CN102719420A - 一种生产重组混合异淀粉酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产重组混合异淀粉酶的方法。属生物技术领域。首先分别克隆解淀粉假单胞杆菌和软腐细菌的异淀粉酶基因；构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体，并将其表达载体转化毕赤酵母，筛选高表达以上所述的两种异淀粉酶的重组子作为工程菌；发酵毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶。与传统的由单基因编码的异淀粉酶不同，本发明生产的重组混合异淀粉酶出现酶反应的两个最适温度和pH，理化特性高，适合于多种用途；由于实现两个酶基因同时在其毕赤酵母中表达，使其异淀粉酶产量显著提高，起到降低生产成本的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产重组混合异淀粉酶。
背景技术
异淀粉酶(Isoamylase EC 3.2.1.68)，亦称α-1，6-葡萄糖苷酶，支链淀粉酶。异淀粉酶广泛存在于微生物界，现已知产异淀粉酶的微生物有细菌和真菌两大类。异淀粉酶能够水解支链淀粉分支点的α-1，6-葡萄糖苷键，催化支链淀粉、糖原及某些分支糊精中的α-1，6糖苷键的断裂反应。异淀粉酶广泛应用于淀粉工业生产、啤酒生产、饲料工业和饮食等行业。不同的用途对于异淀粉酶作用的适合温度和pH有着不同的要求。当前市场上的异淀粉酶产品是来源于天然菌株生产的异淀粉酶，当前的异淀粉酶产品的适合反应温度范围和适合反应pH范围窄，不能满足当前市场的需求。
由于异淀粉酶有多种来源，那么，不同来源的异淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的异淀粉酶的理化特性可不相同。毕赤酵母(Pichia pastoris，P.pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于大规模生产方式，分泌很少的自身蛋白，表达的外源蛋白容易纯化。
发明内容
根据异淀粉酶有多种来源，不同来源的异淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的异淀粉酶的理化特性可不相同，如果将某些不同理化特性的异淀粉酶基因重组于同一个细胞的基因组进行表达，那么，所表达的混合异淀粉酶将具有理化特性多样性，即具有多个最适温度和最适pH。这种混合酶将比其中单种酶的使用价值高。来源于解淀粉假单胞杆菌(Pseudomonasamyloderamosa)的异淀粉酶最适合pH 5.6，最适温度是56℃；来源于软腐细菌(Pectobacterium chrysanthemi)的异淀粉酶最适pH7，最适温度40℃。由于这两种酶的功能相同，若将这两种酶联合应用，就有两个最适合的pH反应点和温度反应点，那么，其用途将比其中的单独酶广。若分别用不同的菌株来表达这两种酶，其生产成本将高于用一个菌株同时生产这两种酶的混合酶。本发明构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，生产重组混合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶和软腐细菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶。
本发明所采用的技术方案是：
1.克隆酶基因：应用PCR技术，分别从解淀粉假单胞杆菌基因组和软腐细菌基因组中扩增异淀粉酶基因。
2.获得应用于表达载体构建所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子和抗性基因。
3.构建如附图的含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体。
4.应用电转化法将含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组。[说明.表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止子]
5.筛选高表达解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶和软腐细菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶的重组子作为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。
6.发酵毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶。
本发明构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶的优点体现于：
本发明通过构建毕赤酵母工程菌，应用工程菌生产两种重组异淀粉酶的混合酶产品，一方面提供最适pH7和最适pH5.6，最适温度40℃和50℃的混合异淀粉酶新产品，另一方面取代发酵含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶，发酵含软腐细菌的异淀粉酶基因的菌株生产异淀粉酶。即用一个发酵工序生产两种异淀粉酶取代用两个工序分别生产两种异淀粉酶。达到节省原材料、能耗和人力资源的作用。
附图说明
附图.含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体。
p.毕赤酵母三磷酸甘油醛脱氢酶启动子；S.α因子信号肽；gene1.解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因；gene2.软腐细菌的异淀粉酶基因；TT.转录终止子；G418.G418抗性基因(应用于筛选毕赤酵母重组子)；ColE1.大肠杆菌复制起点；AMP.氨苄青霉素抗性基因(应用于筛选大肠杆菌转化子)；p.pastoris rDNA.毕赤酵母的rDNA序列。
具体实施方式
下面用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1.1构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母组表达载体
1.1.1构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPM。
1.1.2获取基因
①PCR扩增解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因
引物1：5’ggTTCGAAgccatcaacagcatgagcct3’[说明：5’的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2：5’CAGCGGCCGCCTA
cttggagatcaacagcagcagcgat3’[说明：5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]
提取解淀粉假单胞杆菌基因组DNA，以解淀粉假单胞杆菌基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因大小的扩增带。PCR产物经DNA序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。
②PCR扩增软腐细菌的异淀粉酶基因
引物1：5’gctacgtaatgggtgaactgttggcggg3’[说明：5’的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCTTA
ttgttttaccagtacgcacaccgcatt3’[说明：5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]
提取软腐细菌基因组DNA，以软腐细菌基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合软腐细菌的异淀粉酶基因大小的扩增带。PCR产物经DNA序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是软腐细菌的异淀粉酶基因。
