CN105039191B - 一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用 - Google Patents
一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用。本发明将来自Arthrobacter sp.L77菌株的麦芽寡糖海藻糖基合成酶基因、麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因和来自酿酒酵母中共价连接细胞壁的Pirlp蛋白成熟肽基因进行克隆，连接至毕赤酵母分泌表达载体pPIC‐ZαA中，构建表面展示两种酶的重组质粒pPIC‐ZαA‐MTSase‐MTHase‐Pir1p。利用α‐factor信号肽将重组蛋白引导分泌至细胞表面，麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶与Pir1p蛋白融合展示于菌体表面，实现两种酶在毕赤酵母的表面展示，从而实现双酶法生产海藻糖的高效应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用，特别涉及利用毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法与应用，属于微生物工程技术领域。
背景技术
海藻糖广泛分布于细菌、藻类、酵母、低等植物、昆虫和其它无脊椎动物中，是国际上最近开发的主要低聚糖之一。海藻糖可以在细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压及有毒试剂等胁迫环境时，有效地维持细胞内质膜和蛋白质的稳定，在保护基因工程酶类、各种病毒、疫苗、抗体、蛋白质因子、核酸等方面取得令人振奋的结果。
目前，海藻糖制取上存在困难，因此使海藻糖的价格较高，且生产量低，远不能满足市场需求。双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方法。该方法中第一种酶用来催化聚合度(DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的α-1,4连接键生成α-1,1连接键。第二种酶专一性催化水解α-1,4键生成的α-1,1键海藻糖和低分子量的麦芽低聚糖。各国科学家一致认为生产海藻糖的经济方法是利用双酶法转化廉价的淀粉底物一步生成海藻糖，但近十年来产海藻糖合酶菌株难以实验发酵生产海藻糖的经济目标。
目前生产两种酶的大肠杆菌基因工程菌只能实现胞内表达，不仅需要破碎，而且在下游分离纯化时存在较多障碍。且大肠杆菌含有内毒素，生产出的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)不适合在医药食品工业使用。
毕赤酵母是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。其具有易培养、繁殖快的优点，毕赤酵母具有乙醇氧化酶基因诱导性强启动子，可调控外源基因的表达，便于基因工程操作和高密度发酵，成为微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌。酵母表面展示可以对外源蛋白进行折叠，糖基化修饰，利用酵母细胞内的蛋白转运机制可以将靶蛋白表达并定位到酵母细胞表面，表达的蛋白具有独立的空间构像。宿主酵母的细胞器复杂，利于真核蛋白表达，且不含内毒素和特异性病毒，对其进行高密度发酵，发酵工艺简单，成本低廉，安全可靠。
但目前尚未有成功毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的报道，主要是由于两种酶同时表面展示，分子量较大，会对酵母本身产生影响，且二者表达过程中会产生影响，进而降低二者的酶反应效率。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用毕赤酵母表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法与应用。
本发明构建的表面展示工程菌可以将麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)-麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)融合酶稳定的表面展示于毕赤酵母表面的基因工程菌，菌体可以直接作为全细胞催化剂直接与底物反应，无需破碎细胞和提纯麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)-麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)融合酶，使生产海藻糖更加方便。
本发明技术方案如下：
一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法，包括如下步骤：
(1)以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR扩增，获得MTSase基因片段；
所述F1和R1的核苷酸序列如下所示：
F1:GAATTCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC
R1：CCTCGGGGGTGAACGTGC
(2)Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR扩增，获得MTHase基因片段；
所述F1和R1的核苷酸序列如下所示：
F2:ATGAGTTCGCCATTCGAGGT
R2:GCGGCCGCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG
(3)将步骤(1)制得的MTSase基因片段与步骤(2)制得的MTHase基因片段经重叠PCR扩增，电泳纯化，制得麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基因；
经检测，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可以表达的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
重叠PCR的上游引物为F2，下游引物为R1；
(4)酵母基因组提取试剂盒提取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC32919)基因组DNA为模板，F3和F4为引物，通过PCR扩增，获得产物3Pir1p基因片段；
所述F3和F4的核苷酸序列如下所示：
F3：GGACTAGTCAGAGAGCCGCTGCTAT
F4：GCTCTAGATTAACAGTTGAGCAAATCGAT
(5)将步骤(3)制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基因经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切后，与同样经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的pPIC-ZαA载体连接，制得异源表达载体pPIC-ZαA-MTSase-MTHase；将异源表达载体pPIC-ZαA-MTSase-MTHase经限制性内切酶Spe I、Not I双酶切后，与经限制性内切酶SpeI、Not I双酶切的Pir1p基因片段连接，制得异源表达载体pPIC-ZαA-MTSase-MTHase-Pir1p；
