CN108841772A - 一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌 - Google Patents

一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效表达α‑淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的枯草芽孢杆菌工程菌以pHY300PLK为表达载体、以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的高温α‑淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5为表达宿主，并在目的基因的上游插入了信号肽基因。利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌可高效表达α‑淀粉酶，将其作为生产菌株，摇瓶发酵48h，可将发酵液中α‑淀粉酶的酶活提高至732.1U/mL。

Description

一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌
技术领域
本发明涉及一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
α-淀粉酶(α-amylase，EC.3.2.1.1)是一种重要的糖苷水解酶，其具有广泛的底物偏好性以及产物特异性，能切断淀粉以及相关α-葡聚糖分子中的α-1,4-葡萄糖苷键，并将淀粉水解为可溶性糊精、低聚糖及麦芽糖和葡萄糖，同时，其能够保留产物的α-异构体构象。
因此，α-淀粉酶被广泛应用于食品、洗涤、造纸、纺织、酒精和医药等行业。
根据作用温度的不同，α-淀粉酶也可分为高温、中温和低温α-淀粉酶。其中，高温α-淀粉酶具有良好的热稳定性，且来源广泛，可以从植物、动物和微生物中提取得到。植物、动物和微生物来源的α-淀粉酶中，微生物来源的高温α-淀粉酶在生产成本、发酵稳定性和生产时间等方面均比其他来源的有更明显的优势；而在微生物来源的高温α-淀粉酶中，细菌来源的高温α-淀粉酶热稳定性优势更为明显。
因此，来源于细菌的高温α-淀粉酶具有巨大的应用前景。
目前，已经有很多文献研究了来源于不同细菌的高温α-淀粉酶在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等细菌中异源表达的情况。高温α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达量比在枯草芽孢杆菌中的高，但由于大肠杆菌在进行发酵产酶的过程中会产生内毒素等有害物质，对人体不利，大大限制了其应用；而枯草芽孢杆菌的细胞壁不含内毒素，是一种非致病的土壤微生物，已被美国食品药物管理局和中国相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generallyrecognized as safe)，但高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达的表达量与活性十分低。
上述缺陷均使得来源于细菌的高温α-淀粉酶在工业上难以得到广泛的应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌。此枯草芽孢杆菌工程菌以pHY300PLK为表达载体、以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WS5为表达宿主，并在目的基因的上游插入了信号肽基因。利用此枯草芽孢杆菌工程菌可高效表达α-淀粉酶，将其作为生产菌株，发酵48h，可将发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至732.1U/mL。
本发明提供了一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、信号肽基因以及表达载体；所述目的基因为α-淀粉酶基因；所述信号肽基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8；所述表达载体为pHY300PLK；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
在本发明的一种实施方式中，所述目的基因为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。
在本发明的一种实施方式中，所述目的基因的酶切位点为Sac I和Hind III。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168的信号肽基因。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因插入在目的基因的上游。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因的酶切位点为Mlu I和Eco52I。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WS5或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)K1285；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016536，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5记载于公开号为CN106754466A，申请号为201611025858.9的专利文本中。
本发明提供了一种生产α-淀粉酶的方法，所述方法为使用上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中培养，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中培养。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8-10h，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为的成分包含8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含20～25g/L的酵母浸膏、5～10g/L的大豆蛋白胨以及4～6g/L的甘油；所述发酵培养基的初始pH为6～7。
本发明提供了应用上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌或上述一种生产α-淀粉酶的方法制备得到的α-淀粉酶。
本发明提供了上述一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌或上述一种生产α-淀粉酶的方法在制备α-淀粉酶、水解淀粉、制备糊精、制备低聚糖、制备麦芽糖以及制备葡萄糖方面的应用。
有益效果：
(1)本发明以pHY300PLK为表达载体、以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WS5为表达宿主并在目的基因的上游插入了信号肽基因，得到了一种可高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌；
(2)利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌生产α-淀粉酶，发酵48h，可将三角摇瓶发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至732.1U/mL；
(3)利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌生产α-淀粉酶，发酵原料来源广泛，同时，生产成本较低。
