CN104046665A

CN104046665A - 一种海藻糖的生产方法

Info

Publication number: CN104046665A
Application number: CN201410322484.1A
Authority: CN
Inventors: 谢定; 盛敏; 谢易真; 俞健; 盛灿梅
Original assignee: Changsha University of Science and Technology
Current assignee: Changsha University of Science and Technology
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2014-07-08
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2034-07-08
Also published as: CN104046665B

Abstract

本发明涉及一种利用基因工程菌将麦芽糖转化成海藻糖的方法。其技术方案是将天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor,AS4.1061）海藻糖合成酶基因展示在毕赤酵母表面构建具有酶活力的基因工程菌，通过该基因工程菌的扩增培养使海藻糖合成酶产量大幅增加，将该展示了海藻糖合成酶的基因工程菌加入麦芽糖或淀粉转化的麦芽糖浆中于25~45℃下反应1~8h后，可将麦芽糖转化为海藻糖，转化麦芽糖的产物中海藻糖含量可达80%，且该基因工程菌经分离、洗涤、脱水处理后可重复用作催化剂。从而克服了海藻糖合成酶难以大量生产、不易提取和难以固定化重复利用的技术困难。

Description

一种海藻糖的生产方法

技术领域

本发明属于食品加工和生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程菌将麦芽糖转化成海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖（Trehalose）和还原性二糖麦芽糖是同分异构体，它是由两分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷键相连而成的非还原性二糖，由于其具有对生物体优良的抗逆保护作用等优良性能而被誉为“生命之糖”和“二十一世纪的新型糖类”，其大规模制造方法受到广泛关注；专利公布号为CN 102154326 A的中国专利报道了一种将天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor, AS 4.1061）海藻糖合成酶（Trehalose synthase, TS）基因克隆到大肠杆菌中扩增培养进而破壁取酶将麦芽糖转化为海藻糖的生产方法，该方法虽然比之前有很大进步，但明显存在需要破壁取酶、酶量不多以及所取酶难以重复利用的不足。

另一方面，展示酶的酵母菌细胞具有固定化酶可重复使用的优点，又具有制备简单，可高密度培养获得大量菌体，成本较低的特点，因而自上世纪末问世以来，发展迅猛，已有许多种蛋白或酶被成功表达的报道，该技术关键在于能否构建展示在酵母表面具所需活性蛋白或多肽且能扩增生产的基因工程菌，目前尚未见酵母菌展示海藻糖合成酶的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是构建在酵母菌表面展示有活性的海藻糖合成酶基因工程菌，从而克服海藻糖合成酶难以大量生产、不易提取和难以固定化重复利用的技术难题。

本发明采取的技术方案是：在查阅大量资料的基础上选择一些活性高的海藻糖合成酶序列委托生物公司进行序列合成和多个相关基因工程菌构建，然后通过多次验证实验，构建了序列为SEQ NO1天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因展示在毕赤酵母表面的基因工程菌，通过该基因工程菌的发酵培养获得大量酵母菌展示海藻糖合成酶，将该展示了海藻糖合成酶的酵母菌加入麦芽糖中反应，即可将麦芽糖转化为海藻糖。

其中的基因工程菌具体而言可以这样构建：将序列为SEQ NO1的天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因克隆在pUC57载体上，进一步亚克隆到pPIC9K载体中，再转化到毕赤酵母GS115，得到展示了天蓝色链霉菌海藻糖合成酶的毕赤酵母，然后依次在YPD和BMGY培养基中分别扩增培养16~32 h及96~120 h，离心脱水或冷冻干燥即得到展示天蓝色链霉菌海藻糖合成酶毕赤酵母基因工程菌。

以重量计将该展示了海藻糖合成酶的酵母菌1~6 份（湿重）加入100份麦芽糖中于25~45℃下反应1~6 h后，可将麦芽糖或淀粉制备的麦芽糖浆转化为海藻糖。反应后将海藻糖浆和酵母菌分离即可得海藻糖产品和酵母菌，该酵母菌通过冲洗过滤后可重复用来催化麦芽糖转化为海藻糖。