(6)将步骤(5)制得的异源表达载体pPIC-ZαA-MTSase-MTHase-Pir1p线性化后，采用电转化法转化毕赤酵母GS115，经筛选，获得表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的重组毕赤酵母。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，制备扩增MTSase基因片段的PCR体系如下：
Hifi Mix 10μl，引物F1(10μM)10μl，引物R1(10μM)10ul，ddH2O 7μl，Arthrobacter sp.L77基因组模板Template 1μl。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，制备MTSase基因片段的PCR扩增程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，制备MTHase基因片段的PCR扩增体系如下：
Hifi Mix 10μl，引物F2(10μM)10μl，引物R2(10μM)10μl，ddH2O 7μl，Arthrobacter sp.L77基因组模板Template 1μl。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，制备MTHase基因片段的PCR扩增程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，制备MTSase-MTHase融合基因片段的重叠PCR扩增体系如下：
Hifi Mix 10μl，引物F1(10μM)10μl，引物R2(10μM)10μl，ddH2O 7μl，MTSase基因片段和MTHase基因片段1μl。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，制备MTSase-MTHase融合基因片段的重叠PCR扩增程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；然后，补加引物F1和R2；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，制备GenBank序列号为D13740的目的基因Pir1p的PCR扩增体系如下：
Hifi Mix 10μl，引物F3(10μM)10μl，引物F4(10μM)10μl，ddH2O 7μl，酿酒酵母基因组模板Template 1μl。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，制备GenBank序列号为D13740的目的基因Pir1p的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃最终延伸10min，4℃保存。
上述方法制得的表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组毕赤酵母在制备海藻糖中的应用。
上述应用，步骤如下：
(i)将表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的毕赤酵母接种于含有浓度为40～60μg/mL博来霉素(Zeocin)的YPD培养基中，25～32℃，200～300r/min的条件下，培养14～20h，制得重组酵母种子；
(ii)将步骤(i)制得的重组酵母种子接种于BMGY培养基中，25～32℃，200～300r/min的条件下，培养20～28h，离心，取菌体沉淀，接种于BMMY培养基中，22～28℃、200～300r/min条件下诱导表达144h，维持培养基中的甲醇质量浓度为0.1％，收集菌体；
(iii)将步骤(ii)收集的菌体用生理盐水洗涤后，使用PBS重悬，与淀粉乳液混匀反应，制得海藻糖。
根据本发明优选的，所述步骤(i)和步骤(ii)中，接种量均为为1wt％。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，每升YPD培养基组分如下：
葡萄糖20g、蛋白胨20g，酵母抽提物20g，水定容至1000mL。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，每升BMGY培养基组分如下：酵母粉10g，蛋白胨20g，YNB13.4g，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，甘油10mL，加蒸馏水到1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。使用之前添加终浓度为4×10-5mg/mL的过滤除菌的生物素。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，每升BMMY培养基组分如下：酵母粉10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，加蒸馏水到1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。使用之前添加终浓度为4×10-5mg/mL的过滤除菌的生物素和0.5％的甲醇。
根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，淀粉乳液质量浓度为10～30％；优选的，所述步骤(iii)中，反应转化条件为：40～55℃恒温震荡培养18～25h。
有益效果
本发明首次构建出性能稳定、高效表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)-麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)融合酶的毕赤酵母工程菌株，使其产酶单位达到150U/mg干菌体，可以显著降低海藻糖的生产成本，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
节杆菌(Arthrobacter sp.)L77菌株购自中国微生物菌种保藏中心，菌种编号CICC NO.10757，其他载体如无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1：引物设计
根据NCBI上登录的Arthrobacter sp.L77基因组序列分别设计引物F1和R1(扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶)、F2和R2(扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶)。
F1:GAATTCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC
R1:CCTCGGGGGTGAACGTGC
F2:ATGAGTTCGCCATTCGAGGT
R2:GCGGCCGCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG
其中在扩增的融合酶基因的引物F1中添加EcoR I酶切位点，在引物R2中添加SpeI、Not I酶切位点，便于插入Pir1p基因。
酵母基因组提取试剂盒提取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC 32919)基因组DNA，并以此为模板克隆目的基因Pir1p(GenBank序列号为D13740)，设计的用于扩增的寡核苷酸引物命名为F3，F4，并在引物F3、F4中分别添加Spe I、Not I酶切位点：
F3：5`-GGACTAGTCAGAGAGCCGCTGCTAT-3`