附图说明
图1为重组质粒pHY-SPamyE-amyS构建流程图；
图2为重组质粒pHY-SPamyE-amyS的QuickCutTMHind III酶切验证结果；
其中，M为DL1000DNAMarker，泳道1为pHY-SPamyE-amyS QuickCutTMHind III酶切条带；
图3为重组质粒pHY-SPYojL-amyS构建流程图；
图4为重组质粒pHY-SPYojL-amyS PCR验证图；
其中，M为DL500DNA Marker，泳道1为pHY-SPYojL-amyS PCR扩增条带；
图5为含有重组质粒pHY-SPYojL-amyS的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图；其中，M为中分子量标准蛋白，泳道1为Bacillus subtilis WS5/pHY-SPYojL-amyS摇瓶发酵上清条带。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5记载于公开号为CN106754466A，申请号为201611025858.9的专利文本中，且已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016536，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K1285购自Takara公司(宝生物工程(大连)有限公司)，产品型号：3380，B.subtilis Secretory Protein Expression System。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
酶活检测方法：将1mL的1％的可溶性淀粉溶液和0.9mL的20mM、pH6.0的磷酸缓冲液充分混匀，在70℃预热10min，加入0.1mL粗酶液，振荡混匀，反应5min后加入3mL DNS，振荡，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂进行同样操作作为空白)。
在上述条件下，定义每分钟催化产生相当于1umol葡萄糖所需酶量为一个淀粉水解活力单位。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
种子培养基：8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
发酵培养基：20～25g/L的酵母浸膏、5～10g/L的大豆蛋白胨以及4～6g/L的甘油，初始pH为6～7。
LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏5、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏5、10g/L的NaCl。
生长培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏5、10g/L的NaCl、0.5M的山梨醇。
电转缓冲液：0.5M的山梨醇、0.5M的甘露醇、10％的葡萄糖。
复苏培养基RM：0.5M的山梨醇、0.38M的甘露醇、10g/L蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl。
实施例1：构建重组载体pHY-SPamyE-amyS
具体步骤如下(构建流程可参考图1)：
(1)设计含有同源臂的引物amyS-F、amyS-R(SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11)，以重组载体pET20b-amyS为模板，PCR扩增出带有同源臂的amyS，其中重组载体pET20b-amyS为实验室保存(Ref:L Z,D X,W J.Improving the thermostability and enhancing the Ca2+binding of the maltohexaose-formingα-amylase from Bacillusstearothermophilus.Journal of Biotechnology.2016；222:65–72.)。
(2)设计引物pHY-F、pHY-R(SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13)，以重组载体pHY300PLK-β-CGTase为模板，PCR扩增出载体pHY-SPamyE(此处信号肽SPamyE为载体pHY自带的信号肽，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1)，其中重组载体pHY300PLK-β-CGTase为实验室保存(Ref:Zhang,K.,Duan,X.,Wu,J.2016.Multigene disruption in undomesticatedBacillus subtilis ATCC 6051a using the CRISPR/Cas9system.Scientific Reports,6.Bacillus subtilis)。
引物序列见表1：
表1引物序列
注：划线部分为同源臂序列。
PCR体系见表2：
表2 PCR反应体系
5xPhusion HF Reaction Buffer 10.0μL
dNTP 4.0μL
pET20b-amyS/pHY300-β-CGTase 0.5μL
amyS-F/pHY-F 0.5μL
amyS-R/pHY-R 0.5μL
Primerstar DNA 0.5μL
ddH2O Up to 50μL
PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环，PCR产物进行胶回收。
(3)将(1)、(2)中扩增出且已回收的两段片段根据H Cloning Kit试剂盒要求按照插入片段和载体的摩尔比例为2:1进行混合，应用下面连接体系进行连接后将连接产物转入E.coli JM109感受态细胞，涂板后于37℃过夜培养；
连接体系见表3：
表3HD Cloning Kit试剂盒连接体系
体系组分 组分用量
5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2.0μL
pHY-SPamyE 1.2μL
amyS 3.5μL
ddH2O 3.3μL
连接条件：50℃，25min。
(4)从过夜培养的平板上挑单菌落，接LB液体培养基于37℃，200rpm下培养8～10h后提质粒进行QuickCutTMHind III酶切验证(验证结果见图2)，酶切验证成功即得重组载体pHY-SPamyE-amyS。
酶切体系见表4：
表4 QuickCutTMHind III酶切体系
酶切成分 酶用量
QuickCutTMHind III 0.2μL
10×QuickCut Green Buffer 1.0μL
pHY-SPamyE-amyS 2.0μL
ddH2O 6.8μL
酶切条件：37℃酶切反应20min。
实施例2：构建带有不同信号肽的重组载体
将编码来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的信号肽SPYojL(核苷酸序列为SEQ ID NO.2)、SPRpmG(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)、SPAspB(核苷酸序列为SEQ IDNO.4)、SPNprE(核苷酸序列为SEQ ID NO.5)、SPAprE(核苷酸序列为SEQ ID NO.6)、SPYqxI(核苷酸序列为SEQ ID NO.7)、SPYwgB(核苷酸序列为SEQ ID NO.8)的基因与实施例1中构建的连有高温α-淀粉酶的表达载体进行重组(构建流程可参考图3)，具体步骤如下：
(1)用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168，在LB固体培养基上划线，37℃过夜培养，挑单菌落用10μL的无菌的蒸馏水稀释，得到稀释后的菌液；
