KR0145485B1 - 신균주 써모엑티노마이세스 속 e79와 이로부터 생산되는 신규 단백질 가수 분해효소 - Google Patents

신균주 써모엑티노마이세스 속 e79와 이로부터 생산되는 신규 단백질 가수 분해효소

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Abstract

본 발명은 신균주 써모엑티노마이세스 속 E79와 이로부터 생산되는 신규 단백질 가수분해 효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규한 써모엑티노마이세스 속(Thermoactinomyces sp.) E79균주(KCTC 1045 BP)와 이로부터 생산되는 내열성, 내알카리성을 갖는 신규한 단백질 분해효소 및 신규 단백질 가수분해효소를 암호하는 유전자 서열과 아미노산 서열을 갖는 DNA에 관한 것이다.

Description

신균주 써모엑티노마이세스 속 E79와 이로부터 생산되는 신규 단백질 가수분해효소
제1도는 본 발명의 신균주 써모엑티노 마이세스 속(Thermoactinomyces sp.) E79의 광학현미경 사진(1,000X)이고,
제2도는 본 발명의 신균주 써모엑티노 마이세스 속(Thermoactinomyces sp.) E79의 전자현미경 사진(20,000X)이고,
제3도는 본 발명의 신규 단백질 가수분해효소의 최적 pH 및 안정성을 나타낸 그래프이고,
제4도는 본 발명의 신규 단백질 가수분해효소의 최적온도 및 안정성을 나타낸 그래프이며,
제5도는 본 발명의 신규 단백질 가수분해효소의 유전자 및 아미노산 배열을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 신균주 써모엑티노마이세스 속 (Thermoactinomyces sp.)E79와 이로부터 생산되는 신규 단백질 가수분해 효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신규한 써모엑티노마이세스 속(Thermoactinomyces sp.) E79균주와 이로부터 생산되는 내열성, 내알카리성을 갖는 신규한 단백질 분해효소 및 신규 단백질 가수분해효소를 암호하는 유전자 서열과 아미노산 서열을 갖는 DNA에 관한 것이다.
단백질 가수분해효소는 단백질내의 펩티드(peptide)결합을 분해하여 저분자의 펩티드 및 아미노산으로 만드는 효소이다.
현재 단백질 가수분해효소는 식품, 의약, 세제, 피혁가공공업 및 환경처리 등의 다양한 용도로 사용되고 있으며, 단백질 가수분해효소 시장이 전체 효소시장의 60%를 차지하고 있을 정도로 경제적 가치가 높다.
최근에는 이들 단백질 가수분해효소 중에서 알카리와 세제(오염)에 내성이 있는 효소를 이용하여 효소세제를 개발하고 있는데, 환경오염의 감소를 위해 그 중요성과 시장이 확대되고 있다.
한편, 의약성·기능성 펩티드가 의학, 식품용도로 개발되고 있고 아스파탐 등 몇가지 디-, 트리- 펩티드의 시장성이 확대됨에 따라서 단백질 가수분해효소의 효소로서 갖는 고유의 가수분해 작용에 반하는 펩티드 결합의 합성이 유기용매 상에서 가능하다는 특성을 이용하여 생촉매(biocatalayst)로 활용하고자 하는 시도가 증가하고 있다.
이와같은 단백질 가수분해효소에 관한 종래의 발명들을 살펴보면 대한민국특허공개 제93-23460, 23465, 70061, 701592, 701592, 701593, 702515, 702528, 94-574 및 575호 등에 개시되어 있다.
이중 대한민국특허공개 제93-23460호에서는 생산균주로 스트렙토마이세스 써모니트리칸스(Streptomyces Thermonitricans)를, 제94-574호에서는 바실러스 튜머루스(Bacillus Tumorus)를, 그리고 제93-701592호에서는 써모박테로이데스(Thermobacteroides)를 이용하여 신규한 단백질 가수분해효소를 탐색하고 있다.
