JP2013526842A

JP2013526842A - コニディオボルス・ブレフェルディアヌス由来の酵素およびその調製方法

Info

Publication number: JP2013526842A
Application number: JP2012554443A
Authority: JP
Inventors: リアリ，セータ・ラクスマン; カンデルウォール，ハリシュ・バンシライ; モア，スネハイ・ヴィジェイ; カラル，カマラカー・モティラム; ナラシマン，チャンドラ・バブ・カナン; パラニヴェル，サラヴァナン; バララム，パドマナバン
Original assignee: カウンシル・オブ・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2011-03-11
Publication date: 2013-06-27
Also published as: EP2539431B1; US20130115671A1; WO2011104630A8; CN103391997A; CN103391997B; WO2011104630A1; EP2539431A1

Abstract

本発明は、受託番号ＭＴＣＣ−５１８５を有するコニディオボルス属の種の真菌に関する。さらに、本発明は、該コニディオボルス属の種由来のプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼの酵素混合物の調製方法に関する。そのような酵素は、革、絹および他の産業で使用されている。
【選択図】なし

Description

本発明は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌス(Conidiobolus brefeldianus)ＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼ、リパーゼおよびカルボヒドラーゼを含む酵素組成物に関する。さらに、本発明は、前記組成物の調製方法およびその使用に関する。

工業用酵素の現在の世界規模の推定売上額は１０億ドルである。工業用酵素のうちの７５％は加水分解酵素である。プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびキシラナーゼは合わせて、約８５〜９０％の総酵素売上高を構成しており、植物、動物および微生物源からのプロテアーゼがそのうちの約６０％を占めている。

細菌プロテアーゼはよく知られており、有利であるにも関わらず、プロテアーゼの真菌源は限られている。他の酵素と組み合わせたさらなるプロテアーゼの真菌源も限られている。

コニディオボルス・コロナトゥス(Conidiobolus coronatus)は、アルカリプロテアーゼの製造のための供給源として使用されることが知られており、米国特許第６７７７２１９号、第７１８６５４６号、「Optimization and scale up of production of alkaline protease from Conidiobolus coronatus（コニディオボルス・コロナトゥスからのアルカリプロテアーゼの製造の最適化および規模拡大）」、R. Seeta Laxmanら著、Process Biochemistry出版、第４０巻、第９号、３１５２〜３１５８頁、２００５年９月発行、デジタルオブジェクト識別子（ＤＯＩ）: 10.1016/j.procbio.2005.04.005、および「Thermostability of high-activity alkaline protease from Conidiobolus coronatus（コニディオボルス・コロナトゥス（ＮＣＬ８６．８．２０）由来の高活性アルカリプロテアーゼの熱安定性）」、S. H. Bhosaleら著、Enzyme and Microbial Technology出版、１７：１３６〜１３９頁、１９９５年を参照されたい。

しかし、コニディオボルス属の種の株由来のプロテアーゼ、リパーゼおよびカルボヒドラーゼを含む酵素組成物に関する先行技術は存在しない。米国特許第６７７７２１９号および第７１８６５４６号は、アルカリプロテアーゼ形態のコニディオボルス・コロナトゥスの調製方法に関する。

従って、本発明の目的は、真菌源、すなわちコニディオボルス・ブレフェルディアヌスのこれまでに知られていない株由来のプロテアーゼ、リパーゼ、プロテオグリカナーゼおよびカルボヒドラーゼから選択される少なくとも１種の酵素からなる酵素組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、本発明者によって単離された真菌培養物であるコニディオボルス・ブレフェルディアヌスを用いて、プロテアーゼ、リパーゼおよびカルボヒドラーゼから選択される少なくとも１種の酵素を含む酵素組成物の調製方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、活性であり、かつ広いｐＨ範囲および短い発酵サイクルにおいて安定なアルカリプロテアーゼの調製方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、単独またはそれらを組み合わせた、プロテアーゼ、リパーゼおよびカルボヒドラーゼの経済的な製造方法を提供することにある。本発明の目的は、National Chemical Laboratory（インドのプネー）で単離されたコニディオボルス属ブレフェルディアヌスに属する真菌培養物によって、安価な培地における、単独またはそれらを組み合わせた、プロテアーゼ、リパーゼ、プロテオグリカナーゼおよびカルボヒドラーゼの調製方法を開示することにもある。

本発明のさらに別の目的は、革、洗剤、食品、織物、絹の精練、絹／副蚕糸からのセリシンタンパク質／ペプチドの製造および回収、動物組織培養、分析ツール、医薬品、化粧品、分子生物学および産業などにおける本発明の酵素の使用方法を提供することにある。

従って、本発明は、限定されるものではないが、真菌源由来のプロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、赤血球凝集活性および糖タンパク質分解活性を有する酵素から選択される少なくとも１種の酵素を含んでなる酵素組成物を提供し、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスのこれまでに知られていないＭＴＣＣ−５１８５株が本明細書に開示されている。該酵素組成物の調製方法およびその使用も開示されている。本発明の酵素組成物は、単独またはそれらを組み合わせた本明細書に開示されている酵素を含む。

本発明のプロテアーゼは、限定されるものではないが、単独またはそれらを組み合わせた、アルカリプロテアーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、ケラチナーゼおよびペプチダーゼから選択される。

本発明のカルボヒドラーゼは、限定されるものではないが、グリコシダーゼ、特にグリカナーゼ、より詳細には、単独またはそれらを組み合わせた、キチナーゼ、ラミナリナーゼ、コンドロイチナーゼから選択される。

本発明のリパーゼは、エステラーゼを含む。
一態様では、本発明は、活性で、広いｐＨ範囲にわたって安定であり、化学物質や温度変化に対して安定であり、かつ本明細書に開示されているような貯蔵寿命を有するアルカリプロテアーゼを含む酵素組成物に関する。本発明の組成物は、限定されるものではないが、革、化粧品、織物、食品、洗剤、医薬品および他の産業での用途を有する洗剤、有機溶媒、変性剤および同様の化合物から選択される化学物質に対して安定である。

本発明のもう一つの態様では、該酵素組成物は、バイオマスの形態である。
本発明の別の態様では、該酵素組成物は、粗製型の酵素を含む。
本発明の別の態様では、該酵素組成物は、精製型（purified form）の酵素を含む。

本発明の別の態様では、該酵素組成物は、純化型（refined form）の酵素を含む。
本発明のさらに別の態様では、該酵素組成物は、遊離型の酵素を含む。
本発明のさらに別の態様では、該酵素組成物は、遊離型と固定化型とを組み合わせた酵素を含む。

本発明のさらに別の態様では、該酵素組成物は、固定化型の酵素を含む。
本発明のさらに別の態様では、該酵素組成物は、細胞結合型の酵素を含む。
本発明の別の態様では、該酵素組成物は、細胞内型の酵素を含む。

さらに別の態様では、本発明は、炭素、窒素および使用される誘導物質に応じて、コニディオボルス・ブレフェルディアヌス由来のプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼからなる群から単独または同時に選択される１種以上の酵素の調製のための発酵プロセスであって、
ａ．好気条件下、５．０〜１０．０の範囲のｐＨおよび１５℃〜３７℃の範囲の温度ならびに２〜５日間の期間で、炭素および窒素源ならびに誘導物質を含む培地でコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５真菌株を培養すること、
ｂ．培地を回収すること、および
ｃ．従来の方法によって液相中で酵素を分離／抽出すること、
を含む方法をさらに提供する。

本方法の一態様では、該微生物を、１８０〜２２０ｒｐｍで振盪しながら液内培養で培養する。
別の態様では、該微生物を、静置条件下で半固体の培養液中で培養する。

該炭素源は、限定されるものではないが、単独またはそれらを組み合わせた、糖類、糖アルコール類、多糖類、農産物、農業副産物／廃棄物などを含む。糖類は、グルコース、フルクトース、アラビノース、スクロースおよびラクトースなどであり、糖アルコール類は、グリセリン、マンニトールおよびソルビトールなどであり、多糖類は澱粉などであり、油脂は、オリーブ油、ヒマワリ油、大豆油、胡麻油、カラシ油、ヒマシ油、ヤシ油、落花生油およびトリブチリンなどであり、農産物／廃棄物は、大豆粉、大豆ミール、落花生粕、カラシ種子粕、綿実粕、小麦ふすまおよび米糠などと、カニ殻などのキチン含有廃棄物である。

該窒素源は、単独またはそれらを組み合わせた、任意に有機または無機窒素源である。該無機窒素源は、限定されるものではないが、リン酸水素二アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムおよび尿素から選択される。

