CN102286443B - 生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡葡萄糖淀粉酶方法。属生物技术领域。首先从解淀粉假单胞杆菌基因组中扩增异淀粉酶基因，从地衣芽孢杆菌基因组中扩增α淀粉酶基因，从大麦基因组中扩增α淀粉酶基因，从黑曲霉菌基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因；分别构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌表达载体、毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体；构建工程菌：将枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌基因组，将毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组，将酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母基因组；发酵工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。这些酶的混合应用能显著地加强水解淀粉为葡萄糖的作用。生产混合酶的优越性在于，将常规需要几道工序分别生产异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，转变为一道工序生产这三种酶的混合酶，起到显著地减少能耗和降低生产成本的作用。

Description

生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。 

背景技术

淀粉必须水解为葡萄糖才能被转化为乙醇，人体不能直接吸收淀粉，但是能直接吸收葡萄糖。每年世界上需要生产大量的异淀粉酶、α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶而应用于将淀粉转化于葡萄糖的饴糖、酿酒和美食等行业。 

淀粉由直链和支链组成。支链由α-1，6糖苷键连接，而直链的糖分子之间由α-1，4糖苷键连接。在天然的淀粉质原料中，支链淀粉的含量约占70％～95％，而直链淀粉的含量≤30％。异淀粉酶(Isoamylase，E.C.3.2.1.68)能专一性地分解支链淀粉中分支点的α-1，6糖苷键，将支链淀粉转化为直链淀粉，因此又称为脱支酶。α-淀粉酶(α-amylase，EC.3.2.1.1)是一种能从直链淀粉分子内部切开α-1，4糖苷键的内切酶，产物包括麦芽糖、麦芽三糖和其它寡聚糖。葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，E.C.3.2.1.3)，简称糖化酶。葡萄糖淀粉酶能催化淀粉水解为葡萄糖，其葡萄糖主要是来源于直链淀粉。因为它主要是水解直链淀粉的α-1.4糖苷键，岁能水解α-1，6糖苷键，但其水解α-1，6糖苷键比速率仅为作用于α-1，4糖苷键的0.2％。 

若在淀粉中只加异淀粉酶那么只能剪切淀粉的支链，其产物是直连淀粉而不是葡萄糖；若在淀粉中加入α淀粉酶，其产物是麦芽糖、麦芽三糖和α糊精而不是葡萄糖；若在淀粉中加入葡萄糖淀粉酶，获得的葡萄糖产物主要是来自于直链淀粉。根据异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的作用机理，若异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶联合应用，那么将能充分地、高效地将淀粉转化为葡萄糖。 

当前市面上只有这些酶的单种酶，尚没有混合表达这些酶的菌种和混合酶产品。枯草芽孢杆菌，毕赤酵母和酿酒酵母都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵的大规模地低能耗的酶的生产。 

发明内容

本发明根据异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有联合水解淀粉的作用，市场上还没有异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的混合酶产品，枯草芽孢杆菌，毕赤酵母和酿酒酵母是常用于表达外源蛋白的宿主菌，而通过分子生物学技术将来自解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶、大麦的α淀粉酶和黑曲霉菌的葡萄糖淀粉酶基因重组于枯草芽孢杆菌基因组、毕赤酵母基因组和酿酒酵母基因组。用含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌，毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。 

本发明所采用的技术方案是： 

1.克隆酶基因：应用PCR技术，从解淀粉假单胞杆菌基因组中扩增异淀粉酶基因，从地衣芽孢杆菌基因组中扩增α淀粉酶基因，从大麦基因组中扩增α淀粉酶基因，从黑曲霉菌基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因； 

2.克隆构建表达载体的相关原件(启动子，重组序列，信号肽，转录终止序列和抗性基因) 

3.构建如附图1，附图2和附图3的三种表达载体。 

4.通过表达载体将异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌，毕赤酵母和酿酒酵母基因组。即构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌，毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌。 

5.发酵含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌、毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。 

