CN101240254B - 一种耐有机溶剂蛋白酶高产菌以及该耐有机溶剂蛋白酶的基因和应用 - Google Patents
一种耐有机溶剂蛋白酶高产菌以及该耐有机溶剂蛋白酶的基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种耐有机溶剂蛋白酶高产菌株，其蛋白酶基因以及该蛋白酶在有机相中催化肽合成中的应用。该菌株分类命名为Pseudomonas aeruginosaPT121，其保藏登记号为：CCTCC M 208029，为革兰氏阴性菌株，能耐受一定浓度的多种有机溶剂。本发明分离克隆到该菌所产耐有机溶剂的蛋白酶编码基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。该耐有机溶剂蛋白酶具有产量高、比活高、溶剂耐受性强、作用pH范围广、耐高温等性质。该蛋白酶具有有机相中催化肽合成等工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐有机溶剂蛋白酶高产菌，其耐有机溶剂蛋白酶的基因，以及该耐有机溶剂蛋白酶在有机相中催化肽合成的应用，属于微生物学与酶学领域。
技术背景
蛋白酶是指能催化肽键水解的一类酶，自1913年被试验用于洗涤剂的添加成分以来，由于其重要的商业价值而被广泛关注。由于巨大的市场需求，蛋白酶逐渐成为三大工业用酶之一。当今蛋白酶的产量已经占据酶市场的40％以上，广泛应用于洗涤剂、食品、医药、皮革、有机合成、废物处理等领域。蛋白酶虽然广泛存在于几乎所有生物中，但由于微生物生产的蛋白酶主要是胞外酶，与动、植物来源的蛋白酶相比更适合工业化，所以微生物来源的蛋白酶的产量占目前蛋白酶总产量的2/3以上。
蛋白酶催化的最普通的反应是水解蛋白质中的肽键。通常情况下，蛋白酶催化水解肽键的反应是在特定的pH的缓冲溶液中进行的，而且蛋白酶对其所催化肽键的氨基酸残基具有特异性要求，即有着高度的区域选择性和立体选择性。随着酶工程和溶剂工程技术的发展，人们发现蛋白酶在有机溶剂中能够催化一些水溶液中不能进行的反应，比如：在非水条件下，蛋白酶能催化肽键的形成。大量的研究表明，有机溶剂中进行酶促反应有着许多的优点：1、增大各种有机底物的溶解度；2、具有高度的立体选择性和区域选择性，有机介质可改变选择性；3、控制反应平衡向所需方向移动，如水解酶在有机介质中能催化脱水缩合反应；4、有效防止微生物污染，产物易于分离纯化等。这使得有机溶剂中的酶反应越来越多的运用到实际中。如甜味剂Aspartame的前体物的合成，该反应以嗜热菌蛋白酶(thermolysin)为催化剂，在双相中合成前体二肽，含有底物(Z-L-Asp和L-PheOMe)的有机相被连续添加到反应器中，底物被连续萃取到含有酶的水相中，并在水相中合成前体二肽，然后二肽再被萃取到有机相中，使反应连续进行；再如在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽的合成中，先用胰蛋白酶在含有0.1M Tris/HCL缓冲溶液中(PH＝8.0)的极性有机溶剂乙醇中催化Bz-Arg-OEt和H-Gly-OEt生成Bz-Arg-Gly-OEt，再用木瓜凝乳蛋白酶在0.25M CHES/NaOH缓冲液(PH＝9.0，EDTA 10mM)的乙醇溶液中催化Bz-Arg-Gly-OEt和H-Asp(-OMe)2生成Bz-Arg-Gly-Asp(-OMe)OH，两步的产率分别为80％和70％，整个合成过程总共有8步，分别是：三种氨基酸的酯化、N端氨基酸的保护与取保护、两步酶催化的肽合成、最后一步酯水解；而化学合成方法却需要9～10步分别为：两种自由氨基酸的酯化、N端氨基酸的保护与取保护、Arg中胍基的保护与去保护、两步肽键合成反应、两步酯水解反应，如果副反应过多可能还要加上最后的提纯步骤，而胍基的保护和去保护由于成本过高，是化学合成中是尽量避免的。