該有機窒素源は、限定されるものではないが、単独またはそれらを組み合わせた、ペプトン、トリプトン、ソイトース(soyatose)、大豆ペプトン、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、牛肉エキス、酵母エキス、魚粉、羽毛粉、羽毛、コーンスティープリカーならびに大豆粉、大豆ミール、ベサン粉、緑豆粉、カラシ種子粕、綿実粕、落花生粕、小麦ふすまおよび米糠などによって例示される窒素豊富なマメ科の基質、酪農、家禽、肉および食品加工からの廃棄物、毛髪、羽毛などのケラチン豊富な廃棄物、漁場からの廃棄物ならびに他の廃棄物から選択される。

従来の酵素分離方法は、濾過、遠心分離または水もしくは希釈した界面活性剤による抽出である。本発明の一態様では、該酵素は、音波処理および機械的粉砕による細胞破砕の工程を含めることによって分離された細胞内型である。

炭素および窒素源／誘導物質は、限定されるものではないが、単独またはそれらを組み合わせた、乳製品に似た乳清、食品加工、魚粉および鶏の羽毛および羽毛粉などによって例示される肉および魚からのタンパク質／窒素含有廃棄物、または油種子粕として例示される農業廃棄物、ならびに、廃棄穀類／穀粒などの炭水化物廃棄物、油、脂肪、製革所廃棄物に似た裏打ち、トリミングおよびクロム削りのくず、爪、蹄、毛髪などのケラチン豊富な基質から選択される。

本発明の一態様では、該有機窒素源は、プロテアーゼのための誘導物質である。
本発明の特徴では、該酵素の濃度を、膜濾過によって、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムなどの塩の添加、エタノール、アセトンなどの有機溶媒の添加による塩析によって、あるいは凍結乾燥または噴霧乾燥によって達成した。

本発明の特徴では、該凍結乾燥したプロテアーゼは、４〜４０℃の範囲の温度で安定である。
本発明の特徴では、該噴霧乾燥したプロテアーゼは、４〜４０℃の範囲の温度で安定である（７６０日間）。

本発明のプロテアーゼは、３〜１２のｐＨ範囲、好ましくはｐＨ７で安定であり、洗剤、水混和性および水不混和性有機溶媒の存在下で安定であり、５０℃まで安定である。該プロテアーゼは、６〜１１のｐＨ範囲、３０〜６０℃の温度範囲およびキレート剤、金属イオンの存在下で活性である。

本発明の一態様では、粗製プロテアーゼおよび部分精製プロテアーゼは、カゼイン、アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン、エラスチン−オルシン、アゾカゼイン、アゾコール（Ａｚｏｃｏｌｌ）、Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）およびゼラチンに対して活性を示す。

本発明の別の態様では、該プロテアーゼは、セリンプロテアーゼであり、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）によって阻害された。
本発明の一態様では、リパーゼは、４〜９のｐＨ範囲、好ましくはｐＨ７、および２０〜６０℃の温度範囲、好ましくは５０℃で活性である。

本発明の別の態様では、該酵素組成物は、本物のコラーゲンに対して不活性である。
本発明の別の態様では、該プロテアーゼは、絹の精練に有用であり、精練廃液からセリシンタンパク質／ペプチドを回収する。

本発明の酵素組成物は、食品、美容、医薬品、革、織物産業、およびラセミ混合物からの光学異性体の分割に使用されている。プロテアーゼは、農業、革、織物、絹の精練、酪農、食品、飼料、洗剤、医薬品産業、動物組織培養、廃棄写真フィルムおよびナノ粒子合成からの銀の除去、肥料、ならびに、植物、動物、ペプチド合成からの培地成分およびタンパク質加水分解産物の調製、分子生物学、化粧品、アミノ酸のラセミ混合物の分離および廃棄物処理などに適用されている。ケラチナーゼは、革、洗剤、および狂牛病におけるプリオンの分解などに適用されている。リパーゼは、農業、革、織物、酪農、食品、飼料、洗剤、医薬品産業、肥料、化粧品、廃棄物処理および高分子化合物の合成などに適用されている。キチナーゼは農業に適用されている。コンドロイチナーゼは、脊髄損傷に適用されている。

コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５の顕微鏡画像：（ａ）原形質内容物を示す真菌の菌糸体、（ｂ）油滴を有する厚い壁のある接合胞子。１８ＳリボソームＤＮＡ配列の複数の配列アラインメントに基づく相同性を示す樹状図。新規なＭＴＣＣ−５１８５真菌株の１８ＳリボソームＤＮＡ配列は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスとの最大の相同性を示す。コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５によるリパーゼの産生を示すプレートアッセイ。５日間の増殖後のトリブチリン寒天プレート上の真菌コロニーの周りの隙間領域は真菌によるリパーゼ分泌を示す。コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５によるキチナーゼの産生を示すプレートアッセイ。培養濾液が添加されたウェルの周りの酸で膨張したキチンプレート上の隙間領域は、真菌によるキチナーゼの分泌を示す。コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５によるコンドロイチナーゼの産生を示すプレートアッセイ。４日間の増殖後のコンドロイチン硫酸Ａプレート上のコロニーの周りの透明な領域は、真菌によるコンドロイチナーゼの分泌を示す。約２９．９ｋＤａの分子量に対応する単一のピークを示すコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来の精製プロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。２７．８ｋＤａの分子量を有する主要なピークを示す部分精製プロテアーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。噴霧乾燥したプロテアーゼの貯蔵寿命。噴霧乾燥したプロテアーゼは、最大４０℃の温度で２年を超えて安定である。コニディオボルス・ブレフェルディアヌスによる廃棄Ｘ線フィルムからの銀含有ゼラチン層の除去：ａ−粗製プロテアーゼ、ｂ−バイオマス濾液およびｃ−バイオマス。フィルムからのゼラチン除去および溶液中への銀の同時放出により黒みがかった溶液。１時間後、銀およびゼラチンの完全な除去によりフィルムは綺麗になっている。プロテアーゼによる精練の前後の絹繊維の目視観察。絹繊維の光沢は、プロテアーゼによる精練後に認めらる。プロテアーゼによる精練の前後の絹繊維の走査型電子顕微鏡写真。絹繊維は、精練後のセリシン除去により滑らかである。コニディオボルス・ブレフェルディアヌス５１８５プロテアーゼによる酵素精練後の廃液中のセリシン回収。精練のために使用したプロテアーゼ濃度の増加によって増加した精練液中のセリシンの不溶性残留物。コニディオボルス・ブレフェルディアヌス５１８５のプロテアーゼによる酵素精練後の廃棄精練液体から回収されたセリシンペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。血液のシミの除去を示す図。市販の洗剤ではシミしか落ちないが、粗製プロテアーゼでは、凝血塊と共に血液のシミを除去することができた：ａ−水、ｂ−洗剤、ｃ−プロテアーゼ、ｄ−プロテアーゼ＋洗剤。

限定されるものではないが、真菌源、すなわち、これまでに知られていないコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株由来のプロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、赤血球凝集活性および糖タンパク質分解活性を有する酵素から選択される少なくとも１種の酵素を含む酵素組成物が本明細書に開示されている。酵素組成物の調製方法およびその使用も開示されている。本発明の酵素組成物は、単独またはそれらを組み合わせた本明細書に開示されている酵素を含む。

コニディオボルス・ブレフェルディアヌス真菌株を植物有機堆積物から単離し、これに受託番号ＭＴＣＣ−５１８５を付した（微生物株保存機関(Microbial Type Culture Collection)、インドのチャンディーガル（Chandigarh））。コニディオボルス・ブレフェルディアヌスの供給源は、土壌、昆虫、落葉および木の小枝などである。図１は、原形質の内容物と、油滴を有する厚い壁のある接合胞子による、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５真菌の菌糸体の顕微鏡画像を示す。図２は、他の微生物との１８ＳリボソームＤＮＡ遺伝子の配列相同性を示す。１８ＳリボソームＤＮＡ配列相同性によれば、本発明の単離株は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＡＦ３６８５０６．１株に対して９９％の相同性を示し、異なるコニディオボルス・コロナトゥス株に対して９８％の相同性を示す。ＭＴＣＣ−５１８５、すなわち新規なコニディオボルス・ブレフェルディアヌス株の１８ＳリボソームＤＮＡ遺伝子配列は、受託番号ＦＪ８９５３０４でＮＣＢＩ遺伝子バンクに寄託した。