그러나 상기의 단백질 가수분해효소는 물과 친화력이 낮은 기질을 잘 분해하지 못하는 문제가 있어 세제용으로 이용하기에 부적합하고 화학용 용매(Selvent)에 효소역가가 낮은 문제가 있어 생촉매로서도 부적합하다.
따라서, 본 발명자들은 국내토양에서 내열성, 내알카리성을 갖는 신규 단백질 가수분해효소를 생산하는 신규 미생물을 분리 동정하였는 바, 이 균주가 생산하는 단일 효소의 효소적 특성, 효소단백질의 아미노산 서열, 단백질 가수분해효소를 코드화하는 유전자 서열을 조사한 결과 종래의 단백질 가수분해효소와 비교하여 아미노산 서열, 유전자 서열에 신규성이 있고 효소적 특성에 진보성이 있어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 신규한 써모엑티노마이세스 속 (Thermoactinomyces sp.)E79균주와 이로부터 생산되는 신규한 단백질 분해효소, 이 효소를 유효성분으로 함유하는 세제조성물, 이를 암호하는 유전자 서열을 갖는 DNA 및 아미노산 서열에 관한 것을 제공하는데 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 신규한 써모엑티노마이세스 속(Thermoactinomyces sp.) E79균주(KCTC 1045 BP)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 신균주가 생산하는 단백질 가수분해효소를 암호하는 다음과 같은 염기 서열을 갖는 DNA에 관한 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 분자량이 28,000Dalton이고 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 신규한 단백질 가수분해효소를 포함한다.
이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 토양에서 분리한 신규 미생물 써모엑티노마이세스속 E79균주(KCTC 1045 BP)와 이로부터 생산되는 신규한 단백질 가수분해효소 및 이를 이용한 세제조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 신균주는 국내 공주근교 두엄시료에서 분리한 것으로서 이의 미생물학적 특징은 다음과 같다.
(1) 형태학적 특성
최적 생육배지에서 배양한 균주를 그람염색(Gram staining)을 행한 결과 그람 양성균으로 나타났고, 첨부도면 제1도와 제2도에서 나타낸 바와같이 광학 및 전자현미경으로 형태를 조사한 결과 기질균사(Substrate mycelium)가 잘 발달하였고, 기중 균사포자(Aerial mycelium spores)가 광학 현미경상에서도 잘 표시되었고, 전자현미경상에서 가지사슬(branched)과, 격벽으로(septati)된 균사(mycelium)와 크기가 1.2㎛의 포자가 잘 관찰되었다. 관찰된 포자는 80℃에서 10분간 열처리해도 활성을 가짐으로서 내열성 포자임을 알 수 있다.
이와같은 광학 및 전자현미경 사진과 포자의 내열성 결과는 써모엑티노마이세스속(Thermoactinomyces sp.)이 갖는 특징과 형태가 일치한다.
(2) 균체화학적 특징
균체를 수확하여 균체내의 G+C함량, 특징적인 아미노산(Diagonostic aminoacid), 특징적인 당의 헤마구아닌(Diagonostic sugar Hemaguinone), 지방산 종류(Fatty acid type)을 조사한 결과 다음 표1과 같이 나타났다. 표1에서 나타난 바와같이 모든 균체화학적 특징이 일치되는 균주는 써모엑티노마이세스(Thermoactinomyces)속으로 밝혀져서 분리된 균주를 써모엑티노마이세스(Thermoactinomyces)속으로 확정지었다.
(3) 분리된 미생물의 동정 및 명명