本发明构建含异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶优点体现于： 

(1)针对异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶具有协同水解淀粉生成葡萄糖的特性，异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶混合酶的添加能达到显著地加强水解淀粉为葡萄糖的作用，而市场上需求这种混合酶产品。本发明通过构建工程菌，应用工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，一方面提供混合酶的新产品，另一方面取代分别发酵含异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶，发酵含α淀粉酶基因菌株生产α淀粉酶，发酵含葡萄糖淀粉酶基因的菌株生产葡萄糖淀粉酶。即用一个发酵工序生产整个水解淀粉生成葡萄糖酶系的酶取代用多个工序分别生产异淀粉酶，α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。达到节省了原材料、能耗和人力资源的作用。 

(2)枯草芽孢杆菌，毕赤酵母和酿酒酵母在生产重组蛋白方面各具特征，本发明分别构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌，毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌，为其重组酶生产提供多种宿主选择。 

附图说明

附图1.含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体 

附图2含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体 

附图3含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体 

具体实施方式

下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1：构建枯草芽孢杆菌工程菌，生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 

1.1构建枯草芽孢杆菌表达载体 

1.1.1构建克隆载体 

DNA合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点，在其序列的两端形成碱基互补。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pBPA。 

1.1.2获取基因 

①PCR扩增异淀粉酶基因 

提取解淀粉假单胞杆菌基因组DNA，应用引物(5’CGGATATC GCCATCAACAGCATGAGC3，；5，CGGATATCGGCTACTTGGAGATCAACAG3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是异淀粉酶基因序列。 

②PCR扩增地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因(包括信号肽) 

提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，应用引物(5’Atgaaacaacaaaaacggct3，；5，ctatctttgaacataaattg3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列。 

③PCR扩增大麦的α淀粉酶基因(包括信号肽) 

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物(5’ATGGGGAAGAACGGCAGCCT3’，5’TCAGCTCCGTTGTAGTGTTGCCGCGGCACC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列。 

④PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因(包括信号肽) 

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物(5’atgtcgttccgatctcttct3’5’CTAccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。 

1.1.3分别构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架。 

①用PCR扩增巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。 

提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA，应用如下引物(5’GATCCATTATCGGTGAACCA3’；5’GGGAATACATTACGGCCGAT3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。 

②DNA序列合成法合成如下α因子信号肽： 

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC 

③DNA序列合成法合成如下DNA转录终止序列： 

GGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTTTAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTTCGAGAAGGATATTATTTCGAAATAAACCGTGTTGTGTAAGCTTGAAG 

④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列： 

CCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT 

⑤用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列 

应用常规方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用如下引物(5’gacgaacgctggcggcgtgc3；5’gcaccttccgatacggctacct3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组中的rDNA序列。 

⑥表达框架构建(启动子-信号肽-基因-转录终止序列)过程： 

A.含异淀粉酶基因的表达框架的构建： 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将异淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含异淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPA1。 

B.含地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将包含信号肽的地衣α淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPA2。 

C.含大麦α淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将包含信号肽的大麦α淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子下游；将转录终止序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含大麦α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPA3。 

D.含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将包含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPA4。 

⑦完成表达载体的构建 

A.将表达框架组装于同一个克隆载体。 

通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，分别切取pBPA2、pBPA3和pBPA4载体的表达框架，并将以上的这三套表达框架依次插入于pBPA1的多克隆位点。此载体称为pBPA1234. 

B.然后同样通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将DNA重组序列和G418抗性基因重组于pBPA1234载体的多克隆位点。构成含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体(附图1)。 

1.2构建含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌 

将含含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的表达载体转化枯草芽孢杆菌基因组，用载体上的抗性基因筛选重组子。用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别用异淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因、大麦α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因已经重组于重组子的基因组。其重组子即含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌。 

1.3生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌接种于含淀粉的液体培养基(含10％木薯淀粉，0.5％NaCl，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中发酵2d，离心取上清进行酶活性分析。并应用同样的条件对如下对照菌株进行发酵：重组异淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌；重组α淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌；重组葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌。 

含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌表达的重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的活性分析见下表。 