本発明のリパーゼはエステラーゼを含む。
本明細書に記載されている方法によって酵素活性の測定を行った。反応混合物は、２ｍｌの総体積で、一定分量の好適に希釈した酵素溶液と、１０ｍｇのハマーステインカゼインの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）とを含んでいた。５０℃で１０分間のインキュベーション後に、３ｍｌの５％トリクロロ酢酸（濃塩酸で酸性にした）を添加して、反応を終了させた。形成された沈殿物を室温で３０分間放置した後、ワットマンＮｏ．１濾紙で濾過した。トリクロロ酢酸の可溶性画分の吸光度を２８０ｎｍで測定した。産生したチロシンのマイクログラムは、チロシン濃度に対して予め較正した２８０ｎｍでの吸光度のグラフから計算し、その単位を、アッセイ条件下で１分ごとに放出されるチロシンのμモルとして表す。

１％ラミナリンの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いてラミナリナーゼ（β−１，３グルカナーゼ）活性を測定した。１ｍｌの総反応混合物は、０．５ｍｌの好適に希釈した酵素と０．５ｍｌの基質とを含み、これを５０℃で３０分間インキュベートした。放出された還元糖を、ジニトロサリチル酸法（Ｐ．Ｂｅｒｎｆｅｌｄ著、１９５５年、Amylase: α & β, Methods in Enzymology（アミラーゼ：αおよびβ、酵素学での方法）、第１巻、１４９頁）で測定した。ラミナリナーゼ活性を、アッセイ条件下で１分ごとに産生された還元糖（グルコース同等物として）のμモルとして表した。

２つの異なる方法でリパーゼ活性を測定した。
ａ．基質として酪酸ｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰＢ）を用いた分光学的アッセイ：３０ｍｇのｐＮＰＢを、１０ｍｌの２−プロパノールおよび０．１ｍｌのトリトン−Ｘ−１００に溶解し、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で体積を１００ｍｌにした。アッセイ混合物は、０．９ｍｌの基質と０．１ｍｌの好適に希釈した酵素とを含んでいた。アッセイ混合物を５０℃で３０分間インキュベートし、２ｍｌの２−プロパノールを添加して、反応を終了させた。放出されたｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍで測定した。リパーゼ活性を、アッセイ条件下で３０分ごとに放出されるｐ−ニトロフェノールのμモルとして表す。
ｂ．リパーゼの滴定アッセイ：２０ｍｌのオリーブ油、１６５ｍｌの１０％アラビアゴムおよび１５ｇの氷を粉砕混合機で１０分間混合することによって基質を調製し、ガラスウールで濾過し、４℃で保存した。リパーゼアッセイのために、反応混合物は、２ｍｌのリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）、５ｍｌの基質および１ｍｌの粗製培養液を含み、これを、５０ｒｐｍで振盪させながら、５０℃で１時間インキュベートした。４ｍｌのアセトン：エタノール（１：１）の添加によって反応を終了させた。ブランクでは、アセトン：エタノールによる反応の終了後に酵素を添加した。放出された遊離脂肪酸を１０ｍＭのＮａＯＨで滴定した。リパーゼ活性を、アッセイ条件下で１分ごとに放出される遊離脂肪酸のμモルとして表す。

０．７％キチンを用いてキチナーゼ活性を測定した。反応混合物は、基質として１ｍｌの酵素、１ｍｌの５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５）および１ｍｌの０．７％キチンを含んでいた。反応混合物を５０℃で１時間インキュベートした。ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いて分光測定により５８５ｎｍで吸光度を測定することによって、放出されたＮ−アセチルグルコサミンを推定した。１単位の活性を、アッセイ条件下で１分ごとに１μモルのＮ−アセチルグルコサミンを放出するのに必要な酵素の量として定める。

分光光度測定法によってコンドロイチナーゼ活性を３７℃で測定した。適切に希釈した酵素（０．８ｍｌ）を３７℃で１０分間平衡させた後、２５０ｍＭのトリスＨＣｌおよび３００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）で調製し、０．２ｍｌの０．５％コンドロイチン硫酸Ａの０．０５％ウシ血清アルブミン溶液を添加し、すぐに混合した。反応混合物を３７℃で最長２１分間インキュベートした。０．１ｍｌの一定分量を３分間隔で取り出し、ｐＨ８に調整した０．９ｍｌの５０ｍＭのＫＣｌを含む管に移し、インキュベーションを３７℃でさらに１０分間続けた。１０分後、内容物を遠心分離し、吸光度を２３２ｎｍで測定した。０分時点の吸光度をアッセイのブランクとして用いた。活性を、以下に示すように時間に対する吸光度のグラフの直線部分の勾配（吸光度の増加／分）から計算した。１単位を、アッセイ条件下で、１分ごとに１マイクロモルの２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−４−エン−ピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトースをコンドロイチン硫酸Ａから放出させるのに必要な酵素の量として定める。

式中、５．１は、コンドロイチン硫酸Ａのための不飽和二糖のミリモル吸光係数である。
伝統的に、ケラチナーゼは、羽毛粉、肥料および接着剤などの製造のために使用されている。それらの適用範囲は徐々に拡大しており、現在では、洗剤、製剤、化粧品、革、薬および動物の飼料などの他の領域に益々使用されている。より最近では、ケラチナーゼは、狂牛病の治療（プリオンの分解）、生分解性プラスチックおよび羽毛粉の製造に適用されている。軽度のエラスチン分解活性を有するがコラーゲン分解性を欠いているケラチナーゼの適用は、革の製造での脱毛過程について調査されている。皮および生皮は、相当量の有益なＧＡＧ（生重量で０．２〜０．３％）を含有する。リパーゼ、ケラチナーゼ、コンドロイチナーゼおよびキチナーゼを含む酵素組成物は、脱毛に有用であろう。

本発明の酵素組成物は、食品、化粧品、医薬品、革、織物産業、およびラセミ混合物からの光学異性体の分割で使用されている。プロテアーゼは、農業、革、織物、絹の精練、酪農、食品、飼料、洗剤、医薬品産業、動物組織培養、廃棄写真フィルムおよびナノ粒子合成からの銀の除去、肥料、ならびに、植物、動物、ペプチド合成からの培地成分およびタンパク質加水分解産物の調製、分子生物学、化粧品、アミノ酸のラセミ混合物の分離および廃棄物処理などに適用されている。ケラチナーゼは、革、洗剤、および狂牛病でのプリオンの分解に適用されている。リパーゼは、農業、革、織物、酪農、食品、飼料、洗剤、医薬品産業、肥料、化粧品、廃棄物処理および高分子化合物の合成などに適用されている。キチナーゼは農業に適用されている。コンドロイチナーゼは脊髄損傷に適用されている。

以下、本発明について、実施例を用いて本明細書に説明するが、それらは単に例示であり、どのようないかなる方法であっても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