1.1.3分别构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架。
①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。
提取毕赤酵母的基因组DNA，应用以基因组DNA为模板，应用如下引物(5’CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3’，5’GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列的5’端和3’端的有下划线的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]：
CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAAAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAATTGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC
[说明：毕赤酵母基因组DNA提取方法：将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用1mol/L的山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]
②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG
⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列
PCR引物：
引物1：5’CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3’
引物2：5’CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3’
说明：引物的5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位(有下划线的6个碱基)。
提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。
⑥表达框架构建过程：
A.含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的构建：
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将PCR扩增获得的解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的载体称为pPM1。
B.含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的构建：
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将PCR扩增获得的软腐细菌的异淀粉酶基因序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的载体称为pPM2。
⑦完成毕赤酵母表达载体的构建
A.将两套表达框架组装于同一个克隆载体。
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，切下pPM2载体的表达框架，并将其切下的表达框架重组于pPM1的多克隆位点。此载体称为pPM12.
B.通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pPM12载体的多克隆位点，构成含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图)。
1.2构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌
用电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体(见附图)转化毕赤酵母GS115，将经过电转化的GS115细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因的特异引物和软腐细菌的异淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩增，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含两种异淀粉酶基因表达框架的重组子在接种于YPD[2％蛋白胨，1％ yeast extract(酵母提取物)，2％葡萄糖]培养基中，30℃摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这两个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的两种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这两种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因和软腐细菌的异淀粉酶基因都能在含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的两种混合异淀粉酶的重组子作为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。
1.3生产重组混合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶和软腐细菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶
分别将含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和不含异淀粉酶基因的毕赤酵母分别接种于YPD培养基中，30℃摇床培养两天。分别收集其发酵液上清于两个条件(①pH 5.6、56℃，②pH 7、40℃)测定异淀粉酶活性，将结果记录于表1。表1结果表明含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在pH 5.6、56℃和pH 7、40℃都具有良好的酶活性，但是，含单种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液只是在其中的一个条件下具有良好的酶活性。含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在pH 5.6、56℃条件下和在pH 7、40℃的条件下的异淀粉酶活性约为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在同样条件下的异淀粉酶活性之和。
表1.发酵液水解异淀粉试验试验
说明：
a.采用常规的异淀粉酶活性测定方法，酶活性最高的pH为最适pH，酶活性最高的温度为最适温度。
b.含单种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的构建的方法与含两种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的构建的方法的差别在于表达载体的构建；含单种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体的构建方法与含两种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体构建的方法的差别在于前者只含一种异淀粉酶基因表达框架，而后者含两种异淀粉酶基因表达框架。
c.异淀粉酶活性测定方法：应用糯米淀粉平板测定方法。制备含2％糯米粉的琼脂平板，将牛津杯置于平板上，各取50μl不同浓度的异淀粉酶标准溶液和不同菌株的发酵液加于不同的牛津杯中，并在每个杯中加入50μl磷酸盐缓冲液。于50℃放置12小时，然后用碘-碘化钾(I2-KI)溶液染色，计算透明圈直径。对以上实验进行三个重复。根据不同浓度的异淀粉酶标准的透明圈绘制标准曲线；根据测试样品的透明圈直径和不同浓度的异淀粉酶标准的透明圈标准曲线计算出各个测试菌株的发酵液的异淀粉酶活性。