酶催化的有机相反应体系一般分三类：1、水-疏水有机溶剂双相体系，酶溶解于水相，底物或产物则溶解于有机相，底物部分进入水相或在界面处与酶作用，此体系中底物的扩散与传质限制了酶反应速度。2、疏水有机溶剂单相体系，酶粉悬浮于有机溶剂中，为维持酶分子表层的“必需水”，避免采用极性有机溶剂；底物的扩散速率也是该体系的限制步骤。3、水-极性有机溶剂互溶体系，酶与底物存在于均一体系中具有很高的反应效率。三种体系中有机溶剂均对酶产生影响，酶易变性失活。特别是极性有机溶剂互溶体系，一般亲水有机溶剂的比例为10％～30％，高于某阈值的亲水有机溶剂就会夺去酶分子表面的结构水，而导致酶失活。
有机溶剂体系中酶催化的诱人前景与酶易失活的矛盾推动了酶的改造与非水酶学的发展。过去20多年，研究者致力于提高酶在有机溶剂中的稳定性，常用方法：1、使用疏水性有机溶剂作为反应介质并控制介质中的含水量，以保证酶的“必需水”；2、在反应介质中加入保护剂甘油、乙二醇、多元醇聚合物等，或加入环糊精等冷冻干燥保护剂，以提高酶分子在有机介质中的稳定性。3、利用固定化、包埋法、大分子修饰等理化修饰方法提高酶在有机介质中的活性和稳定性；4、利用基因改造提高酶的有机溶剂稳定性；然而上述方法只能在一定程度上改善酶在有机溶剂中的活性和稳定性。
天然具有有机溶剂稳定性的蛋白酶为近年来发现的一类新型蛋白酶，具有能稳定存在于有机溶剂中的天然特性。这类蛋白酶通常由耐有机溶剂极端微生物产生。尽管有机溶剂对微生物细胞具有极大的毒害，但近年来有关耐有机溶剂的极端微生物成为一个研究热点。由于耐有机溶剂极端微生物能在富含有机溶剂的环境中生存，因此由这类微生物分泌到包外的如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等也具有一定的有机溶剂耐受性。1995年Ogino(Appl.Environ.Microbiol.61，4258～4262)首次报道产耐有机溶剂蛋白酶的极端微生物，随后Ghorbel(Enzyme Microb.Technol.32，513～518)，Rahman(Biochem.Eng.J.13，73～77)，Gupta(Bioresour.Technol.97，1788～1793)，Ruiz(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.34，111～115)又相继报道了以耐有机溶剂极端微生物为来源的耐有机溶剂蛋白酶的研究。在目前所报道的耐有机溶剂蛋白酶产生菌绝大多数集中在假单胞属(Pseudomonas)和芽胞杆菌属(Bacillus)，且这类蛋白酶对多种有机溶有明显的耐受性，但目前所报道的蛋白酶的相关溶剂耐受浓度较低(约25％-v/v)，而且产量也相对较低(全都低于2000U/mL)，目前未见耐有机溶剂蛋白酶高产菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐有机溶剂蛋白酶高产菌、耐有机溶剂蛋白酶、耐有机溶剂蛋白酶基因及其在有机相中催化肽合成的应用，能为耐有机溶剂蛋白酶的生产提供良好的天然菌种来源，同时也为重组生物反应器来工业化廉价生产耐有机溶剂蛋白酶提供基因资源。
为了实现本发明的目的，本发明首先从油污土样中筛选获得一株耐有机溶剂蛋白酶高产菌，分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PT121，其保藏号登记号为CCTCC M 208029。
本发明对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PT121的生物特征进行鉴定，对该菌的革兰氏染色观察表明该菌株为革兰氏阴性菌株，无芽孢，采用透射电镜观察表明该菌株为单鞭毛细菌，大小为0.5μm×1～2μm。在肉汤培养基中生长24小时后，菌落大小为2～3mm，生长范围为30～40℃，最适生长温度为37℃，生长pH为6～11，最适pH为8.0，其生理生化特性表现在，过氧化氢酶反应、氧化酶反应、硝酸还原反应、明胶反应、葡萄糖、D-木糖以及D-果糖利用的结果为阳性，乳糖、麦芽糖以及甘露糖利用结果为阴性，在有氧条件下生长。