(2)设计含有同源臂的引物YojL-F、YojL-R(SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15)，以(1)中得到的稀释后的菌液为模板扩增出SPYojL信号肽；
(3)用接种环沾取冻存的E.coli JM109/pHY-SPamyE-amyS，在LB固体培养基上划线，37℃过夜培养，挑单菌落用10μL的无菌的蒸馏水稀释，得到稀释后的菌液；
(4)设计引物P-F、P-R(SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29)，以(3)中得到的稀释后的菌液为模板扩增出pHY-amyS表达载体序列；
引物序列如表5-6：
表5引物序列
表6引物序列
注：划线部分为同源臂序列。
PCR体系见表7：
表7 PCR反应体系
5xPhusion HF Reaction Buffer 10μL
dNTP 4.0μL
菌液 0.5μL
PCR引物F 0.5μL
PCR引物R 0.5μL
Primerstar DNA 0.5μL
ddH2O up to 50μL
PCR条件：94℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环，PCR产物进行胶回收。
(4)将(2)、(3)中扩增出且已回收的两端片段根据HD Cloning Kit试剂盒要求按照插入片段和载体的摩尔比例为2:1进行混合，应用下面连接体系进行连接；
连接体系见表8：
表8HD Cloning Kit试剂盒连接体系:
体系组分 组分用量
5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2.0μL
pHY-amyS 5.0μL
信号肽 2.0μL
ddH2O Up to 10μL
连体条件：50℃酶切反应25min。
SPRpmG、SPAspB、SPNprE、SPAprE、SPYqxI、SPYwgB信号肽的重组构建同(1)-(4)，引物分别为RpmG-F、RpmG-R(SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17)及AspB-F、AspB-R(SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19)；NprE-F、NprE-R(SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21)；AprE-F、AprE-R(SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23)；YqxI-F、YqxI-R(SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25)；YwgB-F、YwgB-R(SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27)延伸时间按照1kb/1min计算。
(5)用(4)中构建的重组质粒转化E.coli JM109感受态细胞后培养涂布LB固体培养基(含100μg/mL氨苄抗生素)，37℃培养过夜，待平板上长出单菌落，挑单菌落于LB液体培养基中培养8-10h后抽提质粒，因信号肽序列较小，因此，设计引物Fyan-F、Fyan-R(SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.31)对信号肽进行PCR验证(验证结果见图4)，大小正确后对重组质粒测定DNA序列，获得阳性克隆子即含有不同信号肽的重组载体pHY-SPYojL-amyS、pHY-SPRpmG-amyS、pHY-SPAspB-amyS、pHY-SPNprE-amyS、pHY-SPAprE-amyS、pHY-SPYqxI-amyS、pHY-SPYwgB-amyS。
实施例3：构建重组菌
选取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K1285作为宿主细胞，构建重组菌，具体步骤如下：
(1)用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K1285，然后在LB平板上划线，37℃培养过夜活化；
(2)从LB平板上挑步骤(1)的单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养；
(3)取2.5mL转接入40mL生长培养基，37℃，200rpm震荡培养4～5h；
(4)将菌液冰浴10min，然后5000g，4℃，离心5min收集菌体；
(5)用50ml预冷的电转缓冲液洗涤菌体，5000g，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次；
(6)将洗涤后的菌体重悬于1mL电转缓冲液中，分装到1.5mL EP管中，每管装200μl感受态细胞；
(7)将200μL感受态细胞中分别加入10μL实施例1所得的重组质粒以及实施例2所得的带有不同信号肽重组质粒，冰浴18min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次；
电转仪设置：2.4kv，25μF，200Ω；
(8)电击完毕后立即加入1mL复苏培养基RM缓慢吹吸混匀，37℃，200rpm，复苏3h后，涂含四环素抗性(50ug/mL)的平板，即得到分别含有重组载体pHY-SPYojL-amyS、pHY-SPRpmG-amyS、pHY-SPAspB-amyS、pHY-SPNprE-amyS、pHY-SPAprE-amyS、pHY-SPYqxI-amyS、pHY-SPYwgB-amyS、pHY-SPAmyE-amyS的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K1285。
实施例4：摇瓶发酵产酶及α-淀粉酶酶活的测定
将实施例3中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于种子培养基中于35～38℃、180～220rpm条件下培养8～10h，得到种子液，然后将种子液转接至发酵培养基中，于发酵培养基中于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h；
发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液；(含有重组质粒pHY-SPYojL-amyS的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵上清的SDS-PAGE电泳结果见图5)
将得到的粗酶液进行酶活检测，检测结果为：含有重组载体pHY-SPYojL-amyS、pHY-SPRpmG-amyS、pHY-SPAspB-amyS、pHY-SPNprE-amyS、pHY-SPAprE-amyS、pHY-SPYqxI-amyS、pHY-SPYwgB-amyS、pHY-SPAmyE-amyS的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5的酶活分别为732.1U/mL、334.3U/mL、315.1U/mL、236.1U/mL、257.5U/mL、168.3U/mL、188.3U/mL、206.4U/mL；
含有重组载体pHY-SPYojL-amyS、pHY-SPRpmG-amyS、pHY-SPAspB-amyS、pHY-SPNprE-amyS、pHY-SPAprE-amyS、pHY-SPYqxI-amyS、pHY-SPYwgB-amyS、pHY-SPAmyE-amyS的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的酶活分别为328.3U/mL、314.3U/mL、215.1U/mL、206.1U/mL、148.3U/mL、128.4U/mL、126.6U/mL、152.4U/mL；