実施例１
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５の単離および形態学的特性によるその同定を例示する。真菌培養物を、インドマハラシュトラ州プネーから回収した植物有機堆積物を分解することによって単離した。植物有機堆積物の微粒子を、ペトリ皿の蓋の内面に付着させたＭＧＹＰ寒天（麦芽エキス−０．３％、酵母エキス−０．３％、ペプトン−０．５％、グルコース−１％、寒天−２％）ブロックに重ね合わせ、プレートを２８℃でインキュベートした。強制的に放出された分生子から発生する単一の単離コロニーを取り出し、ＭＧＹＰ寒天斜面に移し、２８℃で２〜３日間インキュベートした。微生物は急速に増殖し、基部に乳頭状突起を有する強制的に放出された大きな球形の分生子の形態に基づいてコニディオボルス属に属する株として同定した。菌糸体は無隔であるが、後期には有隔となる。分生子柄は短系であるが、菌糸体とは区別がつかない。分生子柄の先端では、強制的に放出される大きな球形の分生子が形成される。分生子の大きさは、３５〜４５ミクロンの間で様々である。分生子は発芽して、菌糸体を生じるか、または放射状小柄上に小分生子を生じるか、あるいは二次分生子に遷移する。放出された分生子は、増殖する培養物の上方にあるガラス上の白みがかった／クリーム色がかった堆積物として目視可能である。微生物は接合胞子であり、接合胞子（休眠胞子）は、２つの異なった壁層と内部に粒状内容物を含む丸くて滑らかな厚い壁を有する（図１）。
実施例２Ａ
本実施例は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法によって、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５のゲノムＤＮＡの単離を例示する。ＤＮＡの単離のために、その組成が麦芽エキス−３、酵母エキス−３、ペプトン−５およびグルコース−１０（ｇ／Ｌ）である麦芽エキスグルコース酵母エキスペプトン（ＭＧＹＰ：Malt extract Glucose Yeast extract Peptone）培地を含む液体フラスコで真菌を増殖させた。７日齢のＭＧＹＰ斜面からの胞子を接種することによって増殖を開始した。フラスコを、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で４８時間インキュベートした。内容物を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、繰り返し洗浄して培地成分を除去した。３〜５ｇの湿った菌糸体を液体窒素中で粉砕した後、そこに、０．２％β−メルカプトエタノールを含有する８〜１０ｍｌのＣＴＡＢ抽出緩衝液（ｐＨ８）を添加し、その後、２０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、６５℃で１時間インキュベートした。この後に、２０μｌのリボヌクレアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、６５℃で１５分間さらにインキュベートした。遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）後に回収した上澄みに、１０ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加した。混合物を５分間振盪し、１０，０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。２倍量のＣＴＡＢ沈殿緩衝液を上澄みに添加し、室温で１時間維持した。遠心分離後に回収したペレットを、５ｍｌの１．２ＭのＮａＣｌに溶解し、５ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加した。２倍量の無水アルコールを水相に添加してＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを巻き取って取り出し、７０％エタノールで洗浄し、５ｍｌの０．１ＭトリスＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、保存した。分光光度計を用いて２６０ｎｍで試料の吸光度を測定することによってＤＮＡの定量化を行い、０．８％アガロースゲル電気泳動で純度を確認した。
実施例２Ｂ
本実施例は、１８ＳリボソームＤＮＡ遺伝子のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を例示する。真菌種の同定のために使用したプライマーは、真菌の汎用な１８ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）プライマーＮＳ１−Ｆ(GTA GTC ATA TGC TTG TCT C)、ＮＳ８−Ｒ(TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA)であった。ポリメラーゼ連鎖反応物（２５μｌ）を準備して、ゲノムＤＮＡを用いて１８ＳｒＤＮＡ遺伝子を増幅した。反応混合物は典型的に、ゲノムＤＮＡを０．７０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を２．５０μｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰを２．５μｌ、前方及び後方プライマーをそれぞれ１０〜２０ピコモル〜１．２５μｌ、蒸留水を１６．６０μｌおよび１単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ−を０．２μｌ含んでいた。１８ＳｒＤＮＡ遺伝子の増幅のためのＰＣＲ条件は、９５℃で３分間の最初の変性、次いで、９４℃で１分間、５７℃で３０秒間、７２℃で２分間を３５サイクル、および７２℃で１０分間の最終的な伸長であった。５μｌの上記ＰＣＲ増幅産物を使用して、１．０％アガロースゲルで増幅を確認した。
実施例２Ｃ
本実施例は、ＰＣＲ増幅産物の精製を例示する。２０μｌのＰＣＲ増幅産物に、１２μｌの２０％ＰＥＧ−ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール−ＮａＣｌ）溶液を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、それを、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄みを捨て、ペレットを、７０％エタノールで二回洗浄し、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって分離した。ペレットを乾燥し、１０μｌの再蒸留水に溶解し、−２０℃で保存した。
実施例２Ｄ
本実施例は、精製したＰＣＲ産物の配列決定を例示する。製造業者の手順に従って、「ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit」（Perkin Elmer Applied Biosystems Division社、カリフォルニア州フォスター市）を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、配列決定反応を行った。本キットは、BigDye Terminatorと呼ばれる異なる蛍光標識を有する４種類のｄｄＮＴＰを含む。２μｌのＰＣＲ産物および３ピコモルの配列決定プライマーを、２０μｌの配列決定反応物に使用した。配列決定プライマーは、配列決定用のＮＳ１(GTA GTC ATA TGC TTG TCT C)、ＮＳ２(GGC TGC TGG CAC CAG ACT TGC)、ＮＳ３(GCA AGT CTG GTG CCA GCA GCC)、ＮＳ４(CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG)、ＮＳ５(AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G)、ＮＳ６(GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC)、ＮＳ７(GAG GCA ATA ACA GGT CTG TGA TGC)およびＮＳ８(TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA)（Ｗｈｉｔｅら、１９９０年）であった。配列決定反応混合物を、Perkin Elmer社製サーマルサイクラー９７００の２５サイクルに供した。各サイクルは、９５℃で１０分間、５０℃で５分間および６０℃で４分間から構成されていた。ＡＢＩ１５００自動配列決定装置でＤＮＡ塩基配列決定を行った。
実施例２Ｅ
本実施例は、上記実施例で得られた１８ＳｒＤＮＡ配列に基づく、コニディオボルス属の種の新規なＭＴＣＣ−５１８５株の同定および系統的関係を例示する。得られた配列は小さな断片であったため、配列を重なることによって適切に位置合わせした。１８ＳｒＤＮＡの得られた配列を用いたコニディオボルス属の種の新規な株の相同性の割合および系統的関係をＮＣＢＩデータベースで確認した。ヌクレオチド配列は、基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）プログラム(www.ncbi.ncm.gov/blast)を用いて、ジェンバンクデータベースを用いて分析した。表１の結果は、ＮＣＢＩデータベースにおける１８ＳｒＤＮＡ配列の最初の１０件のＢＬＡＳＴヒットを示す。１８ＳｒＤＮＡは、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスの１つの株ＡＦ３６８５０６．１との最大（９９％）の配列相同性を示した。ＭＴＣＣ−５１８５、すなわちコニディオボルス・ブレフェルディアヌスの新規な株の１８ＳｒＤＮＡ配列は、、受託番号ＦＪ８９５３０４でＮＣＢＩ遺伝子バンクに寄託した。図２は、他の微生物との１８ＳｒＤＮＡの配列相同性を示す。コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株がコニディオボルス・コロナトゥス菌株群には該当しないことが分かる。

