CN101353649B - 一种酯酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酯酶及其编码基因与应用。本发明公开的酯酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)其氨基酸序列为序列表中的序列2；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能催化水解羧酸酯的由(a)衍生的蛋白质。本发明还公开了编码该酯酶的基因。本发明的酯酶适用于化工、食品、生物转化、医药工业和其它相关工业。

Description

一种酯酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种酯酶及其编码基因与应用。

背景技术

酯酶(esterase，EC3.1.1.1)是一类能催化水解羧酸酯的所有酶的总称，又称羧酸酯酶(carboxylesterase)。既作用于脂肪族酯，也作用于芳香族酯，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物中(KE Jaeger，et al.Trends in Biotechnology，1998，16(9)：396-403)。

酯酶作为重要的工业酶类主要应用到酯合成、内酯合成、酯交换、多肽合成、立体异构体的转化和拆分等催化反应中，酯酶催化不需要辅酶且具有反应条件温和、方法简便、催化活性高、选择性强、产物易于分离和易于回收等优点。因此被广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器和生物医学等领域(Jaeger KE，et al.Trends in Biotechnology，1998，16(9)：396-403；中国专利，CN101225369，2008年7月23日)。

国内外专利和文献中已经报道了多种从不同微生物中分离的酯酶蛋白及编码基因(Jaeger KE，et al.FEMS Microbiol.Rev.1994，15：29-63；Arpigny JL，Jaeger KE.Biochem J.1999，343：177-183)。我国学者孙谧等报道了来源于海洋微生物Bacillussp.MP-2的酯酶(CN101225369，2008年7月23日)；Dan E.Robertson等报道了多种微生物来源的酯酶(美国专利，US Patent5942430，1999年8月24日)；Makoto等报道了Ideonella sp.0-0013的酯酶基因(美国专利，US Patent7341857，2008年3月11日)；YAMADA等报道了Acinetobactercalcoaceticus KM109的酯酶基因(日本专利，Publication number2000-245455，2000年12月9日)；Young等报道了Lactobacillus casei CL96的酯酶基因(YoungJ.Choi et al.Applied Environmental Microbiology.2004，70(6)：3213-3221)；Satoshi Kakugawa等报道了Thermotoga maritima的酯酶基因(Satoshi Kakugawaet al.Appl Microbiol Biotechnol.2007，74：585-591)。

现有微生物酯酶大多来源于可培养的微生物(Jürgen Pleiss et al.Journalof Molecular Catalysis B：Enzymatic.2000，10(5)：491-508)。一些极端微生物产生的酯酶在高温或低温等环境下仍能保持良好的生物催化活性，因此引起人们的特别关注(Vincenzo Aurilia etal.Gene2008，410(2)：234-240)。然而极端微生物的分离和培养存在一定困难，限制了特殊环境中极端微生物酯酶基因的开发和应用。

研究表明，目前环境中可培养微生物仅占其总量的1％，99％的微生物尚未得到分离培养(Manuel Ferrer et al.Current Opinion in Biotechnology.2005，16(6)：588-593)。为了有效获取环境中未得到分离培养的微生物的基因资源，元基因组学(Metagenomics)技术应运而生。元基因组学是指不依赖于微生物的纯培养，而直接从环境或共生体中克隆出其中存在的所有基因组DNA，然后筛选和分离感兴趣的基因，经过克隆和异源表达得到新的酶、活性天然产物或修饰的天然产物(JoHandelsman et al.Current Opinion in Biotechnology.2003，14：303-310；Manuel Ferrer et al.Current Opinion in Biotechnology.2005，16(6)：588-593)。目前已有利用元基因组学技术从土壤、淡水和海洋等环境中克隆新的酯酶基因的报道(Lee SW et al.Appl Microiol Biotechnol.2004，65：720-726；Ravi Ranjan et al.Biochemical and Biophysical Research Communications.2005，335：57-65；F Hardeman et al.FEMS Microbiology Ecology.2007，59：524-534)。海洋环境，尤其深海由于其特殊的生态环境赋予了海洋微生物与其环境相适应的独特的生理代谢和生物活性物质，成为人们获取新基因资源的天然宝库。我国拥有广阔的海域资源，从中获得新的微生物资源逐渐引起人们的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种酯酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的酯酶，命名为EstB，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)其氨基酸序列为序列表中的序列2；

