CN105671070A - 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法 - Google Patents

一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA-C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA-C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA-C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。

Description

一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)属于革兰氏阳性菌，因其易于分离培养，具有较清晰的遗传背景和良好的分泌性，又无致病性等特点，已成为重要的工业菌种，被越来越多的用于生产抗生素、药物蛋白和工业酶制剂等。B.subtilis168是一种实验室模式菌株，包含有许多突变。目前被工业上使用的菌株如B.subtilisWB600和B.subtilisWB800都是来源于B.subtilis168。本实验室之前筛选到一种耐热酸性普鲁兰酶生产菌株，分类命名为芽胞杆菌(Bacillus.Sp)WSH10-03(于2013年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCCNO:M2013012，专利公开号CN103255079A)，后来鉴定是枯草芽孢杆菌。但是B.subtilisWSH10-03在发酵过程中会产生大量的泡沫，使得发酵过程很难控制并且可能造成染菌。枯草芽孢杆菌在发酵过程中会产生表面活性素(surfactin)，表面活性素是一种两性分子，它在液体表面的聚集会造成泡沫的产生。srfA-C基因控制着枯草芽孢杆菌表面活性素形成。采用基因操作技术敲除srfA-C基因来减少枯草芽孢杆菌发酵过程泡沫的产生，这无疑具有极大的工业应用前景。
细菌长期生活在充满噬菌体或者其它病毒的自然环境中，进化出了多种防御系统，CRISPR/CAS系统就是其中之一，比较常见的是Ⅱ型CRISPR-CAS获得性免疫系统(Streptococcuspyogenes和S.thermophilus)，当噬菌体入侵时，其基因组上的原间隔序列(postospacer)作为新的间隔序列插入到宿主细胞CRISPR序列的起始序列之后，作为第一个间隔序列；当该噬菌体再次入侵时，细菌的CRISPR序列转录产生一条长链RNA，即crRNA前体(pre-crRNA)，随后Cas蛋白复合体在tracrRNA(trans-activatingcrRNA)的协助下剪切产生成熟体crRNAs，最后tracrRNA-crRNA-Cas9复合体识别并剪切与crRNA互补的位点。现在通常设计1个sgRNA(smallguideRNA)来代替trancrRNA-crRNA引导Cas9蛋白。
建立枯草芽孢杆菌的基因编辑系统，将有利于对基因进行敲除等改造。
发明内容
本发明的目的在于提供CRISPR/Cas9基因编辑系统在枯草芽孢杆菌中的建立和应用。利用本发明的CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑，当把sgRNA和Cas9基因表达质粒转化枯草芽孢杆菌后，sgRNA通过靶序列与基因对应的互补序列配对，sgRNA中的其他序列则形成茎环结构，此结构能为Cas9所识别，然后在PAM(Protospacer-AdjacentMotif)序列上游2-3碱基间将靶基因的DNA双链切断。断裂的双链DNA在有同源修复模板的情况下可以通过HDR(homology-directedrepair)途径进行准确的基因组重组。若断裂发生在编码区内，并且修复模板在断裂处插入几个碱基(非3的倍数)，就会导致修复后的基因阅读框码组移动(frameshift)，造成编码区提前出现终止密码子。
本发明的第一个目的是提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统建立在单个敲除质粒PHY300dsrf的基础上；PHY300dsrf包含sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌复制原点p15A、温度敏感的复制原点PE194、氨苄青霉素筛选标记基因和四环素筛选标记基因。
所述PHY300dsrf是将同源修复臂连接到PHY300d上得到的；而PHY300d是由四个片段(Frag1、Frag2、Frag3和Frag4)连接而成；其中Frag1含有特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列和PE194温度敏感的复制原点的基因序列，Frag2包含氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A，Frag3包含四环素筛选基因，Frag4包含cas9基因。
在本发明的一种实施方式中，四个片段按照Frag1、Frag2、Frag4、Frag3的顺序连接。
在本发明的一种实施方式中，所述sgRNA双链寡核苷酸序列的设计，根据靶序列sgRNA软件可以设计出一系列的sgRNA，选取其中一个脱靶率低的，并且在阅读框前面的作为sgRNA；sgRNA的设计原理和方法是本领域技术人员根据已有技术可以常规获知的。
在本发明的一种实施方式中，所述PE194温度敏感的复制原点的基因序列是NCBIGenBank:M17811.1。