형태적, 균체화학적 특성을 분석한 결과 분리된 미생물은 써모엑티노마이세스(Thermoactinomyces)속에 속하는 미생물임을 버지스의 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.4)(Williams Wilkins co, 1989)에서 확인가능하였다. 분리된 미생물은 써모엑티노마이세스속 (Thermoactinomyces sp.)E79로 명명하고, 1995년 1월 9일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 1045 BP을 부여받았다.
이와같은 본 발명의 미생물로부터 신규 단백질 가수분해효소를 생산, 분리하는 방법과 이 효소의 특성 및 이 효소를 암호하는 유전자 및 아미노산 서열에 관한 것을 다음의 실시예 및 실험예를 통하여 설명하는 바, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 신규 단백질 가수분해효소의 생산
본 발명의 써모엑티노마이세스 속 E79균주(KCTC 1045 BP)를 효소 생산배지로 2% 가용성 전분, 1% 소이톤(soytone), 0.3% K2HPO4및 0.05% MgSO47H2O를 포함한 배지는 pH 7.2로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 동일한 배지조성으로 55℃에서 12시간동안 폴라스크에서 배양한 종배양액을 1% 접종하여 효소를 생산하였다. 발효는 50l발효조(Fermenter)에서 3l를 실생산량(working volume)으로 공기유입량 0.8vvm, 교반속도 200rpm으로 55℃에서 16시간 배양했을 때 최고의 효소량을 얻었고 이때 최고 효소생산량은 9,500unit/㎖을 얻었다.
[실시예 2] 신규 단백질 가수분해효소의 특성실험
상기 실시예 1에 따라 생산된 써모엑티노마이세스 속 E79균주(KCTC 1045 BP)의 배양액을 1,200g 에서 15분간 원심분리한 상등액을 30∼80% 범위의 암모늄설페이트(Ammonium Sulfate)로 포화시켜서 단백질을 침전시킨 후 투석막을 통해서 탈염한 조효소액을 DEAE-세파로우즈 CL-6B, CM-세파로우즈 CL 및 페닐 세파로우즈 CL-4B(이상, Pharmacia사 제품, 스웨덴)칼럼을 사용하여 단백질 가수분해효소만 순수분리하였고 이 순수 분리된 효소단백질을 이용하여 다음의 실험예를 통해서 효소적 특성을 조사하였다.
[실험예 1] 효소단백질의 분자량 및 N-말단 아미노산 서열 결정
순수 분리된 효소단백질을 SDS-PAGE전기영동법으로 분자량을 측정한 결과 28,000Dalton의 분자량을 얻었고, 또한 분리된 효소단백질을 단백질/펩타이드 서열(Applied Biosystems, USA)을 이용해서 N-말단 아미노산 서열을 결정한 결과를 다음 표2에 나타냈다.
표2에서 보는 바와같이 잘 알려진 단백질 가수분해효소와 N-말단 아미노산 서열을 비교할 결과 가장 유사한 결과를 갖는 써미타제(Thermitase)〔FEBS Lett. 236, 171(1988), Biosci, Biotechnol. Biochem. 156, 246(1992)〕와도 상당히 차이를 보이는 바, 따라서 본 발명의 써모엑티노마이세스 속 E79균주(KCTC 1045 BP)가 생산하는 단백질 가수분해효소는 신규 효소임을 알 수 있었다.
*E79 : 본 발명 단백질 가수분해효소
**Thermitase : 써모엑티노마이세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris)가 생산하는 단백질 가수분해효소
[실험예 2] 신규단백질 가수분해효소의 최적조건 및 안정성
상기 실시예 1에서 제조된 신규단백질 가수분해효소의 최적 작용조건 및 안정성을 조사한 결과는 첨부도면 제3도에 나타난 바와같이 pH12에서 활성이 가장 뛰어난 것을 알 수 있는 바, 즉 최적 pH가 12이어서 극알카리에 잘 작용하는 효소임을 알 수 있고, pH12이상에서도 안정하여 극알카리성에서 안정한 효소임이 알 수 있다. 최적 온도는 70℃, 안정성은 80℃이후 떨어지는 것으로 나타나서 본 발명의 효소가 내열성, 극알칼리성에서 활성이 뛰어날 뿐아니라 극알칼리성에 효소의 안정성이 유지되는 특성을 지닌 효소임을 알 수 있었다.