(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能催化水解羧酸酯的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由535个氨基酸残基组成。

为了使a)中的EstB便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

 

标签

残基

序列

 

Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的EstB可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的EstB的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码EstB的基因也属于本发明的保护范围。

编码EstB的基因具体可为如下(a)或(b)或(c)的基因：

(a)其核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

(b)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码能催化水解羧酸酯的蛋白的DNA分子；

(c)与(a)的基因具有90％以上的同源性，且编码能催化水解羧酸酯的蛋白的DNA分子。

所述步骤(c)中的基因，与(a)的基因最好有95％以上的同源性。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt’s液，100ug/ml鲑鱼精DNA的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由1608个碱基组成，编码具有序列表中序列2所示的蛋白质，自5′末端第1-3位为起始密码子。

扩增上述EstB基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述EstB基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

本发明的EstB基因来源于深海环境，并证实其在较低的温度条件下具有良好活性和稳定性，适用于化工、食品、生物转化、医药工业和其它相关工业。

附图说明

图1为重组质粒pFEstB的构建示意图。

图2为重组质粒pUEstB的构建示意图。

图3为重组质粒pEEstB的构建示意图。

图4为重组菌BL21EstB的酯水解活性结果。

具体实施方式

a)深海沉积物元基因组DNA的提取

深海沉积物取自中国南海，水深778.5米，经度110°22.47’E，纬度17°33.35’N。称取5g沉积物样品，加入13.5ml DNA提取液(100mmol Tris-HCl，100mmol EDTA，100mmol磷酸钠，1.5mol NaCl，1g/100ml CTAB，pH8.0)，再加入100μl蛋白酶K(10mg/ml)，225rpm水平摇床37℃振荡30分钟，然后加入1.5ml20g/100ml的SDS，65℃水浴2小时，每隔15-20分钟轻柔颠倒几次，室温6000×g离心10分钟；收集上清，转移至50ml离心管，沉淀中加入4.5ml DNA提取液和0.5ml20g/100ml SDS，65℃水浴10分钟，6000×g离心10分钟，收集上清与上次上清合并；重复上述操作，收集上清与前两次上清合并；上清与等体积的氯仿-异戊醇(体积比24：1)混合，离心，吸取水相转移至另一50ml离心管，以0.6倍体积的异丙醇室温沉淀1小时，16000×g离心20分钟，收集沉淀，用冷70％乙醇洗涤沉淀，沉淀晾干后重悬于灭菌去离子水，脉冲场琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA片段。

b)深海沉积物元基因组文库的构建与筛选

将上述粗提DNA进行脉冲场琼脂糖凝胶电泳，电洗脱纯化回收36-48kb大片段DNA，用CopyControl^TMFosmid Library Production Kits的End-Repair EnzymeMix进行末端补平。然后以0.5×TE缓冲液(Tris-HCl/EDTA，pH8.0)进行点透析2小时，换30g/100ml PEG8000浓缩DNA。紫外分光光度计测定DNA浓度，按插入片段分子数：pCC2FOS载体分子数为1：10的比例以Fast-Link DNA连接酶室温2小时进行连接，再次以0.5×TE缓冲液(Tris-HCl/EDTA，pH8.0)进行点透析2小时，换30g/100ml PEG8000浓缩DNA，取10μl连接后的DNA加入到25μl冰上融化的MaxPlax Lambda Packaging Extracts，30℃，90分钟温育后加入另外25μlMaxPlax Lambda Packaging Extracts，30℃，90分钟温育，加入PDB缓冲液(10mMTris-HCl[pH8.3]，100mM NaCl和10mM MgCl₂)至终体积1ml。取大肠杆菌EPI300-T1^R单菌落接入LB液体培养基220rpm，37℃过夜培养进行活化。5ml过夜培养物加入到50ml新鲜LB培养基(含10mM MgSO₄)，37℃，220rpm振荡至OD₆₀₀＝0.8-1.0。取50μl包装后混合物加入950μl上述培养的大肠杆菌，37℃，20分钟温育，取部分菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基，37℃过夜培养计算文库克隆数；剩余菌液加入终浓度20ml/100ml的甘油，储存于—80℃。