在本发明的一种实施方式中，氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因都是以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板扩增得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase是在穿梭质粒pHY300PLK(TaKaRaCodeNo.3060)中的XbaI和EcoRI酶切位点处插入地衣芽孢杆菌来源的淀粉酶启动子和β-CGTase基因构建而成，是由本实验室保藏的质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统由三部分依次连接而成；第一部分为特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列，第二部分含有PE194温度敏感的复制原点的基因序列、氨苄青霉素筛选基因、大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因、cas9基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的序列；第三部分为待敲除基因的同源修复臂。
所述同源修复臂是根据靶序列设计的，(在cas9切割断裂处)缺失了靶基因序列中的3N个碱基(N为整数)，并插入了一个酶切位点和3N±1(N为整数)碱基，造成阅读框的移码突变。
在本发明的一种实施方式中，所述敲除质粒PHY300dsrf的构建包括如下步骤：
(1)根据枯草芽孢杆菌的基因序列设计用于特异性靶向基因的sgRNA，再在靶向基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡核苷酸序列，化学合成sgRNA及PE194序列，并将这两个片段连接到一起，获得载体骨架Frag1；
(2)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板，获得氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A，获得载体骨架Frag2；
(3)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板，获得四环素筛选基因，即得载体骨架Frag3；
(4)以质粒pwtcas9-bacterial(Addgeneplasmid#44250)为模板，获得cas9基因，即获得载体骨架Frag4；
(5)按照Frag1、Frag2、Frag4、Frag3的顺序连接四个片段，得到质粒PHY300d。
(6)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到需要敲除的基因的同源修复臂上游片段、同源修复臂下游片段，并通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来，得到完整的同源修复臂；
(7)将上述含有同源修复臂片段连接到质粒PHY300d上，得到敲除质粒PHY300dsrf。
在本发明的一种实施方式中，所述编辑系统用于敲除srfA-C基因；所述步骤(1)是设计特异性靶向srfA-C基因的sgRNA，将化学合成sgRNA及PE194序列到PMD18-T载体上(sgRNA在PE194的下游)，用如SEQIDNO:5和如SEQIDNO:6的引物进行PCR扩增，获得载体骨架Frag1。
在本发明的一种实施方式中，所述编辑系统用于敲除srfA-C基因；所述步骤(6)是用如SEQIDNO:13和SEQIDNO:14的引物进行PCR扩增获得同源修复臂上游片段，用如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的引物进行PCR扩增获得同源修复臂下游片段，然后通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来，并引入XbaI酶切位点；将同源修复臂连到PMD18-T载体上。
在本发明的一种实施方式中，所述编辑系统用于敲除srfA-C基因；所述步骤(7)是将上述含有同源修复臂的PMD18-T载体质粒用XhoI酶切，得到带有酶切位点的同源修复臂片段；将质粒PHY300d用XhoI酶切，将带有酶切位点的同源修复臂片段连入相应酶切位点，得到敲除质粒PHY300dsrf。
本发明还提供所述编辑系统的应用，是用于敲除枯草芽孢杆菌的srfA-C基因；是将含有srfA-C基因的sgRNA和srfA-C基因的同源修复臂的敲除质粒PHY300dsrf转化到枯草芽孢杆菌中，通过四环素抗性筛选转化子，并验证转化子。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis168或B.subtilisWSH10-03。
在本发明的一种实施方式中，所述验证是用如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物进行PCR扩增，然后PCR纯化产物进行XbaI酶切验证是否敲除成功。
在本发明的一种实施方式中，对srfA-C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行发酵培养，以2‰的接种量从甘油管中吸取菌液接种于LB培养基(含20μg/ml四环素)中，37℃，200r/min，培养8-10h；以5％的接种量将种子液接入装在穿刺摇瓶的TB(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO412.54g/L，KH2PO42.31g/L)发酵液体培养基(含20μg/mL四环素)中，30℃，转速200r/min，培养48-60h。