实施例2：
2.1构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母组表达载体
2.1.1构建克隆载体
由专业的DNA序列合成公司合成含氨苄青霉素(AMP)基因序列，多克隆接头和大肠杆菌复制起点的两条碱基互补的双链，并且在每条DNA链序列的两端形成粘性末端。通过DNA连接酶的作用使其环化，形成DNA克隆载体。将其克隆载体命名为pPM。
2.1.2获取基因
①PCR扩增解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因
引物1：5’ggTTCGAAgccatcaacagcatgagcct3’[说明：5’的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2：5’CAGCGGCCGCCTA
cttggagatcaacagcagcagcgat3’
[说明：5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]
提取解淀粉假单胞杆菌基因组DNA，以解淀粉假单胞杆菌基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因大小的扩增带。PCR产物经DNA序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列。
②PCR扩增软腐细菌的异淀粉酶基因
引物1：5’gctacgtaatgggtgaactgttggcggg3’[说明：5’的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(有下划线的6个碱基)]
引物2：
5’CAGCGGCCGCTTA
ttgttttaccagtacgcacaccgcatt3’[说明：5’的10个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(8个碱基)，方框中的18个碱基是编码6个组氨酸的DNA序列。]
提取软腐细菌基因组DNA，以软腐细菌基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳证明PCR扩增出符合软腐细菌的异淀粉酶基因大小的扩增带。PCR产物经DNA序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是软腐细菌的异淀粉酶基因。
2.1.3 分别构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架。
①用PCR扩增毕赤酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列。
提取毕赤酵母的基因组DNA，应用以基因组DNA为模板，应用如下引物(5’CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3’，5’GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3’)进行PCR扩增，PCR产物经序列测定和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是其三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子序列[如下序列的5’端和3’端的有下划线的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是三磷酸甘油醛脱氢酶启动子序列]：
CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCGTTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGTCTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCCCTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAAAAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAAAGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAATTGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC
[说明：毕赤酵母基因组DNA提取方法：将毕赤酵母细胞加于9mg/ml的蜗牛酶溶液(蜗牛酶用1mol/L山梨醇溶解)于30℃振摇30分钟，然后按照常规的细菌基因组DNA提取方法提取其基因组DNA。]
②由专业的DNA序列合成公司合成α因子信号肽[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是α因子信号肽序列]：
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC
③由专业的DNA序列合成公司合成转录终止子序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是转录终止子序列]：
GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④：用套叠PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下划线的是酶切保护碱基(2个碱基)和DNA限制性内切酶识别位点(6个碱基)，没有下划线的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG
⑤从毕赤酵母基因组中PCR扩增rDNA序列
PCR引物：
引物1：5’CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3’
引物2：5’CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3’
说明：引物的5’端的8个碱基是酶切保护碱基(2个碱基)和酶识别位(有下划线的6个碱基)。
提取毕赤酵母基因组DNA，以基因组DNA为模板，应用引物1和引物2进行PCR扩增，获得的PCR产物经序列分析和用NCBI提供的BLAST软件分析证明是毕赤酵母基因组中的rDNA序列。
⑥表达框架构建过程：
A.含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的构建：
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将PCR扩增获得的解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的载体称为pPM1。
B.含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的构建：
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将三磷酸甘油醛脱氢酶启动子DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点；将α因子信号肽DNA序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于启动子序列的下游；将PCR扩增获得的软腐细菌的异淀粉酶基因序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于信号肽序列的下游；将转录终止子序列重组于pPM载体的多克隆位点，并使其位于基因序列下游。此含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的载体称为pPM2。
⑦完成毕赤酵母表达载体的构建
A.将两套表达框架组装于同一个克隆载体。
通过DNA限制性内切酶和T4 DNA连接酶的作用，切下pPM2载体的表达框架，并将其切下的表达框架重组于pPM1的多克隆位点。此载体称为pPM12.
