CN1187443C - 真菌碱性丝氨酸蛋白酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种真菌碱性丝氨酸蛋白酶及其制备方法和应用，属生物技术领域。该真菌碱性丝氨酸蛋白酶来源于微生物粉红粘帚霉Gliocladium roseum GR87，该菌株已于2002年10月9日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.0807；粉红粘帚霉GR87菌株通过液体发酵后提取纯化碱性丝氨酸蛋白酶。该酶能降解线虫体壁的蛋白质，具有杀线虫活性，可应用于植物寄生线虫生物防治领域。也可作为洗涤剂和去污剂生产的添加用酶，应用于洗涤剂和去污剂的生产上。本发明产品具有酶活力高，对线虫固定效果好，酶学性质特征优越等优点。
Description
技术领域：
本发明涉及一种真菌碱性丝氨酸蛋白酶及其制备方法和应用，属生物技术领域。
背景技术：
碱性蛋白酶(Alkaline Protease)是指pH值在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，最早发现于猪胰脏中。1913年Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用(Fogarty WM，1974)，1945年瑞士的Dr.Jaag等发现了微生物碱性蛋白酶(Rose A H，1980)，使碱性蛋白酶有可能广泛用于洗涤剂工业，具有很大的经济和社会效益。
目前用于碱性蛋白酶的生产菌和研究对象主要是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及短小芽孢杆菌(Bacillus pumillus)(夏麟培，陈丙瑜，1989)，如我国目前使用的2709地衣芽孢杆菌和1213地衣芽孢杆菌，嗜碱性短小芽孢杆菌(Alkaliphilic Bacillus pumillus)B45，并在不断选育新菌株。
碱性蛋白酶主要应用于加酶洗涤剂，在制革、丝绸等工业也有广泛的用途。一些科学家也进行了利用降解酶来进行防治线虫病害的试验，降解酶可望成为线虫生防的热点之一。
发明内容：
本发明的目的是从丝状真菌中筛选高产蛋白酶菌株，为研制开发高活力酶制剂寻找新的菌株来源。本发明的另一目的是通过碱性丝氨酸蛋白酶在线虫生防上的应用，为线虫生物防治提供新产品和培育具有线虫抗性作物品种提供新酶源。
本发明从丝状真菌粉红粘帚霉Gliocladium roseum GR87菌株(已于2002年10月9日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.0807)中分离得到一种真菌碱性丝氨酸蛋白酶，是首次报道该类真菌产碱性蛋白酶。我们将获得的纯蛋白酶命名为Lmz1，通过对其性质的鉴定，确定其在洗涤行业和线虫生物防治领域有应用前景。
本发明的真菌碱性丝氨酸蛋白酶，具有如下特性：
1.pH效应
在45℃时将此蛋白与生色蛋白质Azocoll温育12小时，在pH5-13范围内均有活性；此蛋白酶在45℃时，与生色蛋白质Azocoll反应10分钟的最适pH为11-12。
2.温度效应
此蛋白酶在pH7.4(采用Tris-HCl缓冲液体系)时在75℃与生色蛋白质Azocoll反应10分钟仍具有最高活性的35％，最适温度为55-60℃。
3.分子量
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的分子量为31,000±2000Da。
4.等电点
通过等电聚焦电泳测得的等电点为10.5。
5.抑制剂效应
该碱性蛋白酶能被苯甲磺酰氟(PMSF)特异性抑制，说明该酶属于丝氨酸蛋白酶。
该酶的制备方法为真菌培养上清液的冰冻干燥浓缩，浓缩物溶于含2M硫酸铵的高盐磷酸缓冲液(pH7)后上疏水相互作用层析柱，将洗脱峰超滤浓缩后上凝胶过滤层析柱进行脱盐和精细纯化，即可获得纯化的碱性蛋白酶。