本发明的有益效果：
成功构建了能够用于枯草芽孢杆菌基因编辑的系统，成功用于枯草芽孢杆菌的srfA-C基因的敲除，srfA-C基因的敲除菌株在发酵过程中几乎不产生泡沫，证明srfA-C基因的敲除可以有效的控制发酵过程中泡沫的产生，减少染菌的机率并且有利于发酵过程的控制。
附图说明
图1：敲除质粒PHY300dsrf质粒图谱；
图2：srfA-C基因敲除XbaI酶切验证；
图3：srfA-C基因敲除测序验证。
具体实施方式
实施例1：构建CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除质粒PHY300dsrf
(1)根据枯草芽孢杆菌的基因序列设计用于特异性靶向srfA-C基因的sgRNA，再在srfA-C基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡核苷酸序列(如SEQIDNO:2)，从NCBI上查找PE194温度敏感的复制原点的基因序列(如SEQIDNO:3)然后合成sgRNA及PE194序列并连接到到PMD18-T载体上，用以下引物5’-GGAACGTACAGACGCATTTTACATTTTTAGAAATGGGC-3’(如SEQIDNO:5)和5’-CGTTTGTTGAACTACGCAGTCGGCTTAAACCAG-3’(如SEQIDNO:6)进行PCR扩增，得到Frag1。反应体系如表1。
表1反应体系
5xPhusion HF Reaction Buffer 10uL
dNTP(10mmol/L) 4uL
模板(50pmol/L) 0.5uL
PCR引物1 0.5uL
PCR引物2 0.5uL
Primerstar DNA Ploymerase(2U/uL) 0.5uL
ddH2O 将体系补足50uL
反应程序如下：94℃预变性4min；98℃10s，55℃10s，72℃1.5min，进行30个循环；72℃延伸10min，降温至4℃。最终得到sgRNA及PE194序列单元Frag1。
(2)穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase是本实验室保藏的质粒，它是在穿梭质粒pHY300PLK(TaKaRaCodeNo.3060)中插入地衣芽孢杆菌来源的淀粉酶启动子和β-CGTase基因构建而成。以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板，获得氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A，用以下引物5’-GGCAACCGTAAGCTTGGTAAT-3’(如SEQIDNO:7)和5’-GCGTCTGTACGTTCCTTAAGG-3’(如SEQIDNO:8)进行PCR扩增，获得载体骨架Frag2。
(3)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板，获得四环素筛选基因，用以下引物5’-TTTCTTATACAAATTATATTTTACATATCAAT-3’(如SEQIDNO:9)和5’-GTAGTTCAACAAACGGGCC-3’(如SEQIDNO:10)进行PCR扩增，获得载体骨架Frag3。
(4)以质粒pwtcas9-bacterial(Addgeneplasmid#44250)为模板，获得cas9基因，用以下引物5’-AATTTGTATAAGAAAATGGATAAGAAATACTCAATAGGCT-3’(如SEQIDNO:11)和5’-AAGCTTACGGTTGCCTTAGTCACCTCCTAGCTGACTC-3’(如SEQIDNO:12)进行PCR扩增，获得载体骨架Frag4。
(5)采用In-FusionHDCloningPluskits连接四个片段Frag1、Frag2、Frag3和Frag4，In-FusionHDCloningPluskits连接体系如表2：
表2连接体系
线性化载体和纯化的PCR产物片段的摩尔比为1：2；用水补足10uL体系。50℃连接20min，冰浴5min，然后转化入E.coliJM109感受态细胞，涂布到LB固体培养基(含100ug/mL氨苄青霉素)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行测序验证。验证正确的质粒即为PHY300d。
(6)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，用以下引物5’-CTCTAGACTGCTCCTACAATGAGAAGGAG-3’(如SEQIDNO:13)和5’-CTCTAGAGAGCAGCTCTTTCGGCTCATAG-3’(如SEQIDNO:14)进行PCR扩增，获得同源修复臂上游片段，用以下引物5’-CTCGAGGCTAGGGGCAGCGAGCAAACAGC-3’(如SEQIDNO:15)和5’-GAGCAGCTCTTTCGGCTCATAG-3’(如SEQIDNO:16)进行PCR扩增，获得同源修复臂下游片段，然后通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来，并引入XbaI酶切位点。将同源修复臂(如SEQIDNO:4)连到PMD18-T载体上，转化入E.coliJM109感受态细胞，涂布到LB固体培养基(含100g/mL氨苄青霉素)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行测序验证。