[실험예 3] 저해제, 금속이온 및 세제(detergent)의 효소활성에 미치는 영향
본 발명의 효소가 저해제에 대한 효소활성의 영향은 다음 표3에 나타난 바와같이 PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)에 대해서 효소활성이 대부분 없어지는 것으로 보아 세린 프로테아제(Serine Protease)임을 알 수 있고, 금속이온은 다음 표4에서 보는 바와같이 수은(Hg)에 강력히 저해를 받고 오히려 칼슘이온에 의해서 효소활성이 증가됨을 알 수 있다.
또한, 상기 표5에서와 같이 세제를 종류별로 1% 처리하고 효소활성을 측정한 결과 SDS에서만 약 18%의 활성이 실활되지만 다른 종류의 세제에서는 안정하게 나타났는데 이런 결과는 굉장히 우수한 결과이고 SDS의 경우도 다른 시판효소보다 월등한 결과이다.
[실시예 3] 신규단백질 가수분해효소의 클로닝 및 아미노산 서열
써모엑티노마이세스 속 E-79의 염색체 DNA를 추출하여 임의의 크기로 무작위로 자른 후 임의의 크기의 DNA를 pUC9벡타를 이용하여 단백질 가수분해효소 역가가 없는 E coli JM 83에 형질전환시키고 이중 단백질 가수분해 역가가 있는 클론을 클로닝하고, 클로닝한 유전자를 이용해서 ORF(Open Reading Frame)를 찾아 크기에 맞는 유전자 및 핵산 서열을 조사한 결과 첨부도면 제3도와 같은 결과를 얻었고, 이 결과중 성숙형의 N-말단 아미노산은 분리된 신규단백질 가수분해효소의 단백질에서 결정된 N-말단 결과(표2)와 잘 일치하여 클로닝된 유전자가 목적으로 하는 효소유전자임을 확인하였고, 기존의 데이터베이스 단백질 가수분해효소의 유전자와 비교시 신규임을 확인하였다.
[실시예 4] 신규단백질 가수분해효소의 세제용 효소로 이용
상기 실시예 1에서 생성된 효소를 이용한 효소세제를 비이온 계면활성제 30%, 산말단 계면활성제 4%, 물때방지제(Sokalan CP-5) 3%, 겔화방지제 8%, 알칸올 인산에스테르 0.3%, 표백활성제(TAED)3.5%, 재부착방지제(Relative DM 4050) 0.75%, 형광증백제(Stilbene Brightener N4) 0.25% 및 본 발명 효소 1.25%를 넣고, 본 발명 효소대신 시판용 효소(Subtilisin Carlsberg, Sigma사)를 넣은 효소세제를 제조하였다. 세탁력 시험은 카제인(Casein) 2g, 콩코레드(Congo red) 1g 및 올리브오일(Olive oil) 0.5g을 100㎖의 수도물에 넣고 소니케이트(Sonicator)를 이용하여 현탁액을 넣고 여기에 5×5㎝의 면포를 넣고 적시어 30℃에서 건조한 것을 세탁시험용 면포로 하였다. 세척력은 물 1ℓ에 제조된 세제를 0.1, 0.3, 0.5g넣고서 여기에 세탁용 면포 2자을 넣고 20분간 천천히 교반하여 추출되는 색소의 농도를 스펙트로 포토메타(Spectrophotometer)을 이용하여 400nm에서 측정한 흡광도로 세탁력을 측정하였다. 시판효소와 발명효소의 세탁력의 비교는 다음 표6에 나타난 바와같이 본 발명의 단백질 가수분해효소를 이용한 효소세제가 세척력이 훨씬 뛰어나고, 효소의 함량을 줄여서 실험한 결과도 양호한 결과를 얻어서 세제용 효소로 특성이 뛰어남을 알 수 있다.

Claims (4)

1. 신규한 써모엑티노마이세스 속(Thermoactinomyces sp.) E79(KCTC 1045 BP)균주.
분자량이 28,000 Dalton이고, 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는 신규한 단백질 가수분해효소.
제2항의 신규한 단백질 가수분해효소를 암호하는 다음과 같은 염기서열을 갖는 DNA.
제2항의 신규한 단백질 가수분해효소를 유효성분으로 함유하는 세제조성물.
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