本发明对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PT121经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，表明该菌株与铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa相似度(SIM)为0.748，经16SrDNA序列分析表明与该序列相似度高于98％的菌株均为Pseudomonas属菌株，其中与Pseudomonas aeruginosa MML2212相似度为99％。
本发明针对该菌株进行了有机溶剂耐受性实验，发明菌株Pseudomonas aeruginosaPT121能在含有10％不同有机溶剂的培养基中生长。
本发明对该耐有机溶剂蛋白酶产生菌PT121进行了产酶优化，优化后产酶量高达10876U/mL。
本发明对该菌产生的耐有机溶剂蛋白酶进行纯化，经过一步纯化达到电泳纯，其比活性高达134045U/mg。
本发明对该耐有机溶剂蛋白酶进行了酶学性质的研究，实验证明该蛋白酶对多种有机溶剂都具有良好的耐受性，并且耐受浓度高达50％(v/v)以上，大大优于多数已经报道耐有机溶剂蛋白酶耐受浓度(25％，v/v)；该耐有机溶剂蛋白酶的最适pH为8.0，有效作用的pH值较宽，为6～10，为中性偏碱性蛋白酶，其最佳反应温度为60℃，60℃处理1小时，其酶活还维持在80％，表明其具有良好的热稳定性。
本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂蛋白酶的编码基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。通过PCR法分离克隆了这一耐有机溶剂蛋白酶基因，DNA全序列分析结果表明，该耐有机溶剂蛋白酶基因全长1497个核苷酸，编码498个氨基酸，成熟蛋白酶为301个氨基酸，与铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa strain K同源性为98％，蛋白质一级结构同源性为97％。其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。
本发明还提供了耐有机溶剂蛋白酶PT121在有机相中催化肽合成中的应用。
将纯化获得的蛋白酶PT121成功应用到有机相合成肽的反应中，结果表明在含有50％(v/v)DMSO的Tris-HCl(pH8.0，0.05M)中，产物甜味剂Aspartame的前体Cbz-Asp-Phe-NH2相对Cbz-Arg的生成率高达85～95％，而且产物直接在溶剂中析出，非常易于回收。
本发明的有益效果在于所提供的耐有机溶剂蛋白高产菌Pseudomonas aeruginosaPT121以及其耐有机溶剂蛋白酶基因证明了该有机溶剂蛋白酶具有高产率、易纯化、具有高比活、有机溶剂耐受性强、作用pH范围广、耐高温等优点。该耐有机溶剂在有机溶剂中催化小肽前体的成功应用，进一步证明该耐有机溶剂蛋白酶在有机溶剂催化反应所表现的优良性质，该蛋白酶将来在有机相催化肽合成以及制药、毛纺、洗涤、皮革加工等行业的应用潜力巨大。
附图说明
图1 PT121菌体的透镜电镜照片(5000×)
图2菌株PT121的溶剂耐受性
图3纯化后的耐有机溶剂蛋白酶的SDS-PAGE电泳分析
图4耐有机溶剂蛋白酶的最适pH
图5耐有机溶剂蛋白酶的pH稳定性
图6耐有机溶剂蛋白酶的最适反应温度
图7耐有机溶剂蛋白酶的热稳定性
本发明的微生物分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PT121，保藏日期为2008年3月6日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号：CCTCC M 208029。
具体实施方式
实施例一
本实验说明产生耐有机溶剂蛋白酶的天然菌株的筛选程序。