実施例３
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。発酵は、グルコース−２０、酵母エキス−３、大豆ミール−３０（１リットル当たりのグラム数）を含有する培地を含む振盪フラスコで行った。その組成がグルコース−１０、酵母エキス−３（１リットル当たりのグラム数）である種培養物の調製のために、３日齢のＭＧＹＰ斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。振盪フラスコ実験は、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で７２時間行った。プロテアーゼ活性を、Ｌａｘｍａｎら（２００５年）、Process Biochemistry（プロセス生化学）、第４０巻、３１５２〜３１５８頁（２００５年）に従って推定した。活性の１つの単位を、１分ごとに１マイクロモルのＴｙｒを放出するのに必要な酵素の量として定める。３日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼ活性は、３６〜３８ＩＵ／ｍｌであった。
実施例４
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。グルコース−２０、リン酸水素二アンモニウム−１．６、大豆ミール−３０（１リットル当たりのグラム数）を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。その組成がグルコース−１０、酵母エキス−３、ペプトン−５（１リットル当たりのグラム数）である種培養物の調製のために、３日齢のＭＧＹＰ斜面からの胞子を使用した。これを回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。振盪フラスコ実験は、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で７２時間行った。３日後の細胞非含有培養液中の活性は、３４〜４０ＩＵ／ｍｌであった。
実施例５
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いて、装備付き発酵槽における撹拌および通気制御条件下での深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。５Ｌの作業体積を有する７．５ＬのNew Bruinswick発酵槽で発酵を行った。３日齢のＭＧＹＰプレート／斜面からの胞子を使用して、その組成が酵母エキス−３、ペプトン−５およびグルコース−１０（ＧＹＥＰ）（１リットル当たりのグラム数）である２５０ｍｌの培地を含む１Ｌのフラスコで接種菌を増殖させ、２８℃および２２０ｒｐｍで２４時間インキュベートした。発酵槽に、５００ｍｌ（１０％ｖ／ｖ）の２４時間植物接種菌を接種した。７．５Ｌ発酵槽内の産生培地（４．５Ｌ）は、基礎培地として２％商用グレードグルコース、０．３％酵母エキスを含んでいた。３％の濃度の大豆ミールを誘導物質として使用した。通気および撹拌機の速度をそれぞれ、３〜４ｒｐｍおよび３５０〜４００ｒｐｍに維持し、温度を２６〜２８℃に維持した。２〜３日後の細胞非含有培養液中の活性は、３６〜４０ＩＵ／ｍｌであった。
実施例６
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた、装備付き発酵槽における撹拌および通気制御条件下での深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。５０Ｌの作業体積を有する７５Ｌの発酵槽で発酵を行った。産生のために、以下の発酵パラメータに従った：ストックとしての３日齢のＭＧＹＰ斜面、その組成が酵母エキス−３、ペプトン−５およびグルコース−１０（ＧＹＥＰ）（１リットル当たりのグラム数）である培地で増殖させた１５時間齢の事前接種菌、その組成が酵母エキス−３およびグルコース−１０（ＧＹＥ）（１リットル当たりのグラム数）である培地で増殖させた１５時間齢の接種菌、２％の市販のグルコース、０．１６％の肥料グレードリン酸水素二アンモニウム（ＤＡＰ）および３％の大豆ミール（ＳＢＭ）を含有する産生培地。最初に、泡止め剤と共にＳＢＭを１２１℃で３０分間滅菌した。冷却後、グルコースおよびＤＡＰを添加し、２０分間再滅菌し、接種まで正圧を維持した。発酵の間中、温度を２８〜３０℃に維持した。撹拌は、最初に８０ｒｐｍに維持し、発酵終了時の最大１２０ｒｐｍまで徐々に上昇させた。通気は、最初に０．８ｖｖｍに維持し、３６時間後の１．２〜１．４ｖｖｍまで上昇させた。２〜３日後の細胞非含有培養液中の活性は、３６〜４０ＩＵ／ｍｌであった。
実施例７
本実施例は、プレートアッセイを用いてコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５によって分泌されたリパーゼ活性の検出を例示する。酵素のためのプレートアッセイを、グルコース−１．５、酵母エキス−１．５、ペプトン−５、牛肉エキス−５、寒天−２０および１％乳化トリブチリン（１リットル当たりのグラム数）からなる２５ｍｌのＭｉｋａｍｉ培地を含む使い捨てのペトリ皿で行った。その組成が酵母エキス−３およびグルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるＧＹＥ接種菌を調製するために、２日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。２４時間の増殖後、１白金耳量の増殖物をプレートにスポット接種し、２８℃で７２時間インキュベートした。トリブチリンの分解による増殖中の真菌コロニーの周りの隙間領域が観察され、これは微生物によるリパーゼの分泌を示していた（図３）。
実施例８
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株によるプレートアッセイを用いたキチナーゼ活性の検出を例示する。プレートアッセイを、０．０１％の酸で膨張したキチンを含有する２５ｍｌの２％寒天を含む使い捨てのペトリ皿で行った。３日齢の斜面からの胞子を、その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０および酸で膨張したキチン−０．１（１リットル当たりのグラム数）である産生培地に接種し、１８０〜２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃でインキュベートした。試料を２４、４８および７２時間後に取り出し、５０μｌの細胞非含有上澄みをプレート上に作られたウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。キチナーゼ活性の検出のために、プレートを０．１％ラニパル（ｒａｎｉｐａｌ）に１５分間浸した後、蒸留水で二回それぞれ３０分間洗浄した。プレートを紫外線の下で観察した。試料スポットの周りの薄青色の透明領域は、キチン分解により観察され、これは真菌株によるキチナーゼの分泌を示していた（図４）。無菌水が添加された場所（ウェル１）に隙間領域は存在しなかったが、隙間領域は発酵時間と共に増加し、最大の隙間が７２時間後の試料（ウェル４）で観察された。
実施例９
本実施例は、プレートアッセイを用いてコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５によって分泌されたコンドロイチナーゼの活性の検出を例示する。酵素のためのプレートアッセイを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびコンドロイチン硫酸Ａを添加したＭＧＹＰ寒天培地を含む使い捨てのペトリ皿で行った。麦芽エキス−０．１５ｇ、酵母エキス−０．１５ｇ、ペプトン−０．２５ｇ、グルコース−０．５ｇを、４０ｍｌの蒸留水に溶解し、１ｇの寒天を添加し、加圧滅菌した。ＢＳＡ（５００ｍｇ）およびコンドロイチン硫酸Ａ（２０ｍｇ）を、１０ｍｌの蒸留水に溶解し、濾過滅菌し、培地に添加し、無菌のペトリ皿に入れた。２日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用して、その組成が酵母エキス−３およびグルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるＧＹＥ培地に接種した。２４時間の増殖後、１０％（ｖ／ｖ）の栄養増殖物をグルコース−２０、リン酸水素二アンモニウム−１．６、大豆ミール−３０（１リットル当たりのグラム数）を含む培地に移し、２８℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。４８時間後、１白金耳量の増殖物をプレートにスポット接種し、２８℃でインキュベートした。４日後、プレートを２Ｎ酢酸に浸し、室温で１５分間放置した。ＢＳＡに結合した未分解のコンドロイチン硫酸Ａは不透明な外観を与えるが、コロニーの周りに隙間領域が認められ、これは、コンドロイチン硫酸Ａを加水分解させるコンドロイチナーゼの分泌を示していた（図５）。
実施例１０
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるリパーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、２日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン−５、牛肉エキス−５、酵母エキス−１．５、グルコース−１．５（１リットル当たりのグラム数）を含有するＭｉｋａｍｉ培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。２％濃度のオリーブ油を、リパーゼ産生のための誘導物質として使用した。培地をｐＨ７に調整した。基質として酪酸ｐ−ニトロフェニルを用いて、分光光度法で、３日後の細胞非含有培養液中のリパーゼ活性を測定し、活性は、０．５〜０．６ＩＵ／ｍｌの範囲であった。
実施例１１
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるリパーゼの産生に対する様々な油脂の誘導作用を例示する。その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、２日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン−５、牛肉エキス−５、酵母エキス−１．５、グルコース−１．５（１リットル当たりのグラム数）を含有するＭｉｋａｍｉ培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。リパーゼ産生のための誘導物質として、２％濃度の以下の油：大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油およびトリブチリンを使用した。培地をｐＨ７に調整した。４日後の細胞非含有培養液中のリパーゼ活性を滴定法で測定した。大豆、オリーブおよびヒマワリ油中のリパーゼ活性は、０．４１〜０．４３Ｕ／ｍｌの範囲であったが、トリブチリンでは０．６３ｕ／ｍｌのより高い活性が得られた。
実施例１２
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびリパーゼの調製を例示する。その組成が麦芽エキス−３、ペプトン−５、グルコース−１０、酵母エキス−３（１リットル当たりのグラム数）である発酵培地に接種するために、２日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。培地をｐＨ７に調整した。プロテアーゼおよびリパーゼ産生のための誘導物質として、大豆ミール（２％）および大豆油（１％）をそれぞれ使用した。３日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼおよびリパーゼ活性をそれぞれ、カゼイン分解法および滴定法によって測定した。プロテアーゼおよびリパーゼ活性はそれぞれ、１２〜１５ＩＵ／ｍｌおよび１〜１．２ＩＵ／ｍｌの範囲であった。
実施例１３
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるキチナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、３日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン−５、牛肉エキス−５、酵母エキス−１．５、グルコース−１．５（１リットル当たりのグラム数）を含有するＭｉｋａｍｉ培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。キチナーゼ産生のための誘導物質として１％濃度のキチンを使用した。培地をｐＨ７に調整した。２日および３日後の細胞非含有培養液中のキチナーゼ活性はそれぞれ、０．０１１ＩＵ／ｍｌおよび０．０１６ＩＵ／ｍｌであった。
実施例１４
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびキチナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、３日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース−２０、キチン−０．１、リン酸水素二アンモニウム−１．６（１リットル当たりのグラム数）を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地をｐＨ７に調整し、大豆ミールを、３％濃度の誘導物質として添加した。２日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼおよびキチナーゼ活性はそれぞれ、２５〜２９ＩＵ／ｍｌおよび０．０１４〜０．０１６ＩＵ／ｍｌであった。
実施例１５
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびラミナリナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、３日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース−２０、リン酸水素二アンモニウム−１．６（１リットル当たりのグラム数）を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地をｐＨ７に調整し、大豆ミールを、３％濃度の誘導物質として添加した。２日後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼおよびラミナリナーゼ活性はそれぞれ、２６〜２８ＩＵ／ｍｌおよび０．９５〜１．２１ＩＵ／ｍｌであった。
実施例１６
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびケラチナーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるグルコース酵母エキス種培養物を調製するために、２日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。ペプトン−５、牛肉エキス−５、酵母エキス−１．５、グルコース−１．５（１リットル当たりのグラム数）を含有するＭｉｋａｍｉ培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地をｐＨ７に調整し、ケラチナーゼのための誘導物質として鶏羽毛（１％）を各フラスコに別々に添加した。振盪フラスコを、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で４８時間インキュベートした。Ｂｒｅｓｓｏｌｌｉｅｒら（Applied Environmental Microbiology（応用環境微生物学）、第６５巻（６）、２５７０〜２５７６頁、１９９９年）に従って、ケラチナーゼ活性を測定した。酵素活性の１つの単位を、１分ごとに５９５ｎｍで０．０１だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。２４時間および４８時間後の細胞非含有培養液中のプロテアーゼ活性はそれぞれ、３．３４ＩＵ／ｍｌおよび７．９０ＩＵ／ｍｌであった。２４時間および４８時間のケラチナーゼ活性はそれぞれ、１５０．０２および２５２．４５Ｕ／ｍｌであった。
実施例１７
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼおよびコンドロイチナーゼの調製を例示する。実施例２８に記載されているようなＡｍｉｃｏｎ濃縮酵素試料はそれぞれ、２２２．１２Ｕ／ｍｌおよび０．１〜０．１６Ｕ／ｍｌのプロテアーゼおよびコンドロイチナーゼ活性を示した。
実施例１８
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵による各種炭素源を用いたプロテアーゼの調製を例示する。その組成がグルコース−１０、酵母エキス−３（１リットル当たりのグラム数）である種培養物の調製のために、２日齢のＭＧＹＰ斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。炭素源−１０、酵母エキス−３、大豆ミール−３０（１リットル当たりのグラム数）を含む培地に入れた振盪フラスコで発酵を行った。炭素源として、１％濃度のフルクトース、グルコース、グリセリン、ラクトース、マンニトールおよび澱粉を使用した。振盪フラスコを、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で７２時間インキュベートした。４８時間の試料の活性を本明細書の一部をなす添付の表２に示す。グルコースが最良の炭素源であることが分かった。