说明： 

(1)支链淀粉含量的测定采用常规的酶法测定方法。 

(2)残余淀粉含量的测定 

①标准曲线的制作：取若干个50mL的比色管，各加入100μI一系列不同浓度的可溶性淀粉溶液(0-4％)，再分别加入100μL0.4％I₂-KI溶液，加去离子水定容至25mL刻度处，以可溶性淀粉溶液的浓度为0％的一管为空白对照，测定其它管OD₆₃₀的值。以可溶性淀粉浓度为横坐标，以OD₆₃₀为纵坐标，制作可溶性淀粉浓度与OD₆₃₀值的关系的标准曲线。 

②培养液中残余淀粉含量的测定 

待测样品的获得：将1mL酒精发酵的培养混合物稀释为10mL，沸水浴使淀粉溶解，10,000rpm离心数秒，取上清液混匀。 

取若干个50mL的比色管，加入100μL待测样品。各管分别加入100μL0.4％I₂-KI溶液，加去离子水至25mL刻度处，以去离子水代替培养液的上清液的一管为空白对照，测定其它管OD₆₃₀的值。从标准曲线上查出相应的淀粉含量。 

(3)葡萄糖含量测定采用常规的旋光测定法。 

实施例2： 

2.1构建毕赤酵母工程菌 

2.1.1构建克隆载体 

DNA合成含AMP基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点：，在其序列的两端形成碱基互补。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPCA。 

2.1.2获取基因 

①PCR扩增异淀粉酶基因 

提取解淀粉假单胞杆菌基因组DNA，应用引物(5’CG GATATC GCCATCAACAGCATGAGC3’；5’CGGATATC GGCTACTTGGAGATCAACAG3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是异淀粉酶基因序列。 

②PCR扩增地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因(包括信号肽) 

提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，应用引物(5’Atgaaacaacaaaaacggct3’；5’ctatctttgaacataaattg3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列。 

③PCR扩增大麦的α淀粉酶基因(包括信号肽) 

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物(5’ATGGGGAAGAACGGCAGCCT3’，5’TCAGCTCCGTTGTAGTGTTGCCGCGGCACC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列。 

④PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因(包括信号肽) 

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物(5’atgtcgttccgatctcttct3’5’CTAccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。 

2.1.3分别构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架。 

①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。 

应用RNA提取试剂盒提取毕赤酵母的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用如下引物(5’GGACTAGTCGATCCTTTTTTG3’，5’GGATCCTGTGTTTTGATAGTTG3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。 

②DNA序列合成法合成如下α因子信号肽： 

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC 

③DNA序列合成法合成如下DNA转录终止序列： 

GGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTTTAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTTCGAGAAGGATATTATTTCGAAATAAACCGTGTTGTGTAAGCTTGAAG 

④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列： 

CCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT 

⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列 

应用RNA提取试剂盒提取毕赤酵母的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用如下引物(5’aggttcacctacggaaaccttg3’；5’tgtctcaaagattaagccatgc3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。 

毕赤酵母的rDNA序列： 

⑥表达框架构建过程： 

A.含异淀粉酶基因的表达框架的构建： 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将异淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含异淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA1。 

B.含地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA2。 

C.含大麦α淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的 大麦α淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含大麦α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA3。 

D.含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA4。 

⑦完成表达载体的构建 

A.将表达框架组装于同一个克隆载体。 

通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，分别切取pPCA2、pPCA3和pPCA4载体的表达框架，并将以上的这三套表达框架依次插入于pPCA1的多克隆位点。此载体称为pPCA1234. 

B.然后同样通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将DNA重组序列和G418基因重组于pPCA1234载体的多克隆位点。构成含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图2)。 

2.2构建含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌 

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组，用载体上的抗性基因筛选重组子。用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别用异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因已经重组于重组子的基因组。其重组子即含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌。 

2.3生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌接种于含淀粉的液体培养基(含10％木薯淀粉，2％蛋白胨，1％酵母粉)中发酵2d，离心取上清进行酶活性分析。并应用同样的条件表达对照菌株：重组异淀粉酶基因的毕赤酵母；重组α淀粉酶基因的毕赤酵母；重组葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母。 

