CN102367448A - 一种高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的构建方法，其特征是根据NCBI公布的基因序列设计引物，在下游引物上添加了组氨酸序列，以Bacillus subtilis JNA染色体为模板克隆得到的β-甘露聚糖酶基因，用BamH I和Mlu I对PCR产物和质粒pMA5双酶切，利用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，转化感受态Bacillus subtilis 168菌株，获得重组菌株BPM1003，将离心后的发酵液通过Ni-NTA柱一步纯化，得到了纯的β-甘露聚糖酶，其酶活力达到3768.7u/ml，比酶活达到4579.2u/mg。
Description
技术领域
发明涉及一种高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的构建方法，属于分子生物学和基因工程领域。
技术背景
β-甘露聚糖酶(β-mannanase EC3.2.1.78)是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖，半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等，β-甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物。β-甘露聚糖酶可消除食料中甘露聚糖的抗营养作用，改善饲料的营养价值，以及配合其他的酶(木聚糖酶、蛋白酶)进一步提高家畜的生产性能。是一种很有开发前景的新型饲料添加剂。此外，β-甘露聚糖酶在食品、保健、医药、造纸、纺织、石油开采和生物技术等方面有很大的应用价值。
利用产酶的微生物，采用基因工程技术进行酶基因的克隆并使其高效表达，然后采用发酵技术大规模生产是国内外酶制剂研究的热点领域，但高效表达的产物在分离纯化的过程中依然存在困难，传统的分离纯化过于复杂，给工业化带来额外的成本支出。
枯草芽孢杆菌作为一种外源表达的宿主菌被广泛的应用到基因的克隆及过量的表达，本发明是根据NCBI公布的基因序列设计引物，在下游引物上添加了组氨酸序列，克隆得到的β-甘露聚糖酶基因manA2a与表达载体pMA5连接，转化感受态Bacillus subtilis 168菌株，获得重组菌株命名为BPM1003，成功构建了一株高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶基因工程菌株命名为BPM1003，实现了β-甘露聚糖酶的高效表达同时由于含有His-Tag而利于β-甘露聚糖酶的分离纯化。
发明内容
本发明主要研究内容：利用分子生物学技术获得含有组氨酸序列的β-甘露聚糖酶基因，将其连与表达载体上转化枯草芽孢杆菌，成功构建基因工程菌株。在此基础上，转化Bacillussubtilis 168，构建了一株高效表达的β-甘露聚糖酶基因工程菌株命名为BPM1003，利用亲和层析法对表达的β-甘露聚糖酶通过Ni-NTA株纯化，成功得到了纯的β-甘露聚糖酶，经测定纯化后的酶活力为3768.7u/ml，并对酶学性质进行了研究，以便为酶的应用提供理论基础。
本发明的技术方案：
从Bacillus subtilis JNA(保藏号CTCC M 2009200)中提取染色体作为模板，根据设计好的引物及提前设计好的PCR扩增条件和扩增体系进行PCR，利用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。用PCR回收产物和质粒pMA5进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收双酶切产物，利用T4DNA连接酶16℃过夜连接重组质粒pMA5-manA2a，用连接产物转化感受态枯草芽孢杆菌168，挑取阳性转化子到10ml液体LB培养基中，37℃摇床培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20℃保藏备用，即成功构建了基因工程菌BPM1003。将冻管保藏的基因工程菌BPM1003按1％的接种量转接到10ml液体LB培养基中，37℃摇床培养过夜。次日按2％的接种量转接至50ml液体LB培养基中37℃摇床培养。发酵完成后，将发酵液4℃8000r/min离心5min后弃上沉淀，将上清通过亲和层析得到纯酶液，粗酶液蛋白含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。酶活的测定采用DNS法，经测定纯酶液的酶活力为3768.7u/ml，比酶活是4579.2u/mg，说明一株易于纯化的β-甘露聚糖酶基因工程菌株构建成功。