F4：5`-GCTCTAGATTAACAGTTGAGCAAATCGAT-3`
实施例2：Arthrobacter sp.L77基因组总DNA的提取
将-80℃下保存的Arthrobacter sp.L77菌株接种至LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中活化培养48小时，其后按照1％接种量接种至新鲜LB培养基中培养24小时，去10mL菌液按照上海生工细菌基因组提取试剂盒所提供的方法提取该菌基因组总DNA。根据NCBI上登录的Arthrobacter sp.L77基因组序列分别设计引物F1和R1(扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶)、F2和R2(扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶)。
实施例3：麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因的构建。
以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F1和R1为引物，利用Hifi Max说明书提供的体系进行PCR。
PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
割胶回收1700bp左右条带，制得MTSase基因片段。
以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F2和R2为引物进行PCR。
PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
割胶回收2300bp左右条带，制得MTHase基因片段；
将MTSase基因片段和MTHase基因片段通过重叠PCR方法进行拼接。
PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；然后，补加引物F2和R1；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
割胶回收约4000bp左右麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基因序列，经检测，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可以表达的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。将该融合目的基因与pMD18-T载体连接获得pMD18-MM，转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性重组子测序并保存。
实施例4：Pir1p目的基因序列的构建
以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC 32919)基因组为模板，F3和F4为引物，利用Hifi Max说明书提供的体系进行PCR。
PCR条件为：95℃预变性5min,95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环，72℃最终延伸10min。
割胶回收约847bp左右Pir1p目的基因序列，并与pMD18-T载体连接获得pMD18-Pir1p，转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性重组子测序并保存。
实施例5：融合酶基因在毕赤酵母表面的表达
所述毕赤酵母表达所用载体为可以实现毕赤酵母胞外表达的pPIC-ZαA载体。提取pMD18-MM质粒使用EcoR I和Not I双酶切，然后与经相同两种酶酶切后的pPIC-ZαA相连接，获得异源表达载体pPIC-ZαA-MTSase-MTHase。将所获载体进一步进行Spe I、Not I双酶切，与通过同样双酶切的Pir1p基因片段连接，获得异源表达载体pPIC-ZαA-MTSase-MTHase-Pir1p。将所获载体经Pme I线性化后和电转化方法(2500V，5ms)转化毕赤酵母GS115中，并采用Zeocin筛选重组子，命名为GS115-3。
实施例6：重组毕赤酵母GS115-3表达融合酶
按照毕赤酵母表达手册对所获得的毕赤酵母重组子进行异源表达。将GS115-3接种至含BMGY(pH6.0)培养基的5L发酵罐中，30℃、250r/min培养24h；待甘油耗尽。DO值陡然增加，此时降低温度至25℃，低温诱导蛋白表达；每24h向培养基中添加100％甲醇使其终浓度为0.1wt％，诱导72h，收集发酵物。使用pH 5.5PBS缓冲液洗涤3次，后用pH 5.5PBS缓冲液重悬，体系中加入终浓度为20％的淀粉乳液，混匀后置于50℃恒温水浴震荡摇床中反应20h，反应结束后，沸水浴10min终止酶的转化反应。室温10000r/min离心10min，取上清进行HPLC检测转化体系中海藻糖含量。
HPLC测定方法为：示差折光检测器，5μm，4.6*250mm氨基键合相柱，流动相V(乙腈)：V(水)＝75:25，流速1ml/min，柱温40℃，进样量10μl。
经试验在此条件下转化淀粉乳液为海藻糖转化率可以达到8.48％，换算之后，即1g干菌体20h可生成300.65μmol海藻糖。
离心收集菌体沉淀，采用超高压破碎进行细胞破碎，采用β-1,3葡聚糖苷酶进行洗脱，得到重组融合酶。对重组融合酶的酶学性质进行测定，结果表明所获融合酶能够同时展示出麦芽寡糖基海藻糖合成酶(比酶活：153U/mg)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(比酶活：162U/mg)两种酶的活性，且融合酶的酶学性质与融合之前的两种酶相似(最适pH值均在5.5左右，最适温度均为50℃)，以500U/L的添加量在50℃下转化20％的淀粉乳液20小时所得的海藻糖转化率可达8.48％，到达相同转化率时间较双酶法相比节约了近4小时。
实施例7：表面展示融合酶的反复利用
将发酵既得菌体用生理盐水洗涤3次，pH 5.5PBS缓冲液重悬，体系中加入终浓度为20％的淀粉乳液，混匀后置于50℃恒温水浴震荡摇床中反应20h，反应结束后，沸水浴10min终止酶的转化反应。室温10000r/min离心10min，取上清进行HPLC检测转化体系中海藻糖含量。剩余反应液继续6500r/min离心10min重复以上处理步骤，再次测酶活，转化率达到6.37％，重复利用率可以达到75％。
由以上结果可以看出，利用可以表面展示海藻糖合酶的毕赤酵母为全细胞催化剂转化淀粉乳液可以循环利用，每次转化会有酶活损失，但是循环利用率可以达到75％。
Claims (9)
1.一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以Arthrobacter sp. L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR扩增，获得MTSase基因片段；
所述F1和R1的核苷酸序列如下所示：
F1: GAATTCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC；
R1：CCTCGGGGGTGAACGTGC；
所述制备MTSase基因片段的PCR扩增体系如下：
Hifi Mix 10 μl，10μM引物F1 10 μl，10μM引物R1 10 ul，ddH2O 7μl，Arthrobactersp. L77基因组模板Template 1 μl；