以上表达的重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的活性分析见下表。 

说明： 

(1)支链淀粉含量的测定采用常规的酶法测定方法。 

(2)残余淀粉含量的测定 

①标准曲线的制作：取若干个50mL的比色管，各加入100μL-系列不同浓度的可溶性淀粉溶液(0-4％)，再分别加入100μL 0.4％ I₂-KI溶液，加去离子水定容至25mL刻度处，以可溶性淀粉溶液的浓度为0％的一管为空白对照，测定其它管OD₆₃₀的值。以可溶性淀粉浓度为横坐标，以OD₆₃₀为纵坐标，制作可溶性淀粉浓度与OD₆₃₀值的关系的标准曲线。 

②培养液中残余淀粉含量的测定 

待测样品的获得：将1mL酒精发酵的培养混合物稀释为10mL，沸水浴使淀粉溶解，10,000rpm离心数秒，取上清液混匀。 

取若干个50mL的比色管，加入100μL待测样品。各管分别加入100μL 0.4％ I₂-KI溶液，加去离子水至25mL刻度处，以去离子水代替培养液的上清液的一管为空白对照，测定其它管OD₆₃₀的值。从标准曲线上查出相应的淀粉含量。 

(3)葡萄糖含量测定采用常规的旋光测定法。 

实施例3： 

3.1构建酿酒酵母工程菌 

3.1.1构建克隆载体 

DNA合成含AMP基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点：，在其序列的两端形成碱基互补。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pSCA。 

3.1.2获取基因 

①PCR扩增异淀粉酶基因 

提取解淀粉假单胞杆菌基因组DNA，应用引物(5’CG GATATC GCCATCAACAGCATGAGC3’；5’CGGATATC GGCTACTTGGAGATCAACAG3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是异淀粉酶基因序列。 

②PCR扩增地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因(包括信号肽) 

提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，应用引物(5’Atgaaacaacaaaaacggct3’；5’ctatctttgaacataaattg3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列。 

③PCR扩增大麦的α淀粉酶基因(包括信号肽) 

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物(5’ATGGGGAAGAACGGCAGCCT3’，5’TCAGCTCCGTTGTAGTGTTGCCGCGGCACC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列。 

④PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因(包括信号肽) 

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物(5’atgtcgttccgatctcttct3’5’CTAccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列。 

3.1.3分别构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架。 

①用PCR扩增酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。 

应用RNA提取试剂盒提取酿酒酵母的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用如下引物(5’TCGAGTTTATCATTATCAAT3’，5’TCGAAACTAAGTTCTTGGTG3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列。 

②DNA序列合成法合成如下α因子信号肽： 

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC 

③DNA序列合成法合成如下DNA转录终止序列： 

GGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTTTAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTTCGAGAAGGATATTATTTCGAAATAAACCGTGTTGTGTAAGCTTGAAG 

④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列： 

CCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT 

⑤从酿酒酵母基因组中PCR扩增rDNA序列 

应用RNA提取试剂盒提取酿酒酵母的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用如下引物(5’TGAACTAACACCTTTTGTGG3’；5’GCTAATACATGCTTAAAATC3’)进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是酿酒酵母基因组中的rDNA序列。 

⑥表达框架构建过程： 

A.含异淀粉酶基因的表达框架的构建： 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSCA载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pSCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将异淀粉酶基因序列重组于pSCA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止序列重组于pSCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含异淀粉酶基因的表达框架的载体称为pSCA1。 

B.含地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的α淀粉酶基因序列重组于pSCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止序列重组于pSCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA2。 

C.含大麦α淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pSCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的大麦α淀粉酶基因序列重组于pSCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子下游；将转录终止 序列重组于pSCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含大麦α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pSCA3。 

D.含葡萄糖淀粉酶基因表达框架的构建 

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的载体称为pSCA4。 

⑦完成表达载体的构建 

A.将表达框架组装于同一个克隆载体。 

通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，分别切取pSCA2、pSCA3和pSCA4载体的表达框架，并将以上的这两套表达框架依次插入于pSCA1的多克隆位点。此载体称为pSCA1234. 