采用不同浓度环己烷、甲苯、丙酮等有机溶剂为筛选压力从油污土样中筛选获得耐有机溶剂极端微生物。采用牛奶琼脂平板培养基，具体配方为：胰蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，脱脂奶粉25g/L，琼脂12g/L。将所筛选到的耐有机溶剂微生物接种于牛奶琼脂平板，根据菌落与透明圈大小的比值，初步筛选蛋白酶产量高的菌株。此方法筛选到具有蛋白酶产量高的耐有机溶剂极端微生物10株。
为了进一步检测所分泌蛋白酶的溶剂耐受性，对10株菌的蛋白酶产生能力和所产蛋白酶的耐有机溶剂性质进行全面的检测。将所筛选到的高活力菌株接种到产酶发酵培养基，具体配方为：胰蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 1.0g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4 0.3g/L，CaCl2 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，甘油6.3g/L，pH7.0。培养温度为37℃，培养时间为72h，摇床转速为180rmp。发酵结束后，10,000rmp 4℃离心15min，取上清为粗酶液。取粗酶液1mL分别加入等体积的氯仿、苯、己醇、异戊醇、丁醇、异丙醇、丙酮、乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)，于30℃、150rpm震荡处理24h，以酪蛋白为底物检测蛋白酶剩余酶活；选取具有最高剩余活力的菌株作为耐有机溶剂蛋白酶生产菌株。
蛋白酶活力检测方法为：配制酪蛋白含量为2％的pH为8.0的Tris-HCl缓冲液作为反应底物。取1mL稀释酶液加入1mL反应底物，40℃保温10min，加入4mL TCA反应终止液(0.11M三氯乙酸，0.22M醋酸钠，0.33M醋酸)终止反应，4℃放置15min，15000rpm离心15min，于280nm处检测紫外吸光值。每1个单位(U)蛋白酶**酶活定义为，在相应条件下，每分钟催化产生1μg酪氨酸(U＝μg/min)所需的酶量为1个酶活力单位。通过酶活性检测以及有机溶剂稳定性检测，其中一株具有优良耐受性的蛋白酶生产菌株所产蛋白酶活力高达10876U/mL，经过BIOLOG自动细菌鉴定仪鉴定和16SrDNA序列分析，表明该菌株属于铜绿假单胞菌属，并命名为Pseudomonas aeruginosaPT121，该菌即为进一步研究的材料。
实施例二
本实验说明耐有机溶剂极端微生物Pseudomonas aeruginosa PT121的生物学性质。
生理生化性质
对该菌株的革兰氏染色观察表明该菌株为革兰氏阴性菌株，无芽孢，采用透射电子显微镜观察(图1)表明该菌为单鞭毛细菌，大小为0.5μm×1～2μm。在肉汤培养基中生长24小时后，菌落大小为2～3mm，生长范围为30～40℃，最适生长温度为37℃，生长pH为6～11，最适pH为8.0，其生理生化特性表现在，过氧化氢酶反应、氧化酶反应、硝酸还原反应、明胶反应、葡萄糖、D-木糖以及D-果糖利用的结果为阳性，乳糖、麦芽糖以及甘露糖利用结果为阴性，在有氧条件下生长。该菌部分生理生化鉴定特征如表1。
表1菌株PT121的部分生理生化特征
| 特征 | 结果 | 特征 | 结果 |
| 过氧化氢酶反应氧化酶反应硝酸还原反应明胶反应葡萄糖 | +++++ | D-木糖D-果糖乳糖麦芽糖甘露糖 | ++--- |
菌株的溶剂耐受性实验
以培养过夜的Pseudomonas aeruginosa PT121培养物为种子液，以2％的接种量接种至MLB培养基，分别加入18种有机溶剂(图2)，每500mL三角瓶装液量为50mL(其中有机溶剂含量为30％)，以橡胶塞封口，与37℃摇床180rpm培养，分别在24h，36h和48h取样检测细胞干重(mg/mL)，实验结果如图2所示。实验表明菌株PT121能在含有不同浓度有机溶剂的培养基中生长，其中Log Po/w高于3.0的有机溶剂如十四烷，癸烷，壬烷，十二烷醇，辛烷，庚烷，己烷，环己烷等有机溶剂对PT121的生长影响较小；而Log Po/w低于3.0的有机溶剂甲苯，氯仿，苯，己醇，异戊醇，丁醇，异丙醇，丙酮，乙醇，DMF，DMSO等能明显抑制菌株PT121的生长。实验表明菌株PT121对高浓度的有机溶剂有一定的耐受性。