本发明的有益效果：β-甘露聚糖酶可消除食料中甘露聚糖的抗营养作用，改善饲料的营养价值，以及配合其他的酶(木聚糖酶，蛋白酶)进一步提高家畜的生产性能，是一种很有开发前景的新型饲料添加剂。本发明构建了一株β-甘露聚糖酶基因工程菌BPM1003，酶活力达到897.3u/ml，是原始菌株的11.7倍，实现了β-甘露聚糖酶高效表达；利用亲和层析法对表达的β-甘露聚糖酶通过Ni-NTA柱一步纯化，经测定纯化后的酶活力为3768.7u/ml，SDS-PAGE蛋白电泳分析显示成功得到了纯的β-甘露聚糖酶，并对酶学性质进行了研究，以便为酶的应用提供理论基础。
附图说明：
图1β-甘露聚糖酶manA的基因克隆验证。1：DL 2000degest marker；2：β-甘露聚糖酶基因PCR产物。
图2重组质粒pMA5-manA酶切验证。M1：γ-Hind III degest marker；M2：DL 2000degestmarker。
图3亲和层析Ni-NTA柱纯化得到纯酶SDS-PAGE电泳图。1：Bacillus subtilis 168；2：BPM1003；3：β-甘露聚糖酶；4：Protein Marker。
具体实施方式：
实施例1：β-甘露聚糖酶基因的克隆
[1]根据NCBI公布的基因序列，利用DNAMAN软件设计引物P1和P2。
P1：5’-ATCGGATCCATGTTTAAGAAACATACGAT-3’
P2：5’-GGCACGCGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAACGATTGGCGTTA-3’
Bacillus subtilis JNA(保藏号CTCC M 2009200)染色体DNA的提取，提取方法：用接种环从新鲜的Bacillus subtilis JNA平板上挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃振荡过夜，次日取400μl菌液，8000r/min离心3min，弃上清，用0.5ml TE洗涤一次细胞，离心弃上清，再用0.5ml TE充分悬浮细胞，加入50μl 10mg/ml的溶菌酶液，混匀，37℃水浴2-3h，加入100μl10％SDS，混匀，37℃保温30min，加入50μl10mg/ml的蛋白酶K，65℃反应3h，期间每隔半小时混匀一次，加入等体积饱和酚，混匀，8000r/min离心5min，上清移入另一个离心管中，往上清液中加入等体积的饱和酚再次抽提，转移上清到另一离心管中，加入等体积氯仿抽提两次，8000r/min离心5min，将上清移入另一管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠，室温放置5min，8000r/min离心2min，弃上清，用70％乙醇悬浮细胞，离心，倒掉液体，倒置于吸水纸上，室温晾干，用50μl TE溶解，-20℃保藏备用。
[2]以Bacillus subtilis JNA基因组DNA为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃，5min，1个循环；94℃，50s，56℃，1min 30s，72℃，1min 30s，35个循环；72℃，10min，1个循环；15℃，10min，1个循环。扩增体系：ddH2O 17μl，模板2μl引物P10.5μl，引物P20.5μl，dNTP Mix 2μl，extaq-buffer 2.5μl，ex-Taq酶0.5μl。利用琼脂糖凝胶回收盒对目的基因进行回收，并进行琼脂糖凝胶电泳验证(如图1)。
实施例2：重组质粒pMA5-manA2a的构建及转化Bacillus subtilis 168
构建重组载体pMA5-manA2a，将实施例1[2]中得到的β-甘露聚糖酶基因PCR产物与质粒pMA5同时用BamH I和Mlu I双酶切，利用凝胶回收盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7.5μl，pMA5酶切产物0.5μl，T4DNA连接酶buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pMA5-manA2a转化到感受态Bacillus subtilis168，转化方法：挑取Bacillus subtilis 168接种于5ml LB培养，37℃摇床培养过夜；取100ul过夜培养的菌液，接种于用50ml离心管配好的5ml