B.然后同样通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将DNA重组序列和G418基因重组于pSCA1234载体的多克隆位点。构成含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体(附图3)。 

3.2构建含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的酿酒酵母工程菌 

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母基因组，用载体上的抗性基因筛选重组子。用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别用异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因已经重组于重组子的基因组。其重组子即含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的酿酒酵母工程菌。 

3.3生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶 

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的酿酒酵母工程菌接种于含淀粉的液体培养基(含10％木薯淀粉，2％蛋白胨，1％酵母粉)中发酵2d，离心取上清进行酶活性分析。并应用同样的条件表达对照菌株：重组异淀粉酶基因的酿酒酵母；重组α淀粉酶基因的酿酒酵母；重组葡萄糖淀粉酶基因的酿酒酵母。 

以上表达的重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的活性分析见下表。 

说明： 

(1)支链淀粉含量的测定采用常规的酶法测定方法。 

(2)残余淀粉含量的测定 

①标准曲线的制作：取若干个50mL的比色管，各加入100μL一系列不同浓度的可溶性淀粉溶液(0-4％)，再分别加入100μL 0.4％ I₂-KI溶液，加去离子水定容至25mL刻度处，以可溶性淀粉溶液的浓度为0％的一管为空白对照，测定其它管OD₆₃₀的值。以可溶性淀粉浓度为横坐标，以OD₆₃₀为纵坐标，制作可溶性淀粉浓度与OD₆₃₀值的关系的标准曲线。 

②培养液中残余淀粉含量的测定 

待测样品的获得：将1mL酒精发酵的培养混合物稀释为10mL，沸水浴使淀粉溶解，10,000rpm离心数秒，取上清液混匀。 

取若干个50mL的比色管，加入100μL待测样品。各管分别加入100μL 0.4％ I₂-KI溶液，加去离子水至25mL刻度处，以去离子水代替培养液的上清液的一管为空白对照，测定其它管OD₆₃₀的值。从标准曲线上查出相应的淀粉含量。 

(3)葡萄糖含量测定采用常规的旋光测定法。 

Claims (2)

1.一种用枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于：

①构建枯草芽孢杆菌表达载体

A.构建克隆载体

DNA合成含氨苄青霉素基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点，在其序列的两端形成碱基互补，通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体，将其克隆载体命名为pBPA；

B.获取基因

a.PCR扩增异淀粉酶基因

提取解淀粉的假单胞杆菌基因组DNA，应用引物5’CGGATATC GCCATCAACAGCATGAGC3’和5’CGGATATCGGCTACTTGGAGATCAACAG3’进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是异淀粉酶基因序列，

b.PCR扩增地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因

提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，应用引物5’Atgaaacaacaaaaacggct3’和5’ctatctttgaacataaattg3’进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列，

c.PCR扩增大麦的α淀粉酶基因

应用RNA提取试剂盒提取大麦的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物5’ATGGGGAAGAACGGCAGCCT3’和5’TCAGCTCCGTTGTAGTGTTGCCGCGGCACC3’进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列，

d.PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物5’atgtcgttccgatctcttct3’和5’CTAccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt3’进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列；

C.分别构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架

a.用PCR扩增巨大芽孢杆菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列

提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA，应用如下引物5’GATCCATTATCGGTGAACCA3'和5'GGGAATACATTACGGCCGAT3’进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列，

b.DNA序列合成法合成如下α因子信号肽：

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC

c.DNA序列合成法合成如下DNA转录终止序列：

GGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTTTAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTTCGAGAAGGATATTATTTCGAAATAAACCGTGTTGTGTAAGCTTGAAG

d.用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列：

CCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTGATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT

e.用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增rDNA序列

应用常规方法提取枯草芽孢杆菌基因组DNA，应用如下引物5’gacgaacgctggcggcgtgc3和5’gcaccttccgatacggctacct3’进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是枯草芽孢杆菌基因组中的rDNA序列，

f.表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止序列的构建过程：

含异淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将异淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含异淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPAl，

含地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将包含信号肽的地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPA2，

含大麦α淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将包含信号肽的大麦α淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子下游；将转录终止序列重组于pgPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含大麦α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPA3，

含葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pBPA载体的多克隆位点；将包含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将转录终止序列重组于pBPA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的载体称为pBPA4；

完成表达载体的构建：

将表达框架组装于同一个克隆载体：

通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，分别切取pBPA2、pBPA3和pBPA4载体的表达框架，并将以上的这三套表达框架依次插入于pBPAl的多克隆位点，此载体称为pBPA1234；