実施例１９
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。その組成がグルコース−１０、酵母エキス−３（１リットル当たりのグラム数）である種培養物の調製のために、３日齢のＭＧＹＰ斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース−１０、酵母エキス−３、誘導物質−２０（１リットル当たりのグラム数）を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。以下の誘導物質：大豆ミール、綿実粕、カラシ種子粕、落花生粕、ベサン粉、緑豆粉、ソイトース、脱脂粉乳、トリプトン、カゼインおよびカザミノ酸を使用した。振盪フラスコを、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で７２時間インキュベートした。４８時間の試料の活性を本明細書の一部をなす添付の表３に示す。試験した全ての誘導物質がプロテアーゼ産生を誘導した。

実施例２０
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵による、誘導物質として異なる濃度の大豆ミールを用いたプロテアーゼの調製を例示する。その組成がグルコース−１０、酵母エキス−３（１リットル当たりのグラム数）である種培養物の調製のために、２日齢のＭＧＹＰ斜面からの胞子を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース−１０、酵母エキス−３、大豆ミール−０、１０、２０、３０、４０、５０（１リットル当たりのグラム数）を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。振盪フラスコを、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で７２時間インキュベートした。４８時間の試料の活性を本明細書の一部をなす添付の表４に示す。

実施例２１
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた深部発酵による、２０〜４５℃の温度範囲でのプロテアーゼ産生を例示する。その組成が麦芽エキス−３、酵母エキス−３、ペプトン−５およびグルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるＭＧＹＰ種培養物を調製するために、３日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。麦芽エキス−３、酵母エキス−３、ペプトン−５およびグルコース−１０、大豆ミール−２０（１リットル当たりのグラム数）を含有するＭＧＹＰ液体培地を含む振盪フラスコで産生を行い、ｐＨを６．５〜７に調整した。フラスコを回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２０〜４５℃の温度範囲で４８時間インキュベートした。プロテアーゼ産生は２０〜３７℃の温度範囲で観察され、２８℃で最も高い活性が認められた（表５）。

実施例２２
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５株を用いた、５〜１０のｐＨ範囲での深部発酵によるプロテアーゼの調製を例示する。その組成が酵母エキス−３、グルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるＧＹＥ種培養物を調製するために、３日齢の斜面からの胞子懸濁液を使用した。これを、回転振盪機で２８℃で２４時間インキュベートし、振盪フラスコ実験を開始するために使用した。グルコース−２０、酵母エキス−３、大豆ミール−２０（１リットル当たりのグラム数）を含有する培地を含む振盪フラスコで発酵を行った。培地のｐＨは、無菌のＮａＯＨまたはＨＣｌの添加により、ｐＨ５〜１０の範囲で様々であった。振盪フラスコを、回転振盪機（２００ｒｐｍ）で２８℃で４８時間インキュベートした。プロテアーゼ産生は、５〜１０のｐＨ範囲で観察された（表６）。

実施例２３
本実施例は、前記株によって分泌されたプロテアーゼが活性となるｐＨ範囲を例示する。プロテアーゼにとって最適なｐＨの決定のために、酵素を希釈し、５〜１２の範囲の異なるｐＨの緩衝液でアッセイした。０．１Ｍの濃度の以下の緩衝液を使用した：酢酸塩（ｐＨ５）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６、７）、トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）および炭酸−重炭酸塩（ｐＨ９および１０）、リン酸ナトリウム−ＮａＯＨ（ｐＨ１１、１２）およびＫＣｌ−ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０）。その結果を本明細書の一部をなす添付の表７に示す。酵素はｐＨ６〜１１で活性となることが観察された。

実施例２４
本実施例は、前記株によって分泌されたプロテアーゼが活性となる温度範囲を例示する。最適な温度の決定のために、３０〜７０℃の範囲の温度の炭酸−重炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９）を用いてプロテアーゼ活性を測定した。実験の結果を、本明細書の一部をなす添付の表８に示した。酵素が３０〜６０℃で活性となることが観察される。

実施例２５
粗製プロテアーゼのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を４０℃で最長２時間インキュベートすることによって、時間に対する４０℃での前記プロテアーゼの安定性を測定した。実施例４に記載されているように粗製プロテアーゼを産生した。一定分量を１５分の一定の間隔で取り出し、残存活性を５０℃およびｐＨ９で推定した。その結果を表９に示し、ここでは、プロテアーゼが４０℃で最長２時間安定であり、約６０％の活性を保持した。

実施例２６
本実施例は、凍結乾燥によるプロテアーゼの濃縮を例示する。実施例４に記載されているように産生し、かつ３６．３３Ｕ／ｍｌの活性を有するプロテアーゼ（１００ｍｌ）を、液体が完全に蒸発して、乾燥した吸湿性の粉末が得られるまで６時間凍結乾燥した（−５５℃）。凍結乾燥した粉末を脱イオン水に溶解し、プロテアーゼ活性を推定した。凍結乾燥した試料は、１９１．８８Ｕ／ｍｌの活性を示した。プロテアーゼの回収は９５％を超えることが分かった。これは、プロテアーゼが凍結乾燥に対して安定であることを示している。
実施例２７
本実施例は、限外濾過によるプロテアーゼの濃縮を例示する。実施例４に記載されているように産生したプロテアーゼを、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。２５．８４ＩＵ／ｍｌの活性を有する透明な上澄み（１２００ｍｌ）を、Ａｍｉｃｏｎ膜濾過装置で、３，０００ダルトンの分画分子量を有するＹＭ−３膜で濃縮した。濃縮後の体積は１５０ｍｌであり、２０６．７２ＩＵ／ｍｌのプロテアーゼ活性を有していた。濾過後の回収率は９５〜９８％であった。また、別の組では、１０００ｍｌの上澄みを、８５％の回収率で、ＰＭ−１０膜（１０，０００ダルトンの分画分子量）で１００ｍｌまで濃縮した。
実施例２８
本実施例は、９０％の飽和を有する硫酸アンモニウム沈殿によるプロテアーゼの濃縮を例示する。実施例６に記載されているように産生したプロテアーゼを１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。濃縮のために、３１．２９ＩＵ／ｍｌの活性を有する透明な上澄み（１０００ｍｌ）を使用した。ゆっくりと連続混合しながら６００ｇの硫酸アンモニウムを添加することによって、沈殿を４℃で行った。完全な沈殿のために撹拌をさらに２時間続け、放冷して沈殿させた。透明な上澄みを別の容器に移し、懸濁液の体積を２５０ｍｌまで減らし、４倍の濃度のプロテアーゼを得た。１０，０００ｒｐｍで遠心分離した後に得られた沈殿物を１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）に溶解した後に、懸濁液中のプロテアーゼ活性を推定した。９０％を超えるプロテアーゼが回収され、懸濁液中の活性は１１８．１２ＩＵ／ｍｌであった。
実施例２９
本実施例は、洗剤の存在下でのコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼの安定性を例示する。実施例４に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、０．７ｍｇ／ｍｌの洗剤（最終濃度）と共に４０℃で最長１時間インキュベートした。試料を１５分間隔で取り出し、残存活性を測定し、各洗剤による初期活性を１００％とした場合の割合として表す。プロテアーゼは、全ての洗剤の存在下で安定であり、洗剤に応じて１５分後に７５〜９４％の活性を保持した（表１０）。１時間後であっても、約３５〜５０％の活性が保持された。