含有重组载体pHY-SPYojL-amyS、pHY-SPRpmG-amyS、pHY-SPAspB-amyS、pHY-SPNprE-amyS、pHY-SPAprE-amyS、pHY-SPYqxI-amyS、pHY-SPYwgB-amyS、pHY-SPAmyE-amyS的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K1285的分别酶活为328.6U/mL、204.2U/mL、165.3U/mL、136.1U/mL、127.5U/mL、108.3U/mL、106.3U/mL、122.4U/mL。
由上述结果可知：连接有信号肽SPYojL的枯草芽孢杆菌工程菌表达α-淀粉酶的活性最高，且用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5表达α-淀粉酶的活性最高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌
<160> 31
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagaaaaa agattacgtt agcatgcaag acatgcggaa accgtaatta tacgacaatg 60
aagagctctg catcagcg 78
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaaaaga agattgtagc cggcttggct gtttctgcag ttgttgggtc gtcgatggcc 60
gcagcacccg cggaagca 78
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaactgg caaaaagagt atccgcatta acaccatcaa ccacactggc aatcacagcg 60
aaagcg 66
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag tttatcaatc 60
agcctgccag gtgttcaggc t 81
<210> 5
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60
gcgttcagca acatgtctgt gcaggct 87
<210> 6
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60
gcaggaggcg caactcaagc gtttgcg 87
<210> 7
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgaaaatga aatcaggaat ggagcaggcg gtttctgtgc tgctgttact gtcacggctg 60
ccggtacagg ct 72
<210> 8
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60
tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgct 99
<210> 9
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggcagccc cgttcaatgg caccatgatg cagtacttcg agtggtactt accggaccgc 60
ggtacactgt ggaccaaagt tgccaacgag gcaaacaacc tgagcagcct gggcatcagc 120
gccttatggc tgcctccggc ctataaaggc accagtcgta gtgacgtggg ctatggcatg 180
tacgacctgt atgacttagg cgagttcaat caaaagggca cagtgcgcac caagtactgc 240
accaaggccc agtacctgca agccattcaa gccgcccacg ccgcaggcat gcaagtgtat 300
gccgatgtgg tgttcgatca caagggcggc gccgatggta cagaatgggt ggatgccgcg 360
gaggtgaacc cgagcgaccg caaccaggag attagcggca cctaccagat ccaggcctgg 420
accaaattcg acttcccggg ccgcggcaac acatacagca gcttcaagtg gcgctggtac 480
cactttgatg gcgtggattg ggacgaaagc cgtaagctga gccgcatcta caagtttcgt 540
ggcaaggcct gggactggga ggtggatacc gagttcggta actacgatta cttaatgtat 600
gcagatctgg acatggacca cccggaggtg gtgaccgagt taaagaactg gggtaaatgg 660
tatgttaaca ccaccaatat tgacggcttc cgcctggacg ccgttaagca tattaagttc 720
agcttcttcc ctgattggct gagctacgtg cgtagtcaga caggcaagcc tctgtttagc 780
gtgggcgagt actggagcta cgacattaac aagctgcata actacatcac caagaccgac 840
ggcacaatga gcctgtttga tgcccctctg cacaacaagt tctacaccgc cagcaagact 900
ggtggtgcct ttgacatgcg caccctgatg accaacaccc tgatgaaaga tcagccgacc 960
ctggccgtga ccttcgttga caaccatgat accgagccgg tgcaggcatt acagagctag 1020
gtggaccctt ggtttaagcc tctggcctac gccttcattc tgacccgcca agagggttac 1080
ccgtgtgtgt tctacggtga ctactacggt attccgcaat ataacattcc tagcctgaag 1140
agcaagatcg acccgctgct gatcgcccgt cgtgactatg cctacggtac acagcacggc 1200
tatctggacc acagcgacat cattggctgg acccgtgagg gtggcaccga gaagcctgac 1260
agcggtttag cagcactgat caccgacggc cctggtggca gcaaatggat gtacgtgggc 1320
aagcagcatg ccggcaaggt gttctatgac ctgacaggca atcgcagcga taccgtgacc 1380
atcaacagtg acggctgggg cgaattcaag gttaatggtg gcagcgtgag tgtgtgggtt 1440
ccgcgctaa 1449
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcaaataagg agtgtcaaga atggcagccc cgttcaatgg 40
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtttttttat taccaagctt ttagcgcgga acccacacac t 41
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcttgacact ccttatttga ttttttg 27