取部分文库涂于含12.5μg/ml氯霉素和1ml/100ml三丁酸甘油酯的LB固体培养基，28℃培养36-48小时，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆，此阳性克隆命名为EPI300EstB。将EPI300EstB划线分离单菌落接入含12.5μg/ml氯霉素的50ml液体LB培养基，37℃，220rpm培养12小时后，加入50μl的1000×CopyControlInduction Solution，继续培养5小时，碱裂解法提取质粒，此质粒命名为pFEstB，图1为pFEstB的构建示意图，酶切分析证明pFEstB含有的插入片段，大小约为36kb。

将pFEstB以Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收2-5kb DNA片段。取2μl回收的DNA片段加入0.5μl BamHI酶切后去磷酸化处理的质粒pUC118，以T4DNA连接酶于16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于含100μg/ml氨苄青霉素和1ml/100ml三丁酸甘油酯的LB固体培养基，28℃培养48小时，菌落周围有明显水解圈的即为阳性克隆。提取阳性克隆质粒，命名为pUEstB，图2为pUEstB的构建示意图，酶切鉴定，重组质粒pUEstB含有的外源DNA片段，大小约为4.0kb，含pUEstB的大肠杆菌命名为大肠杆菌DH5αEstB。

采用Sanger双脱氧法对重组质粒pUEstB进行测序，测序得到插入片段总长度3.8kb，含有一个1608碱基的开放阅读框，其开放阅读框的核苷酸序列为序列表中序列1所示，编码序列表中序列2的蛋白质。序列比对表明此蛋白为脂肪酶/酯酶超家族的蛋白，与已有数据库中Chlorobium ferrooxidans DSM13031的羧酸酯酶B具有最高相似性36％。

实施例2、EstB基因的获得及其功能验证

1)EstB基因的获得

人工合成序列表中序列1的DNA分子，并在序列两端分别加入NdeI识别序列和HindIII识别序列，人工合成的DNA分子经限制性内切酶HindIII和NdeI双酶切后，与经同样酶切的质粒pET28a在T4DNA连接酶作用下16℃过夜连接，获得重组质粒pEEstB，图3为重组质粒pEEstB的构建示意图，重组质粒pEEstB转化感受态大肠杆菌BL21，涂于含50μl/ml卡那霉素的LB培养基上，37℃培养16小时。菌落PCR筛选阳性克隆，所得阳性克隆命名为BL21EstB。载体pET28a转化感受态大肠杆菌BL21，得到的重组菌BL21-28a，作为对照。

重组菌BL21EstB和BL21-28a单菌落分别接种于含50μl/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养16小时后，按体积百分比为1％接种量转接新鲜含50μl/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，30℃振荡培养3-5小时。

利用镍离子亲和层析柱纯化表达的EstB蛋白，纯化蛋白经SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE检测结果表明，重组菌BL21EstB表达的蛋白为单一条带，分子量约为58000道尔顿。

2)重组菌BL21EstB的酯水解活性

用3g/100ml聚乙烯醇(PVA)溶液制备10ml/100ml三丁酸甘油酯乳化液。10ml三丁酸甘油酯乳化液加入到90ml LB培养基，高压灭菌后，加入终浓度为50μl/ml卡那霉素，铺制平板。平板冷却后涂布8μl500mM IPTG和40μl40mg/ml X-gal混合液，待吸干后分别点种重组菌BL21EstB和BL21-28a，30℃培养36小时。

将上述三丁酸甘油酯平板中的三丁酸甘油酯换成橄榄油，灭菌后加入终浓度0.001g/100ml过滤除菌的罗丹明B，得到罗丹明B-橄榄油平板，其他步骤同上。培养后的平板在紫外灯下观察，菌落周围是否出现荧光。

观察结果如图4所示，表明重组菌BL21EstB在三丁酸甘油酯琼脂平板上形成明显的透明圈，对照(重组菌BL21-28a)无透明圈；而在罗丹明B-橄榄油平板上均无荧光出现，上述实验结果证明EstB基因的表达产物具有酯水解活性，且只对短链酯有活性。图4中，左图为三丁酸甘油酯平板；右图为罗丹明B—橄榄油平板。A和C为重组菌BL21EstB；B和D为重组菌BL21-28a。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种酯酶及其编码基因与应用

<130>CGGNARW81715

<160>2

<210>1

<211>1608

<212>DNA

<213>

<400>1

<210>2

<211>535

<212>PRT

<213>

<400>2

Claims (5)

1.一种蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列2。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。

5.含有权利要求2所述基因的重组菌。

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