然后同样通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将DNA重组序列和G418抗性基因重组于pBPAl234载体的多克隆位点，构成含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体；

②构建含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的表达载体转化枯草芽孢杆菌基因组，用载体上的抗性基因筛选重组子，用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别用异淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因、大麦C淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因已经重组于重组子的基因组，其重组子即含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌；

③生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的枯草芽孢杆菌工程菌接种于含10％木薯淀粉，0.5％NaCl，1％蛋白胨和0.5％酵母粉的液体培养基中发酵2d，离心取上清进行酶活性分析。

2.一种用毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的方法，其特征在于：

①构建毕赤酵母表达载体

A.构建克隆载体

DNA合成含氨苄青霉素基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点，在其序列的两端形成碱基互补，通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体，将其克隆载体命名为pPCA，

B.获取基因

a.PCR扩增异淀粉酶基因

提取解淀粉的假单胞杆菌基因组DNA，应用引物5’CGGATATC GCCATCAACAGCATGAGC3’和5’CGGATATCGGCTACTTGGAGATCAACAG3’进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是异淀粉酶基因序列，

b.PCR扩增地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因

提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，应用引物5’Atgaaacaacaaaaacggct3’和5’ctatctttgaacataaattg3’进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列，

c.PCR扩增大麦的α淀粉酶基因

应用RNA提取试剂盒提取大麦的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物5’ATGGGGAAGAACGGCAGCCT3’和5’TCAGCTCCGTTGTAGTGTTGCCGCGGCACC3’进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的α淀粉酶基因序列，

d.PCR扩增葡萄糖淀粉酶基因

应用RNA提取试剂盒提取黑曲霉菌的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用引物5’atgtcgttccgatctcttct3’和5’CTAccgccaggtgtcagtcaccgtcgcggt3’进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列；

C.分别构建含异淀粉酶、两种α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因表达框架

a.用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列

应用RNA提取试剂盒提取毕赤酵母的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用如下引物5’GGACTAGTCGATCCTTTTTTG3’和5’GGATCCTGTGTTTTGATAGTTG3’进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列，

b.DNA序列合成法合成如下α因子信号肽：

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC

c.DNA序列合成法合成如下DNA转录终止序列：

GGTGTTGCTTTCTTATCCGAAAAGAAATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAGATCAATTTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTTTAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTTCGAGAAGGATATTATTTCGAAATAAACCGTGTTGTGTAAGCTTGAAG

d.用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列：

CCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT

e.从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列

应用RNA提取试剂盒提取毕赤酵母的RNA，应用cDNA合成试剂盒合成其cDNA，应用如下引物5’aggttcacctacggaaaccttg3’和5’tgtctcaaagattaagccatgc3’进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列，

f.表达框架构建过程

含异淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将异淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含异淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA1，

含地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA2，

含大麦α淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的大麦α淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含大麦α淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA3，

含葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的构建：

将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPCA载体的多克隆位点；将包含信号肽的葡萄糖淀粉酶基因序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于启动子的下游；将转录终止序列重组于pPCA载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游；此含葡萄糖淀粉酶基因的表达框架的载体称为pPCA4，

完成表达载体的构建：

将表达框架组装于同一个克隆载体：

通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，分别切取pPCA2、pPCA3和pPCA4载体的表达框架，并将以上的这三套表达框架依次插入于pPCA1的多克隆位点，此载体称为pPCA1234；

然后同样通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将DNA重组序列和G418基因重组于pPCA1234载体的多克隆位点，构成含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体；

②构建含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组，用载体上的抗性基因筛选重组子；用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别用异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的特异引物，以重组子基因组DNA为模板，进行PCR扩增；重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带，并且对其PCR产物进行序列测定证明其异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因已经重组于重组子的基因组；其重组子即含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌；

③生产重组混合异淀粉酶、α淀粉酶和葡萄糖淀粉酶

将含异淀粉酶基因、两种α淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因的毕赤酵母工程菌接种于含10％木薯淀粉，2％蛋白胨和1％酵母粉的液体培养基中发酵2d，离心取上清进行酶活性分析。

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