本发明与现有技术相比，转化麦芽糖的产物中海藻糖含量可达80%，反应后分离所得基因工程菌通过冲洗过滤后可重复用来催化麦芽糖转化为海藻糖，重复使用6次后，其酶活力仍保持在81.8%，因而大大降低了生产成本。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1 毕赤酵母展示天蓝色链霉菌海藻糖合成酶

1、天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因（Trehalose synthase，TS）合成委托生物公司（本例由南京金斯瑞生物科技有限公司）完成，基因克隆在pUC57载体上（pUC57-TS），DNA序列如SEQ NO1所示。

2、 TS亚克隆到pPIC9K载体中

分别将pUC57-TS和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切，酶切反应体系分别如下：

pUC57-TS质粒 34 ul

10* buffer 4 ul

Eco RI 1 ul

Not I 1 ul

总共40ul体系，

pPIC9K质粒 6 ul

10* buffer 2 ul

Eco RI 1 ul

Not I 1 ul

ddH₂O 10 ul

总共20 ul体系，

分别混匀后放在37℃水浴锅中反应4 h。

3、采用胶回收试剂盒回收目的基因片断TS和pPIC9K载体片断，分别用20 ul水洗脱，

之后用T4 DNA Ligase进行连接反应，反应体系如下：

TS片段 3 ul

pPIC9K片段 1 ul

10* T4 Ligase buffer 2 ul

T4 Ligase 1 ul

ddH₂O 13 ul

总共20 ul体系；22℃过夜连接，之后转化到DH5a感受态细胞中，涂布在含有amp和kana抗性的LB（Miller broth (1%NaCl)：1% peptone, 0.5% yeast extract, and 1% NaCl）固体培养基上进行37℃过夜培养；挑取克隆进行摇菌，质粒抽提，并进行Eco RI和Not I双酶切鉴定；

酶切反应体系如下：

pPIC9K- TS 8 ul

10* buffer 2 ul

Eco RI 1 ul

Not I 1 ul

ddH2O 8 ul

总共20 ul体系，

混匀后放在37℃水浴锅反应4 h，成功构建pPIC9K-TS载体。

4、pPIC9K-TS转化到毕氏酵母GS115中

1）、试剂

（1） 1M LiCl：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；

（2） 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装；

（3） 2 mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存；注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； 2）、毕氏酵母的转化

（1）煮沸1 ml鲑鱼精DNA 5 min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；

（2）将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；

（3）对于每一个转化，按以下顺序加入：

50% PEG3350 240 ul

1 M LiCl 36 ul

2 mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25 ul

5～10 ug/50ul H₂O 质粒DNA 50 ul

（4）剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1 min）；

（5）30℃水浴孵育30 min；

（6）42℃水浴热休克20～25 min；

（7）6000～8000 rpm离心收集酵母菌体；

（8）重悬酵母于1ml YPD培养基（1%酵母膏，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖），30℃摇床孵育；

（9）1～4 h后，取25～100 ul菌液铺YD选择性培养基平板(1.67%YNB+2%葡萄糖+1%琼脂粉)，于30℃培养2～3天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板，30℃培养至转化子出现）；

3）备注：

（1）YPD、YD、BMGY培养基均可从化学试剂商店订购；

（2）GS115是组氨酸缺陷性菌，因此在YD培养基上不能生长，只有成功转化了pPIC9K的GS115菌才能在YD培养基上生长。

实施例2 基因工程菌扩增培养

1、从平板中挑取单菌落，接种于YPD培养基中，30℃，250 rpm培养过夜；

2、按1%的接种量转移到新鲜的BMGY培养基中，30℃，250 rpm培养5 d，每隔24 h加甲醇诱导，收集发酵菌体，用pH8.0缓冲液洗涤3次，用少量缓冲液重悬，即得重组海藻糖合成酶基因工程菌菌液，将其离心脱水或冷冻干燥备用。