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aagcttggta ataaaaaaac acctc 25
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcaaataagg agtgtcaaga atgaaaaaga agattgtagc cg 42
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccattgaacg gggctgccat tgcttccgcg ggtgctgcgg 40
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcaaataagg agtgtcaaga atgagaaaaa agattacgtt ag 42
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccattgaacg gggctgccat cgctgatgca gagctcttca t 41
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcaaataagg agtgtcaaga atgaaactgg caaaaagagt at 42
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccattgaacg gggctgccat cgctttcgct gtgattgcca gt 42
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcaaataagg agtgtcaaga atgggtttag gtaagaaatt gt 42
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ccattgaacg gggctgccat agcctgaaca cctggcaggc t 41
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tcaaataagg agtgtcaaga atgagaagca aaaaattgtg gat 43
<210> 23
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ccattgaacg gggctgccat agcctgcaca gacatgttgc tga 43
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcaaataagg agtgtcaaga atgtttaaga aattactttt agcaa 45
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ccattgaacg gggctgccat agctttggca tgtccatcca 40
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
tcaaataagg agtgtcaaga atgaaaatga aatcaggaat ggag 44
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ccattgaacg gggctgccat agcctgtacc ggcagccgtg ac 42
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tcttgacact ccttatttga ttttttg 27
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
atggcagccc cgttcaatgg caccatga 28
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
atcaaataag gagtgtcaag a 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gccattgaac ggggctgcca t 21

Claims (10)

1.一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、信号肽基因以及表达载体；所述目的基因为α-淀粉酶基因；所述信号肽基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8；所述表达载体为pHY300PLK；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2.如权利要求1所述的一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述目的基因为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因。
3.如权利要求1或2所述的一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)K1285；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016536，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
4.一种生产α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1-3任一所述的一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌。
5.如权利要求4所述的一种生产α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-3任一所述的一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中培养，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中培养。
6.如权利要求4或5所述的一种生产α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-3任一所述的一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8-10h，得到种子液，然后将种子液接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h。
7.如权利要求4-6任一所述的一种生产α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述种子培养基为的成分包含8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
8.如权利要求4-7任一所述的一种生产α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含20～25g/L的酵母浸膏、5～10g/L的大豆蛋白胨以及4～6g/L的甘油；所述发酵培养基的初始pH为6～7。
9.应用权利要求1-3任一所述的一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌或权利要求4-8任一所述的一种生产α-淀粉酶的方法制备得到的α-淀粉酶。
10.权利要求1-3任一所述的一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌或权利要求4-8任一所述的一种生产α-淀粉酶的方法在制备α-淀粉酶、水解淀粉、制备糊精、制备低聚糖、制备麦芽糖以及制备葡萄糖方面的应用。
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