此蛋白酶不仅能水解普通蛋白质和肽，而且能降解线虫体壁中的胶原蛋白。
本发明是这样实现的，将粉红粘帚霉Gliocladium roseum GR87菌株，经试管培养后，接种于液体培养基扩大培养，然后过滤菌丝体获得粗酶液。采用硫酸铵分级沉淀，沉淀溶于PBS(pH7.0)缓冲液，应用快速液相蛋白质层析系统对酶进行分离和纯化。
将GR87菌丝体或孢子接种到试管培养基斜面上，培养配方为CMA，22℃下培养3-4天，获得试管种。将斜面试管种接种到液体培养基中，培养基(命名为LMZ)的配方为0.1％明胶，0.1％酵母浸出粉，0.9％蛋白胨，0.05％硫酸铵，0.001％FeSO4.7H2O，0.05％MgSO4.7H2O，1.129％Na2HPO4.12H2O，1.238％NaH2PO4.2H2O，蒸馏水定容至1升，pH为6.5，22℃下摇床(转速150rpm)培养时间8天，然后过滤菌丝体获得粗酶液。采用硫酸铵分级沉淀，沉淀溶于PBS(pH7.0)缓冲液，应用快速液相蛋白质层析系统对酶进行分离和纯化。
产生该真菌碱性蛋白酶的微生物之一的粘帚霉属的微生物粉红粘帚霉GR87具有以下的真菌学特性：
(1)形式：粘帚霉
(2)分生孢子梗：有两种，a，主分生孢子梗，轮状分枝，长100-200um，瓶梗3-4轮，大小为17-30×3um，分生孢子头状分散；b，次分生孢子梗，部分在菌落中心形成，聚集成扫帚状，瓶梗紧紧压缩成4-7轮，大小为10-18×2-3um。
(3)分生孢子：直立于气生菌丝或浸没菌丝上。椭圆形，无色，壁光滑，大小为10-12×3-4um，分生孢子粘着形成覆瓦状的柱或不规则的粘层块，上述两种分生孢子梗上产生的分生孢子延长，稍不对称，顶端偏斜，圆形，基部稍突出，无色，壁光滑，大小为5-7×3-4um。
(4)菌落形态特征：在麦芽汁琼脂培养基(20％麦芽，20％琼脂)上于20℃，生长10天其菌落直径可达2.4-3.5cm，颗粒状至毡状，白色、粉红色或橙红色。
粉红粘帚霉GR87菌株蛋白酶生产力改进的突变体可以作为产生本发明蛋白酶的真菌。制备这类突变体的方法，可以是常规的方法，例如利用紫外辐射或者诱变剂(如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG))对原始菌株进行人工诱导突变后，将培养物接种到液体沙氏培养基中，培养4到6天后取上清液点入含有酪蛋白的蛋白酶检测平板上，根据所产生的水解圈的大小，通过选择大水解圈筛出具有更好生产力的突变体，而且可以通过在合适的宿主细胞中利用基因扩增改进生产力，用与合适的自我复制DNA偶联的本发明蛋白酶的基因转化所说的宿主细胞。
本发明的真菌碱性丝氨酸蛋白酶可应用于防治植物寄生线虫的生防，也可作为洗涤剂和去污剂生产的添加用酶的应用。本发明产品具有酶活力高，酶学性质特征优越等优点。
具体实施方式：
下面是具体说明本发明的例子，但本发明不仅仅限于以下例子。
实施例1：粉红粘帚霉的培养
将GR87菌丝体或孢子接种到试管培养基斜面上，培养配方为CMA，22℃下培养3-4天，获得试管种。将斜面试管种接种到装有50mL液体培养基的500mL锥形瓶中进行液体发酵，培养基配方为0.1％明胶，0.1％酵母浸出粉，0.9％蛋白胨，0.05％硫酸铵，0.001％FeSO4.7H2O，0.05％MgSO4.7H2O，1.129％Na2HPO4.12H2O，1.238％NaH2PO4.2H2O，蒸馏水定容至1升，pH为6.5。于22℃下，150rpm摇床培养8天，然后过滤除去菌丝体获得粗酶液。
实施例2：纯蛋白酶(命名为Lmz1)的分离和纯化
采用硫酸铵分级沉淀，沉淀溶于PBS(pH7.0)缓冲液，应用快速液相蛋白质层析系统对酶进行分离和纯化。分部收集酶液，用含有0.5％酪蛋白的检测平板检测酶活力，经SDS-PAGE检测酶的纯度直到获得单一的电泳条带。通过多次实验，获得了具有很高活力的纯酶Lmz1。