实施例3 利用麦芽糖浆生产海藻糖

将纯麦芽糖，用pH7.0的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液制成含30%麦芽糖的反应底物，pH7.0，取1升配制好的反应底物放入不锈钢反应罐中，控制温度为30℃左右，按6%糖液重量（体积约0.03升）计加入实施例2中的展示了海藻糖合成酶的基因工程菌菌剂，反应4 h后，然后用HPLC对反应产物进行各种糖含量的分析，结果为海藻糖23.2%、麦芽糖4.9%、葡萄糖1.4%，按1升30%的麦芽糖+0.03升酶液估算底物浓度为29.1%，总转化率为23.2/29.1=79.7%，即转化麦芽糖的产物中海藻糖含量可达80%；反应后将海藻糖和酵母菌分离即可得海藻糖产品和酵母菌，该酵母菌通过冲洗过滤后可重复用来催化麦芽糖转化为海藻糖，重复使用6次后，其酶活力如表1所示，仍保持在81.8%：

表1 重复使用后酵母展示海藻糖合成酶的相对酶活力

使用次数	1	2	3	4	5	6
							酶活力（%）	100	96.8	93.1	89.3	85.7	81.8

注：以反应产物中的海藻糖含量来代表酶活力。

实施例4 利用淀粉转化的麦芽糖浆生产海藻糖

将碎大米筛洗浸泡1~2 h，水磨到60~70目细度，调成35%浓度的乳，调节pH到6.2~6.4，加入0.2%碎米原料重的CaCl₂，加入α-淀粉酶制剂，其用量为7~8U/g，混匀后引入高温液化桶中，在92℃左右液化，由液化桶放出后保温约20 min达到葡萄糖值15~18，降温到约62℃，加入β-淀粉酶制剂，其用量为18~20U/g，在60℃糖化约3 h，葡萄糖值上升到35~40，糖化终止，将其用pH7.0的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液制成含30%麦芽糖的反应底物，pH7.0，取1升配制好的反应底物放入不锈钢反应罐中，待温度为35℃左右时，按6%糖液重量（体积约0.03升）计加入实施例2中的展示了海藻糖合成酶的基因工程菌菌剂，反应4 h后，然后用HPLC对反应产物进行各种糖含量的分析，结果为海藻糖22.6%、麦芽糖5.1%、葡萄糖1.5%，按1升30%的麦芽糖+0.03升酶液估算底物浓度为29.1%，总转化率为22.6/29.1=77.7%。

Claims

1.一种海藻糖的生产方法，包括：利用海藻糖合成酶将麦芽糖转化为海藻糖，其特征是：将序列为SEQ NO1的天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因展示在毕赤酵母表面构建酵母展示海藻糖合成酶基因工程菌，接着将其扩增培养，然后将该扩增培养的基因工程菌加入麦芽糖浆或淀粉制备的麦芽糖浆中，即可将麦芽糖转化为海藻糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：展示了天蓝色链霉菌海藻糖合成酶的毕赤酵母基因工程菌是这样制作的：将序列为SEQ NO1的天蓝色链霉菌海藻糖合成酶基因克隆在pUC57载体上，进一步亚克隆到pPIC9K载体中，再转化到毕赤酵母GS115，得到展示了天蓝色链霉菌海藻糖合成酶的毕赤酵母，然后依次在YPD和BMGY培养基中分别扩增培养16~32 h及96~120 h，离心脱水或冷冻干燥即得到展示天蓝色链霉菌海藻糖合成酶毕赤酵母基因工程菌菌体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：以重量计将该展示了海藻糖合成酶的毕赤酵母工程菌1~6 份（湿重）加入100份反应底物麦芽糖浆中于25~45℃下反应1~8 h后，可将麦芽糖转化为海藻糖；反应后将海藻糖浆和酵母菌分离即可得海藻糖产品和展示海藻糖合成酶毕赤酵母基因工程菌，该基因工程菌通过冲洗过滤后可重复用来催化麦芽糖转化为海藻糖。