(7)将上述含有同源修复臂的PMD18-T载体质粒用XhoI酶切，得到带有酶切位点的同源修复臂片段；将质粒PHY300d用XhoI酶切，然后将带有酶切位点的同源修复臂片段连入相应酶切位点。酶切体系和连接体系如表3、表4所示。
表3XhoI酶切体系
酶切成分 酶切用量
XhoI限制性内切酶 0.5uL
10xH Reaction Buffer 1uL
纯化的PCR产物片段 4uL
ddH2O 4.5uL
37℃酶切反应2h。
表4连接体系：
连接成分 各成分用量
T4 Ligase 1uL
10xT4 Ligase buffer 1uL
同源修复臂酶切片段 7uL5 -->
PHY300d质粒酶切片段 1uL
16℃连接过夜，连接产物转化入E.coliJM109感受态细胞，涂布到LB固体培养基(含100g/mL氨苄青霉素)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆,提取质粒,进行测序验证，得到敲除质粒PHY300dsrf，它包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记(图1)。
实施例2：枯草杆菌转化方法
用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌，然后在LB平板上划线，37℃培养过夜活化。挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃培养过夜培养18h。取一定量的过夜培养物到4.5mL的GMⅠ中，使OD600值到达0.1-0.2，留下4.5mL混合菌液。37℃200rpm振荡培养，每个20min测一次OD600，当OD600到达0.4-0.6(大约需要60-90min)；继续振荡培养90min，吸取0.05ml菌液至存有0.45mL预热的GMⅡ的无菌试管中；37℃振荡90min，此时培养物中有很多感受态细胞形成；加1μg的质粒(15-20uL)，37℃振荡培养30min；离心去除大部分的上清液，重悬细胞，涂在含有相应抗生素的筛选平板上，37℃培养过夜。
培养基配方：
(1)10×最低盐溶液：K2HPO414g(K2HPO4·3H2O18.34g)，KH2PO46g，(NH4)2SO42g，柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)1g，MgSO4·7H2O0.2g，在蒸馏水中依次溶解，加水至100ml。(2)L-trp溶液，2mg/mL，贮于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹。
(3)GMⅠ溶液：1×最低盐溶液95ml，50％葡萄糖1mL，5％水解酪蛋白0.4mL，10％酵母汁1mL，2mg/mLL-trp2.5mL。
(4)GMⅡ溶液：1×最低盐溶液97.5mL，50％葡萄糖1mL，5％水解酪蛋白0.08mL，10％酵母汁0.04mL，0.5MMgCl20.5mL(2.5mM)，0.1MCaCl20.5mL(0.5mM)，2mg/mLL-trp0.5mL(5ug/mL)。
实施例3：用质粒PHY300dsrf敲除B.subtilis168基因组中的srfA-C基因
采用实施例2中的方法，将敲除质粒PHY300dsrf转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，涂布到LB固体培养基(含20ug/mL四环素)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取基因组，以基因组为模板，用以下引物5’-CTCGAGGCTAGGGGCAGCGAGCAAACAGC-3’(如SEQIDNO:17)和5’-GAGCAGCTCTTTCGGCTCATAG-3’(如SEQIDNO:18)进行PCR扩增，然后在37℃进行XbaI酶切验证。敲除srfA-C基因的菌株进行基因组同源修复时在srfA-C基因断裂处插入了XbaI酶切位点，所以可以被XbaI内切酶切开，而野生型的则不会被切开(图2，图3)。
实施例4：用质粒PHY300dsrf敲除B.subtilisWSH10-03基因组中的srfA-C基因
采用实施例2中的方法，将敲除质粒PHY300dsrf转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，涂布到LB固体培养基(含20ug/mL四环素)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取基因组，以基因组为模板，用如SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的引物进行PCR扩增，然后在37℃进行XbaI酶切验证。敲除srfA-C基因的菌株进行基因组同源修复时在srfA-C基因断裂处插入了XbaI酶切位点，所以可以被XbaI内切酶切开，而野生型的则不会被切开。
实施例5：枯草芽孢杆菌B.subtilisWSH10-03srfA-C基因敲除菌的发酵
吸取200μL的甘油管菌液接种于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，30℃，200r/min培养24h，将上述培养液接入装液量为0.9L的3L发酵罐，以25％氨水控制pH7，培养温度30℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当溶氧迅速上升，表明培养基中的葡糖糖已经耗尽，开始流加体积比为50％葡萄糖补料液，
种子培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L