B.通过DNA限制性内切酶和T4DNA连接酶的作用依次将毕赤酵母的rDNA序列(DNA重组序列)和G418基因重组于pPM12载体的多克隆位点，构成含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体(附图)。
2.2构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌
用电转化方法将以上构建的毕赤酵母表达载体(见附图)转化毕赤酵母GS115，将经过电转化的GS115细胞涂布G418抗性平板。以重组子(在G418抗性平板上生长的克隆)基因组DNA为模板，分别用解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因的特异引物和软腐细菌的异淀粉酶基因的特异引物进行PCR进行扩增，将扩增出符合目标分子量的PCR产物进行DNA序列测定而验证获得了正确的重组子。将含以上含两种异淀粉酶基因表达框架的重组子在接种于YPD[2％蛋白胨，1％ yeast extract(酵母提取物)，2％葡萄糖]培养基中，30℃摇床培养两天，将发酵液离心，收获上清。应用发酵液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其结果表明出现新的符合这两个基因编码的酶蛋白分子量的蛋白条带。用His6融合蛋白纯化试剂盒纯化目标蛋白，用His标签单克隆抗体对纯化的两种目标蛋白进行蛋白印迹实验，结果表明这两种目标蛋白都能与His标签单克隆抗体结合，证明解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因和软腐细菌的异淀粉酶基因都能在含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母中表达和分泌到胞外。筛选高表达以上所述的两种混合异淀粉酶的重组子作为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌。
2.3生产重组混合解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶和软腐细菌的异淀粉酶基因编码的异淀粉酶
分别将含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌，只含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌和不含异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母分别接种于YPD培养基中，分别于30℃、用相同的发酵条件(设定溶氧25％-30％，设定pH 5)在生物反应器中发酵32小时。分别收集其发酵液上清于两个条件(①pH 5.6、56℃，②pH 7、40℃)分析其异淀粉酶活性，将结果记录于表2。表2结果表明含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在pH 5.6、56℃和pH 7、40℃都具有良好的酶活性，但是，含单种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液只是在其中的一个条件下具有良好的酶活性。含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在pH 5.6、56℃条件下和在pH 7、40℃的条件下的异淀粉酶活性约为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的发酵液在同样条件下的异淀粉酶活性之和。
表2.发酵液的异淀粉酶活性
说明：
a.采用常规的异淀粉酶活性测定方法，酶活性最高的pH为最适pH，酶活性最高的温度为最适温度。
b.含单种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的构建的方法与含两种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌的构建的方法的差别在于表达载体的构建；含单种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体的构建方法与含两种异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体构建的方法的差别在于前者只含一种异淀粉酶基因表达框架，而后者含两种异淀粉酶基因表达框架。
c.异淀粉酶活性测定方法：应用糯米淀粉平板测定方法。制备含2％糯米粉的琼脂平板，将牛津杯置于平板上，各取50μl不同浓度的异淀粉酶标准溶液和不同菌株的发酵液加于不同的牛津杯中，并在每个杯中加入50μl磷酸盐缓冲液。于50℃放置12小时，然后用碘-碘化钾(I2-KI)溶液染色，计算透明圈直径。对以上实验进行三个重复。根据不同浓度的异淀粉酶标准的透明圈绘制标准曲线；根据测试样品的透明圈直径和不同浓度的异淀粉酶标准的透明圈标准曲线计算出各个测试菌株的发酵液的异淀粉酶活性。
Claims (2)
1.一种生产重组混合异淀粉酶的方法。其特征在于：应用分子生物学技术克隆解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因和软腐细菌的异淀粉酶基因，构建含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体；将毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母从而获得毕赤酵母重组子；筛选高表达以上所述的两种异淀粉酶的毕赤酵母重组子作为含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌；用含解淀粉假单胞杆菌的异淀粉酶基因表达框架和含软腐细菌的异淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌生产重组混合异淀粉酶。
2.根据权利要求1所述一种生产重组混合异淀粉酶的方法，其特征在于：利用权利要求1所述的生产重组混合异淀粉酶的方法制备成混合异淀粉酶产品。
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