实施例3：碱性蛋白酶固定线虫的生测实验
将获得的纯酶Lmz1经过透析脱盐、冷冻干燥后，取适量溶于纯水配制的25mMTris/HCl(pH7.4)缓冲液中，经蛋白/核酸定量仪测定浓度。在燕麦片培养基(适量燕麦片溶于水中制成半固体状，灭菌即可)上培养(Panagrellus redivivus)腐生线虫，从培养瓶的瓶壁取300条线虫，用25mM Tris/HCl(pH7.4)缓冲液清洗两次，吸取30条线虫置于1.5mL离心管中，加入60uL纯化好的酶Lmz1，做5个重复。室温静置24小时后于显微镜低倍镜下计算已被杀死的线虫的数目和未被杀死的数目，同时做两个不加酶Lmz1的对照。实验结果显示该酶有显著的杀线虫的活性，线虫杀死率(杀死的线虫占总线虫数的比率)为71％。我们对已杀死的线虫做了显微摄影，证明该酶对线虫体壁有显著的降解作用。
实施例4：碱性蛋白酶的pH耐受性测定
将10uL酶液分别加入200uL pH3-13的缓冲液中与2.5mg生色蛋白质Azocoll反应30分钟，用蛋白/核酸定量仪测量520nm处的吸光度值以定量酶Lmz1在不同pH下的酶活(以pHl2条件下的活性为100％)，结果如表1。可以看出，该酶的最适pH为11-12，而且在pH5-12范围内均有活力。
表1
PH 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
活性(％) 0 2 58 63 71 77 77 83 90 100 85
实施例5：碱性蛋白酶温度及耐受性测定
将40uL酶液加入500uLTris/HCl(pH7.4)缓冲液中，在不同温度的水浴锅里与2.5mg生色蛋白质Azocoll保温30分钟，用蛋白/核酸定量仪测量520nm处的吸光度值以定量酶Lmz1在不同温度下的酶活(以60℃条件下的活性为100％)，结果如表2。可以看出，该酶的适宜温度为60℃，而且能耐较高温度，在75℃时保温30分钟活性仍高于30％。
表 2
温度(℃) 4 25 37 45 55 60 65 75
活性(％) 13 30 80 90 92 100 95 35
实施例6：抑制剂对酶活力的影响实验
为了研究抑制剂对酶Lmz1活力的影响，我们选择了四种抑制剂：PMSF(苯甲磺酰氟)、EDTA、SSI(枯草杆菌蛋白酶类抑制剂)、CI(胶原蛋白酶抑制剂)。将5uL的抑制剂和20uL酶Lmz1混合后与2.5mg生色蛋白质Azocoll在45℃保温30分钟，然后用蛋白核酸定量仪测量520nm处的吸光度值以定量酶活，结果如表3。可以看出，该酶基本被PMSF完全抑制了，说明该酶为丝氨酸蛋白酶。
表3
抑制剂 浓度 活性
没有抑制剂 100
EDTA 0.5M 98
PMSF 10mM 0.8
SSI 10mM 33
CI 10uM 39
Claims (3)
1.一种真菌碱性丝氨酸蛋白酶，其特征在于该真菌碱性丝氨酸蛋白酶来源于粉红粘帚霉(Gliocladium roseum GR87)，保藏号：CGMCC No.0807；酶的pH：11-12，温度为55-60℃，分子量为31,000±2000Da，等电点为10.5，蛋白酶活力能被PMSF特异性抑制。
2.一种如权利要求1所述的真菌碱性丝氨酸蛋白酶的制备方法，按常规酶制备方法制备，其特征在于液体培养基的配方为0.1％明胶、0.1％酵母浸出粉、0.9％蛋白胨、0.05％硫酸铵、0.001％FeSO4.7H2O、0.05％MgSO4.7H2O、1.129％Na2HPO1.12H2O、1.238％NaH2PO4.2H2O、蒸馏水定容至1升，pH为6.5。
3.一种如权利要求1所述的真菌碱性丝氨酸蛋白酶的应用，其特征在于该真菌碱性丝氨酸蛋白酶可作为制备防治病原线虫的生物制剂的应用。
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