実施例３０
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５によって分泌されるプロテアーゼが各種金属の存在下で活性であることを例示する。実施例４に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを使用した。プロテアーゼ活性を金属の存在下で推定した。金属（１００ｍＭ）の原液を調製し、５ｍＭの最終濃度でアッセイ混合物に添加した。実験の結果を、本明細書の一部をなす添付の表１１に示した。プロテアーゼは、Ｃａ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｋ、ＭｇおよびＭｎの存在下で活性であったが、ＮｉおよびＺｎにより、３５〜４０％の阻害が生じた。ＣｕおよびＨｇは、プロテアーゼ活性を完全に阻害した。

実施例３１
本実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが１時間安定となる温度範囲を例示する。温度安定性を決定するために、実施例２７に記載されているような限外濾過した粗製プロテアーゼを、４〜７０℃の範囲の温度で１時間インキュベートし、残存活性を５０℃およびｐＨ９で測定した。その結果を表１２に示し、ここでは、酵素が５０℃まで安定であることが観察される。

実施例３２
本実施例は、５０℃でのプロテアーゼの安定性を例示する。５０℃で最長２時間プロテアーゼをインキュベートすることによって、時間に対する５０℃での前記プロテアーゼの３種類の異なる試料の安定性を決定した。実施例４、２７および２８に記載されているような粗製培養濾液、硫酸アンモニウム沈殿物および限外濾過した（膜）プロテアーゼ試料を、安定性の調査のために使用した。一定分量を３０分の一定間隔で取り出し、残存活性を５０℃およびｐＨ９で推定した。その結果を表１３に示し、ここでは、全てのプロテアーゼ試料の活性が、３０分後に５０℃で６０％を超えて保持された。培養濾液およびＰＭ−１０保持液が２時間後に約２５〜２７％の活性を保持したのに対して、２時間後に約４０％の活性を保持した硫酸アンモニウム沈殿試料は、より安定であることが分かった。

実施例３３
本実施例は、糖アルコールの存在下でのプロテアーゼの安定性を例示する。実施例２７に記載されているような限外濾過したプロテアーゼを、２０％濃度のグリセリン、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールの存在下で５０℃で最長３時間インキュベートした。一定分量を３０分の一定間隔で取り出し、残存活性を５０℃およびｐＨ９で推定した。その結果を表１４に示す。全ての糖アルコールにより酵素の安定性は増加し、３０％を超える活性が３時間後に保持された。その中で、ソルビトールは、４７％の残存活性により、プロテアーゼにより大きな耐熱性を与えた。

実施例３４
本実施例は、ソルビトールおよびトレハロースの存在下でのプロテアーゼの安定性を例示する。実施例２７に記載されているような限外濾過したプロテアーゼを、２０、４０および５０％のソルビトールおよびトレハロースの存在下５０℃で最長４時間インキュベートした。一定分量を６０分の一定間隔で取り出し、残存活性を５０℃およびｐＨ９で推定した。その結果を表１５に示す。トレハロースおよびソルビトールの濃度の増加と共に安定性は増加した。添加剤を含まない対照が１２．６７％の残存活性を示したのに対して４時間後であっても約８０％の活性を保持した５０％のソルビトールおよびトレハロースにより、耐熱性がほぼ５〜６倍増加した。

実施例３５
本実施例は、塩の存在下でのプロテアーゼの安定性を例示する。実施例２７に記載されているような限外濾過したプロテアーゼを、１０ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍのグリシンおよび１５％の硫酸アンモニウムの存在下５０℃で最長３時間インキュベートした。一定分量を３０分の一定間隔で取り出し、残存活性を５０℃およびｐＨ９で推定した。その結果を表１６に示す。全ての塩の存在下で安定性が増加した。塩化カルシウムおよび硫酸アンモニウムは、熱変性に対するより大きな保護を提供し、ここでは、対照が約２０％の残存活性を示したのに対して、３時間後の残存活性は約５５％であった。

実施例３６
本実施例は、２８℃での粗製プロテアーゼの安定性に対する水混和性および水不混和性有機溶媒の効果を例示する。以下の有機溶媒：アセトン、アセトニトリル、１−ブタノール、ジメチルスルホキシド、２−プロパノールおよびメタノールを使用した。実施例４に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、２０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（有効濃度）と共に２８℃でインキュベートした。試料を異なる時間間隔で取り出し、残存活性を推定した。有機溶媒を含まない試料は対照として機能した。各溶媒による最初の活性を１００％とした（表１７）。全ての他の溶媒において９５％を超える活性が最長５時間保持されたのに対して７５．２６％の残存活性を示したブタノールを除いて、プロテアーゼは有機溶媒の存在下で安定であった。２８℃で１２時間のインキュベーション後に、ブタノールを除いて、プロテアーゼは５０％を超える活性を保持したのに対して、ブタノールでの残存活性は約４０％であった（表１７）。

実施例３７
本実施例は、３７℃での粗製プロテアーゼの安定性に対する水混和性および水不混和性有機溶媒の効果を例示する。以下の有機溶媒：アセトン、アセトニトリル、１−ブタノール、ジメチルスルホキシド、２−プロパノールおよびメタノールを使用した。実施例４に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、２０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（有効濃度）と共に３７℃およびｐＨ７でインキュベートした。試料を異なる時間間隔で取り出し、残存活性を推定した。有機溶媒を含まない試料は対照として機能した。各溶媒による最初の活性を１００％とした（表１８）。２時間後に５０％を超える活性がアセトン、メタノールおよびジメチルスルホキシドで保持されたのに対して３５％未満の残存活性を示したアセトニトリル、ブタノールおよび２−プロパノールを除いて、プロテアーゼは有機溶媒の存在下で安定であった（表１８）。

実施例３８
本実施例は、ＮＭＩＴＬＩ−１およびコラゲナーゼ−１基質を用いた蛍光調査による、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼの非コラゲナーゼ性を例示する。最初に、ＮＭＩＴＬＩ−１基質に対して粗製プロテアーゼおよび精製プロテアーゼを用いて蛍光実験を行った。トリエタノールアミン緩衝液（ＴＥＡ）中で、室温およびｐＨ８で蛍光実験を行った。典型的には、アッセイは、１．８μΜのＮＭＩＴＬＩ−１基質濃度（１０μｌの１１２μΜ原液）を有する２９０μｌの１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ８）を含んでいた。５μｌの酵素試料を添加することによって反応を開始した。励起波長は３４０ｎｍであり、異なる時間間隔で４２５〜６２５ｎｍの蛍光を走査した。ＡＥＤＡＮＳ発色団（＋＋＋）の蛍光が３倍増加し、これは、酵素試料のタンパク分解性を示していた。
ＮＭＩＴＬＩ基質−１

粗製プロテアーゼおよび精製プロテアーゼ試料がＮＭＩＴＬＩ−１基質に対する活性を示したため、それらを、コラゲナーゼ基質−Ｉによるコラゲナーゼ活性についてもスクリーニングした。トリエタノールアミン緩衝液（ＴＥＡ）中で、室温およびｐＨ８で蛍光実験を行った。典型的には、アッセイは、１．６μΜの基質（コラゲナーゼ基質−Ｉ）濃度（５μｌの８０ｍＭ原液）を有する、２９０μｌの１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ８）を含んでいた。５μｌの酵素試料を添加することによって反応を開始した。励起波長は３４０ｎｍであり、異なる時間間隔で４２５〜６２５ｎｍの蛍光を走査した。ＡＥＤＡＮＳ発色団（−）の蛍光の増加は認められず、これは、コラゲナーゼ活性が存在しないことを示している。
コラゲナーゼ基質−Ｉ

