttcttgtt ttacattgaa tctttacaat cctattgata 60
taatctaagc tagtgtattt a 81
<210> 5
<211> 76
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 5
aaaaaacggc ctctcgaaat agagggttgt tatttgaaag gaattatcgt ataattagtt 60
gtgctaaagg aggtga 76
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 6
ttttatcctt tactgcgtca atacacgttg acactctttt gagaatatgt tatattatca 60
gaaaggaggt ga 72
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
gatcttgagg aatcatagaa tttttaattt aaattttatt tg 42
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
ataaaattta aattaaaaat tctatgattc ctcaa 35
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
acaaaaatgg gctcgtgttg tawwat 26
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
caacacgagc ccatttttgt caa 23
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
aaatgtagtg aggtggaaag gaggtgataa a 31
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
catttttatc acctcctttc cacctcacta catttatwwt a 41
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
gatcatatga tagggaactt ttctctttct tgttttacat tg 42
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
tgtaaaacaa gaaagagaaa agttccctat catat 35
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
aatctttaca atcctattga tawwat 26
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
tcaataggat tgtaaagatt caa 23
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
ctaagctagt gtatttaaag gaggtgataa a 31
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
catttttatc acctccttta aatacactag cttagatwwt a 41
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
gatcttgagg aatcatagaa ttttgtcaaa ataattttat tg 42
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
taaaattatt ttgacaaaat tctatgattc ctcaa 35
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
acaacgtctt attaacgttg atawwat 27
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
tcaacgttaa taagacgttg tcaa 24
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
attgcaagct tgcaaaaaag gaggtgataa a 31
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
catttttatc acctcctttt ttgcaagctt gcaatatwwt a 41
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
gatcttgagg aatcatagaa ttttgactta aaaatttcag ttg 43
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
ctgaaatttt taagtcaaaa ttctatgatt cctcaa 36
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
cttaatccta caattcttga tawwat 26
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
tcaagaattg taggattaag caa 23
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
attctcatag tttgaaaaag gaggtgataa a 31
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
catttttatc acctcctttt tcaaactatg agaatatwwt a 41
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
aaaaaacggc ctctcgaaat agagggttg 29
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
ccctctattt cgagaggccg tttttt 26
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
ttatttgaaa ggaattatcg tawwat 26
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
cgataattcc tttcaaataa caa 23
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
tagttgtgct aaaggaggtg ataaa 25
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
catttttatc acctccttta gcacaactaa ttata 35
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
ttttatcctt tactgcgtca atacacgttg 30
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
cgtgtattga cgcagtaaag gataaaa 27
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
acactctttt gagaatatgt tawwtt 26
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
acatattctc aaaagagtgt caa 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
atcagaaagg aggtgataaa 20
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
catttttatc acctcctttc tgataatata 30
<210> 43
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
ttgaggaatc atagaatttt gtcaaaataa ttttattgac actcttttga gaatatgtta 60
atttatcaga aaggaggtga taaaa 85
<210> 44
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttga caaaaatggg ctcgtgttgt 60
attatattct catagtttga aaaaggaggt gataaaa 97
<210> 45
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
ttgaggaatc atagaatttt gtcaaaataa ttttattgac aaaaatgggc tcgtgttgta 60
atattagttg tgctaaagga ggtgataaaa 90
<210> 46
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
ttgaggaatc atagaatttt taatttaaat tttatttgct taatcctaca attcttgata 60
taattagttg tgctaaagga ggtgataaaa 90
<210> 47
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
ttgaggaatc atagaatttt gtcaaaataa ttttattgac aacgtcttat taacgttgat 60
ataattagtt gtgctaaagg aggtgataaa a 91
<210> 48
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
ttgaggaatc atagaatttt gacttaaaaa tttcagttgc ttaatcctac aattcttgat 60
ataattagtt gtgctaaagg aggtgataaa a 91
<210> 49
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
aaaaaacggc ctctcgaaat agagggttga caaaaatggg ctcgtgttgt ataattagtt 60
gtgctaaagg aggtgataaa a 81

Claims (10)

1.一种针对淀粉酶BLA的启动子文库，其特征在于，所述的启动子文库包括SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQID NO.49所示核苷酸序列的启动子。
2.根据权利要求1所述针对淀粉酶BLA的启动子文库，其特征在于，所述的SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQID NO.49所示核苷酸序列的启动子具有依次增强启动目的基因表达的强度。
3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48或SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列，作为启动子元件。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求3所述的载体；或者，所述的细胞的基因组中整合有SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ IDNO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48或SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列的核酸。
5.一种针对淀粉酶BLA的强启动子，其特征在于，所述的强启动子选自如下的一种：SEQID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子。
6.权利要求1所述的启动子文库在提供不同强度类型启动子中的应用，所述的启动子可操作性地与目的基因连接，能不同程度的促进高表达淀粉酶BLA基因。
7.一种针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)选择6个已表征的枯草杆菌启动子序列作为出发启动子，以其-35区的保守序列ttg和-10区的保守序列tawwt为节点，将启动子分为三个区域，每个区域设计一对互补的寡核苷酸序列，退火后得到对应的DNA双链片段，将退火后的片段混合后，不同启动子的三个区域可通过-35区和-10区随机连接，得到组合启动子片段；
2)将步骤1)得到的启动子片段与淀粉酶BLA探针载体酶连，得到针对BLA的组合启动子载体；
3)建立枯草芽孢杆菌CRISPR/cas9系统，构建cas9蛋白表达载体和靶向整合位点AmyE的sgRNA载体；
4)将步骤3)得到的cas9蛋白表达载体转化枯草芽孢杆菌，转化子制备感受态，同时添加IPTG诱导cas9蛋白的表达，使cas9蛋白在整合位点AmyE引入DNA双链断裂，然后将步骤2)得到的组合启动子载体和步骤3)得到的sgRNA载体同时转化该感受态，涂布于含有抗生素选择的平板，得到特定针对淀粉酶BLA的启动子文库；
步骤1)中，所述的出发启动子是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的启动子；所述的寡核苷酸序列为SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述的淀粉酶BLA探针载体为整合型载体pDGT-BLA，或其他避免游离性质粒拷贝数对文库表征影响的整合型载体。
9.根据权利要求7所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤3)所述的cas9蛋白表达载体是将cas9蛋白连接到pHT01载体上而得；所述的sgRNA载体是合成p242-BsmBI/BsmBI-sgRNA片段，并连接到pHY300PLK载体上而得。
10.根据权利要求9所述针对淀粉酶BLA的启动子文库的构建方法，其特征在于，步骤3)所述的sgRNA载体上连接有靶向AmyE的靶向核苷酸序列，所述的靶向AmyE的核苷酸序列为GCAGTTACGGCAGTCAATTT。
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