实施例三
本实验说明耐有机溶剂蛋白酶的纯化程序。
首先将菌株在产酶培养基中培养72h后，10,000rmp在4℃离心15min，取上清作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，一边搅拌一边缓慢加入NaCl到终浓度为1.6mol/L。将处理过的上清液加到用含1.2mol/LNaCl，0.05M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡过的Phenyl sepharose Fast Flow层析柱，用0.05M的Tris-HCl(pH8.0，NaCl含量为1mol/L)的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。发酵液上清仅经过一步色谱柱分离，通过SDS-PAGE(图3)分析表明纯化蛋白酶已经达到电泳纯。该蛋白酶亚基分子量约为33kDa。蛋白酶纯化的回收率和纯化倍数见表2，经过一步分离纯化后，纯化倍数为4.9，回收率为52％，最终蛋白酶比活达到134045U/mg。
表2耐有机溶蛋白酶PT121的纯化步骤及结果
| 总活力(U) | 总蛋白(mg) | 比活力(U/mg) | 回收率(％) | 纯化倍数 | |
| 粗酶液Phenly sepharose FF | 174388981 | 0.6420.067 | 27162134045 | 10052 | 14.9 |
注：蛋白质浓度采用考马斯亮兰法测定
实施例四
本实验说明耐有机溶剂蛋白酶PT121的酶学性质的测定方法。
耐有机溶剂蛋白酶的溶剂耐受性检测：
将纯化后的1mL蛋白酶稀释液分别加入17种等体积的有机溶剂(表3)置于密封的试管中，以加入等体积0.05M Tris-HCl缓冲液中(pH9.0)为对照，30℃，140rpm振荡。分别在5天，10天和15天取样，以酪蛋白为底物检测蛋白酶活力，结果如表3所示。耐有机溶剂蛋白酶PT121具有良好的有机溶剂耐受性，在已经研究的17种有机溶剂中，异丙醇、丙酮、乙醇、DMF对酶活影响较大，在5天以后，相对酶活力都在70％以下。氯仿、己醇、异戊醇和丁醇对蛋白酶酶活力有一定影响，但在15天后相对酶活力仍然保持在60％以上。其余的有机溶剂对蛋白酶的相对酶活力几乎没有影响。实验表明耐有机溶剂蛋白酶PT121对多种有机溶剂具有优良的耐受性。
表3有机溶剂对蛋白酶稳定性的影响
| 有机溶剂 | Log P | 酶活力(％) |
| 对照十四烷癸烷辛烷庚烷己烷环己烷甲苯氯仿苯己醇异戊醇正丁醇DMSO异丙醇丙酮乙醇DMF | 7.65.64.54.03.53.22.52.02.01.81.30.8-1.350.05-0.23-0.24-1.0 | 100<sup>a</sup>103<sup>a</sup>103<sup>a</sup>103<sup>a</sup>102<sup>a</sup>103<sup>a</sup>102<sup>a</sup>100<sup>a</sup>66<sup>a</sup>127<sup>a</sup>88<sup>a</sup>94<sup>a</sup>67<sup>a</sup>100<sup>a</sup>23<sup>b</sup>17<sup>b</sup>52<sup>b</sup>62<sup>b</sup> |
注：a，30℃，140rpm保温15天；b，30℃，140rpm保温5天
耐有机溶剂蛋白酶最适反应pH值和pH稳定性的测定：