SPI培养基中，37℃摇床培养，当菌株生长到对数末期时，快速取200μl接种到2ml SPII培养基中，37℃100r/min摇床培养1.5h加20ul100x EGTA溶液，于37℃100r/min摇床培养10min，用1.5ml离心管分装成500ul每管，分别向管中加入质粒，轻轻摇匀于37℃100r/min摇床培养30min，将离心管转移到250r/min摇床培养1.5h，以4000r/min离心收集菌体，弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于相应的抗性平板，37℃培养过夜，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证(如图2)获得因工程菌株BPM1003。
实施例3：产β-甘露聚糖酶重组菌株BPM1003的表达检测及纯化
将得到的产β-甘露聚糖酶重组菌株BPM1003按2％的接种量接到新的50ml LB液体培养基中，取发酵液，4℃8000r/min离心5min后弃上沉淀，将上清通过Ni-NTA柱得到纯酶液，取得到的纯酶液10ul加相应的上样Marker作为样品进行SDS-PAGE检测，其中SDS-PAGE使用5％的分离胶和15％的浓缩胶，采用不连续垂直电泳，用考马斯亮蓝R250染色，以含有空载质粒pMA5的Bacillus subtilis 168做空白对照(如图3)。经测定纯化后的酶活力为3768.7u/ml，是粗酶液酶活力的4.2倍，比酶活达到4579.2u/mg。
Claims (4)
1.一种高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的构建方法，其特征是根据已知基因序列设计引物，并在引物下游添加组氨酸标签序列，从本实验室筛选菌株枯草芽孢杆菌JNA(保藏号CTCC M 2009200)染色体中克隆得到的含信号肽同时含有组氨酸标签的β-甘露聚糖酶基因manA2a，获得重组质粒pMA5-manA2a，将该重组质粒转入到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168菌株中，获得一株高效表达且易于纯化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株；
2.如权利要求1所述，其特征是根据NCBI公布的基因序列设计引物，并在下游引物上添加了组氨酸序列，用该引物在特定条件下扩增β-甘露聚糖酶基因得到1099bp的特异性条带，将其克隆到表达载体pMA5上，以枯草芽孢杆菌168为表达宿主，实现β-甘露聚糖酶基因的高效表达且易于纯化；
(1)β-甘露聚糖酶基因基因的克隆
其特征是根据NCBI公布的全基因组核酸序列中β-甘露聚糖酶基因序列，设计引物P1和P2
P1：5’-ATGTTTAAGAAACATACGAT-3’Bam H I
P2：5’-TTAACGCCAATCGTTGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3’Mlu I
以枯草芽孢杆菌6-7总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增。
(2)构建重组质粒pMA5-manA2a
将质粒pMD18-manA2a和质粒pMA5分别用相应酶切位点酶切，连接。
(3)重组质粒pMA5-manA2a转化Bacillus subtilis 168
重组质粒pMA5-manA2a转化Bacillus subtilis 168，其特征是根据权利要求1中所述方法得到的重组质粒pMA5-manA2a转化感受态Bacillus subtilis 168菌株，利用卡那霉素抗性平板挑取阳性菌落，转接到LB培养基中，37℃发酵培养12h，提取转化子质粒，酶切验证，获得重组菌株命名为Bacillus subtilis BPM1003。
3.β-甘露聚糖酶的表达及检测，其特征在于将权利要求1中获得的重组枯草芽孢杆菌发酵液离心后，取上清测定β-甘露聚糖酶酶活力，与原始菌株进行比较，其特征是重组菌高效表达了β-甘露聚糖酶，经检测其粗酶液的酶活可达到897.3u/ml，是原始菌株酶活力的11.7倍。
4.β-甘露聚糖酶的纯化，其特征在于将权利要求2中的发酵液离心后上清直接通过Ni-NTA一步柱纯化，成功的得到了纯的β-甘露聚糖酶，实现了β-甘露聚糖酶易于纯化的目的，经测定纯化后的酶活力为3768.7u/ml，是粗酶液酶活力的4.2倍，比酶活达到4579.2u/mg。
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