所述制备MTSase基因片段的PCR扩增程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
（2）Arthrobacter sp. L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR扩增，获得MTHase基因片段；
所述F2和R2的核苷酸序列如下所示：
F2: ATGAGTTCGCCATTCGAGGT；
R2: GCGGCCGCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG；
所述制备MTHase基因片段的PCR扩增体系如下：
Hifi Mix 10 μl，10μM引物F2 10 μl，10μM引物R2 10 μl，ddH2O 7μl，Arthrobactersp. L77基因组模板Template 1 μl；
所述制备MTHase基因片段的PCR扩增程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
（3）将步骤（1）制得的MTSase基因片段与步骤（2）制得的MTHase基因片段经重叠PCR扩增，电泳纯化，制得麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基因；
重叠PCR的上游引物为F2，下游引物为R1；
所述制备MTSase-MTHase融合基因片段的重叠PCR扩增体系如下：
Hifi Mix 10 μl，10μM引物F1 10 μl，10μM引物R2 10 μl，ddH2O 7μl，MTSase基因片段和MTHase基因片段1 μl；
所述制备MTSase-MTHase融合基因片段的重叠PCR扩增程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；然后，补加引物F1和R2；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸4.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
（4）酵母基因组提取试剂盒提取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,CICC 32919)基因组DNA为模板，F3和F4为引物，通过PCR扩增，获得产物3 Pir1p基因片段；
所述F3和F4的核苷酸序列如下所示：
F3 ： GGACTAGTCAGAGAGCCGCTGCTAT；
F4 ：GCTCTAGATTAACAGTTGAGCAAATCGAT；
所述制备GenBank 序列号为D13740的目的基因Pir1p的PCR扩增体系如下：
Hifi Mix 10 μl，10μM引物F3 10 μl，10μM引物F4 10 μl，ddH2O 7μl，酿酒酵母基因组模板Template 1 μl；
所述制备GenBank 序列号为D13740的目的基因Pir1p的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃最终延伸10min，4℃保存；
（5）将步骤（3）制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基因经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切后，与同样经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的pPIC-ZαA载体连接，制得异源表达载体pPIC-ZαA- MTSase-MTHase；将异源表达载体pPIC-ZαA- MTSase-MTHase经限制性内切酶Spe I、Not I双酶切后，与经限制性内切酶SpeI、Not I双酶切的Pir1p基因片段连接，制得异源表达载体pPIC-ZαA- MTSase-MTHase-Pir1p；
（6）将步骤（5）制得的异源表达载体pPIC-ZαA- MTSase-MTHase-Pir1p线性化后，采用电转化法转化毕赤酵母GS115，经筛选，获得表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的重组毕赤酵母。
2.权利要求1所述方法制得的表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组毕赤酵母在制备海藻糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：
（i）将表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的毕赤酵母接种于含有浓度为40～60μg/mL博来霉素的YPD培养基中，25～32℃，200～300r/min的条件下，培养14～20h，制得重组酵母种子；
（ii）将步骤（i）制得的重组酵母种子接种于BMGY培养基中，25～32℃，200～300r/min的条件下，培养20～28h，离心，取菌体沉淀，接种于BMMY培养基中，22～28 ℃、200～300 r/min条件下诱导表达144h，维持培养基中的甲醇质量浓度为0.1%，收集菌体；
（iii）将步骤（ii）收集的菌体用生理盐水洗涤后，，使用PBS重悬，与淀粉乳液混匀反应，制得海藻糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（i）和步骤（ii）中，接种量均为1wt%。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（i）中，每升YPD培养基组分如下：
葡萄糖20g、蛋白胨20 g，酵母抽提物20 g，水定容至1000 mL。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（ii）中，每升BMGY培养基组分如下：酵母粉10g，蛋白胨20g，YNB13.4g，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，甘油10mL，加蒸馏水到1000mL。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（ii）中，每升BMMY培养基组分如下：酵母粉10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液，加蒸馏水到1000mL。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（iii）中，淀粉乳液质量浓度为10～30%。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（iii）中，反应转化条件为：40～55℃恒温震荡培养18～25h。
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| rehalose Synthesis by Sequential Reactions of Recombinant Maltooligosyltrehalose Synthase and Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase from Brevibacterium helvolum;YONG HWAN KIM 等;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20000822;第66卷(第11期);4620、4621页左栏 * |
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