以不同pH值的酪蛋白为底物，以pH8.0条件下的反应活力为参照(100％)，不同pH体系中的酶活如图4所示，PT121菌株所产蛋白酶在pH8.0反应体系中具有最佳活力。从图5中可以看出蛋白酶PT121有效作用的pH值较宽，为6～10，为明显的中性偏碱性蛋白酶。以原始酶液的酶活为参照检测蛋白酶PT121的pH稳定性，将蛋白酶PT121加入pH4～12的缓冲溶液中30℃保温1h后测量酶活力，实验表明该蛋白酶在pH5～11的范围具有很高的稳定性，在pH12的溶液中保温1h以后仍然保留50％以上酶活力。
耐有机溶剂蛋白酶最适反应温度和热稳定性的测定：
耐有机溶剂蛋白酶的最适温度的测定为在0.05M Tris-HCl缓冲体系(pH8.0)下，在不同的温度条件下以酪蛋白为底物进行酶促反应。热稳定测定：蛋白酶在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下处理1h以后，测定残留酶活。酶的最适反应温度测量结果表明(图6)，纯化后的蛋白酶在40℃～70℃反应时，具有较高的蛋白酶活力。该蛋白酶最适反应温度为60℃，在80℃条件下反应仍然具有最佳情况下20％的酶活力，在热稳定性实验中(图7)，蛋白酶60℃处理1h后仍然保留80％左右的酶活力，这表明该蛋白酶具有较好的热稳定性。
实施例五
本实验说明耐有机溶剂弹性蛋白酶编码基因的分离克隆程序
采用酚-氯仿法抽提菌体总DNA。根据铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa strainK及其弹性蛋白酶基因序列，在CDS两端外各约100bp处设计引物，扩增有机溶剂蛋白酶的CDS编码序列。将CDS编码序列的PCR片段电泳回收后克隆到pMD18-T载体，进行序列分析。设计的引物为：
EUF：AGGACTGATACGGCTGTTCCGATC
EUR：AACGGCCCAAGCGACATAAAGCA
PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30sec 65℃退火30sec，72℃延伸1min30sec；循环19轮，每次循环退火温度降低1℃；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸1min；循环16轮后，72℃保温10min。根据该反应条件，扩增到了1.7kb的PCR片段，根据测定此蛋白的分子量。推断出此酶成熟蛋白的编码基因长度约1kb。将此片段连接到Pmd18-T载体，进行序列测定。结果表明，此片段有一个全长为1497bp的阅读框，含有信号肽序列23个氨基酸，编码成熟蛋白酶的氨基酸301个。
实施例六
本实验说明耐有机溶剂蛋白酶PT121在有机催化肽合成中的应用
以50mM的Cbz-Asp-OH和100mM的L-Phe-NH2为底物，分别以乙腈、丙酮、乙醇、DMSO、DMF为有机溶剂，在50mM Tris-HCl(pH8.0)反应缓冲中分别加入等体积的上述溶剂，反应总体积为1mL，加入纯化的PT121蛋白酶约1mg/mL，在37℃水浴中静止反应，每两小时取样以蒸馏水(含0.05％三氟乙酸)/乙腈(60/40，v/v)稀释20倍，以化学合成的产物为标准品采用反向HPLC检测产物，结果表明，DMSO为最佳溶剂，在该条件下，Cbz-Asp-Phe-NH2相对于Cbz-Asp-OH的生成率在8h后达到85～95％。
序列表
Claims (2)
1.一种耐有机溶剂蛋白酶高产菌，其分类命名为铜绿假单胞菌属的一个新菌株，命名为Pseudomonas aeruginosa PT121，其保藏登记号为CCTCC M 208029。
2.根据权利要求1所述的耐有机溶剂蛋白酶高产菌Pseudomonas aeruginosaPT121在有机相肽合成体系中的应用，其特征在于其所产生的蛋白酶PT121在高浓度的DMSO体系中，高效催化底物Cbz-Asp-OH和L-Phe-NH2合成甜味剂Aspartame的前体Cbz-Asp-Phe-NH2，收率到达85～95％。
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