发酵培养基：硫酸钙0.939g/L，硫酸镁7.27g/L，氢氧化钾4.13g/L，硫酸钾18.2g/L，玉米浆30g/L，磷酸26.7mL/L，葡萄糖5g/L，金属离子PTM溶液(g/L)：CuSO4·5H2O6，KI0.08，MnSO4·H2O，Na2MoO3·2H2O0.2，H3BO30.02，CoCl20.5，ZnCl220，FeSO4·7H2O65，生物素0.2，H2SO45.0。
srfA-C基因敲除的B.subtilisWSH10-03在上罐发酵过程中泡沫明显减少了，在生长对数期泡沫产生较多，但是可以通过滴加少量消泡剂控制泡沫的产生；B.subtilisWSH10-03原始菌在上罐发酵过程中泡沫大量产生，通过滴加消泡剂控制不住，可能造成培养基从通气管中喷出和染菌等。

Claims (10)

1.一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统建立在单个敲除质粒PHY300dsrf的基础上；PHY300dsrf包含sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌复制原点p15A、温度敏感的复制原点PE194、氨苄青霉素筛选标记基因和四环素筛选标记基因。
2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述PHY300dsrf是将同源修复臂连接到PHY300d上得到的；而PHY300d是由Frag1、Frag2、Frag3和Frag4这四个片段连接而成；其中Frag1含有特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列和PE194温度敏感的复制原点的基因序列，Frag2包含氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A，Frag3包含四环素筛选基因，Frag4包含cas9基因。
3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统由三部分依次连接而成；第一部分为特异性靶向基因的sgRNA双链寡核苷酸序列，第二部分含有PE194温度敏感的复制原点的基因序列、氨苄青霉素筛选基因、大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因、cas9基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的序列；第三部分为待敲除基因的同源修复臂。
4.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，四个片段按照Frag1、Frag2、Frag4、Frag3的顺序连接。
5.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述PE194温度敏感的复制原点的基因序列是NCBIGenBank:M17811.1。
6.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因都是以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板扩增得到的。
7.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述敲除质粒PHY300dsrf的构建方法如下：
(1)根据枯草芽孢杆菌的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA；再在目的基因的sgRNA的基础上设计sgRNA双链寡核苷酸序列，化学合成sgRNA及温度敏感的复制原点PE194序列；
(2)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板，PCR获得氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A；
(3)以穿梭质粒pHYPLK-β-CGTase为模板，PCR获得四环素筛选基因；
(4)以质粒pwtcas9-bacterial(Addgeneplasmid#44250)为模板，PCR获得cas9基因
(5)采用In-FusionHDCloningPluskits将分别含有sgRNA及温度敏感的复制原点PE194序列、氨苄青霉素筛选基因及大肠杆菌复制原点p15A、四环素筛选基因和cas9基因的四个片段连接起来，得到质粒PHY300d。
(6)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，重叠PCR获得在断裂处插入XhoI酶切位点的同源修复臂，并连接到PMD18-T载体上。
(7)将上述含有同源修复臂的PMD18-T载体质粒用XhoI酶切，得到带有酶切位点的同源修复臂片段；将质粒PHY300d用XhoI酶切，然后将带有酶切位点的同源修复臂片段连入相应酶切位点，得到敲除质粒PHY300dsrf。
8.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在枯草芽孢杆菌基因组编辑上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是用于敲除枯草芽孢杆菌的srfA-C基因。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为B.subtilis168或B.subtilisWSH10-03。
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