これらの結果は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来の粗製プロテアーゼおよび精製プロテアーゼがコラゲナーゼ基質−Ｉに対して不活性であったことを示し、これは、プロテアーゼの非コラゲナーゼ性を示している。
実施例３９
本実施例は、エラスチン−オルシンに対するコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼの活性の測定を例示する。反応混合物は、３ｍｌの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼ酵素と、２０ｍｇのエラスチン−オルシンの５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）とを含んでいた。熱不活化酵素（１５分間の沸騰による）をブランクとした。５０℃で３０分間のインキュベーション後に、内容物をワットマンＮｏ．１濾紙で濾過し、濾液の吸光度を５７８ｎｍで測定した。酵素活性の１つの単位を、１分ごとに５７８ｎｍで１単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。１１８．１２ＩＵ／ｍｌのカゼイン分解活性を有する実施例２８に記載されているような硫酸アンモニウム沈殿懸濁液は、エラスチン−オルシンに対して３．８４Ｕ／ｍｌの活性を示した。
実施例４０
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼのアゾコール活性の測定を例示する。反応混合物は、２．５ｍｌの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼと、１０ｍｇのアゾコールの０．０５ＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）とを含んでいた。熱不活化酵素（１５分間の沸騰による）をブランクとした。３７℃で１０分間のインキュベーション後に、ワットマンＮｏ．１濾紙で濾過することによって反応を終了させた。濾液の吸光度を５８０ｎｍで測定した。酵素活性の１つの単位を、１分ごとに５８０ｎｍで１単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。実施例３に記載されているように増殖させた粗製培養濾液は、１６〜１８Ｕ／ｍｌのアゾコール活性を有していた。
実施例４１
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼのアゾカゼイン活性の測定を例示する。反応混合物は、５００μｌの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼと、１ｍｇのアゾカゼインの０．０５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）とを含んでいた。熱不活化酵素（１５分間の沸騰による）をブランクとした。５０℃で３０分間のインキュベーション後に、５００μｌの１０％ＴＣＡの添加によって反応を終了させた。氷上での１５分間の冷却後に、内容物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。８００μｌの上澄みに、２００μｌの１．８ＭのＮａＯＨを添加し、吸光度を４２０ｎｍで測定した。酵素活性の１つの単位を、１分ごとに４２０ｎｍで１単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。実施例３に記載されているように増殖させた粗製培養濾液は、４０〜４５Ｕ／ｍｌの活性を示した。
実施例４２
本実施例は、Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）に対するコニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来の粗製プロテアーゼの活性を例示する。０．１６ｍｌの３ｍＭのＮ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）のＤＭＳＯ溶液、０．５ｍｌの５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）および０．１ｍｌの適切に希釈した酵素試料からなるアッセイ混合物を、３７℃で１時間インキュベートした。０．５ｍｌの１ＭのＮａ_２ＣＯ_３の添加によって反応を終了させた。吸光度を４２０ｎｍで測定した。活性の１つの単位を、１分ごとに４１０ｎｍで１単位だけ吸光度を増加させるのに必要な酵素の量として定める。２０．７Ｕ／ｍｌのカゼイン分解活性を有する実施例３に記載されているような粗製酵素は、１．４１Ｕ／ｍｌの活性を示した。
実施例４３
本実施例は、基質としてカゼイン、ヘモグロビンおよびウシ血清アルブミンを用いた、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼ活性の測定を例示する。実施例３に記載されているように増殖させた粗製培養濾液を、ＰＭ−１０膜で限外濾過によって濃縮し、調査のために使用した。反応混合物は、２ｍｌの総体積で、一定分量の好適に希釈したプロテアーゼ酵素と、１０ｍｇの基質の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）とを含んでいた。５０℃で１０分間のインキュベーション後に、３ｍｌの５％トリクロロ酢酸（濃塩酸で酸性にした）の添加によって反応を終了させた。形成された沈殿物を、３０分間室温で放置した後に、ワットマンＮｏ．１濾紙で濾過した。トリクロロ酢酸可溶性画分の吸光度を２８０ｎｍで測定した。プロテアーゼは、様々な程度まで上記基質を分解することができる（表１９）。

実施例４４
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５のプロテアーゼ活性に対する阻害剤の効果を例示する。以下の阻害剤：フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヨード酢酸およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）について調査した。実施例３に記載されているように増殖させた粗製培養濾液を、実施例２７に記載されているようにＰＭ−１０およびＹＭ−３膜で限外濾過によって濃縮し、阻害調査のために使用した。両プロテアーゼ調製物を、各阻害剤を含む１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で１時間プレインキュベートし、残存活性を５０℃およびｐＨ９．０で測定した。阻害剤を含まないプロテアーゼは対照として機能した。プロテアーゼは、１ｍＭのＰＭＳＦによって完全に阻害され、これは、セリンプロテアーゼであることを示していた（表２０）。

実施例４５
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５のプロテアーゼ活性に対する阻害剤の効果を例示する。以下の阻害剤：Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、Ｎ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）およびベンズアミジンについて調査した。粗製プロテアーゼを、各阻害剤の１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）と共に３０分間プレインキュベートし、残存活性を５０℃およびｐＨ９．０で測定した。阻害剤を含まないプロテアーゼは対照として機能した。ＴＰＣＫおよびＴＬＣＫによる阻害はそれぞれ９％および２９％であったが、ベンズアミジンは阻害せず、これは、プロテアーゼがトリプシン様活性を有しないことを示していた（表２１）。

実施例４６
本実施例は、前記株によって分泌されたリパーゼが活性となるｐＨ範囲を例示する。リパーゼにとって最適なｐＨの決定のために、滴定法によって、５０℃および４〜９の範囲のｐＨで酵素をアッセイした。以下の緩衝液：酢酸塩（ｐＨ４および５）、リン酸塩（ｐＨ６、７）、トリスＨＣｌ（ｐＨ８）および炭酸−重炭酸塩（ｐＨ９）を使用した。その結果を本明細書の一部をなす添付の表２２に示す。酵素はｐＨ４〜９で活性となることが観察された。

実施例４７
本実施例は、前記株によって分泌されたリパーゼが活性となる温度範囲を例示する。最適な温度の決定のために、リパーゼ活性を、ｐＨ７および３０〜６０℃の範囲の温度で滴定法によって測定した。

実験の結果を、本明細書の一部をなす添付の表２３に示す。酵素が３０〜６０℃で活性となることが観察される。

実施例４８
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５プロテアーゼの均一精製を例示する。実施例４に記載されているように真菌を増殖させ、１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後に得られた透明な上澄みを酵素源として使用した。培養液の硫酸アンモニウム分別沈殿を４℃で行い、透析した硫酸アンモニウム沈殿物（５０〜８０％飽和）を、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡したジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥセルロース）カラム（２．５ｃｍ×２５ｃｍ）に充填した。非吸着酵素を、２０ｍｌ／時間の流速で、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させた。プロテアーゼ活性を示す画分を貯留し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）で濃縮し、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）で平衡したセファデックスＧ−１００カラム（１．２ｃｍ×１５０ｃｍ）に充填した。カラム充填物を、１２ｍｌ／時間の流速で、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出させた。プロテアーゼ活性を示す画分を貯留し、−２０℃で保存した。
実施例４９
本実施例は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）による精製プロテアーゼの純度および分子量の決定を例示する。M/s BioRad社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用分子質量標識キット（ＣａｔＮｏ．１６１−０３０５）は、炭酸脱水酵素（３５．８８ｋＤａ）、大豆トリプシン阻害剤（２７．８６ｋＤａ）、リゾチーム（１８．８１ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（８７．５５ｋＤａ）、ホスホリラーゼｂ（１０１．４７ｋＤａ）および卵白アルブミン（５２．７４ｋＤａ）で構成されていた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる酵素の分子質量は、炭酸脱水酵素の分子量よりも僅かに低い約２９ｋＤａであることが分かった（図６）。

また、精製プロテアーゼの分子質量を、３７ｎｍ窒素レーザーを備えたVoyager DE-STR(Applied Biosystems社)を用い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて測定した。精製酵素を、等体積のシナピン酸のアセトニトリル溶液と混合し、２０μｌの調製済試料を分析用ＭＡＬＤＩプレート上に配置した。精製酵素は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでは２７．８ｋＤａの分子量を示し（図７）、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られた２９ｋＤａの分子量とほぼ同じであった。
実施例５０
実施例６に記載されているように産生した粗製プロテアーゼを、７０〜８０％の回収率で、１５０〜１６０℃の入口温度ならびに６０〜６５℃および７０〜８０℃出口温度により、添加剤として１０％および１５％マルトデキストリンを用いて噴霧乾燥した。噴霧乾燥したプロテアーゼの安定性を、４℃〜３７℃の範囲の温度で調査した。試料を小瓶に分配し、４℃、２８℃および３７℃で保存した。各温度でインキュベートした１つの小瓶を定期的に取り出し、残存活性を確認した。噴霧乾燥したプロテアーゼは、試験した全ての温度で、最長２５ヶ月（７６０日）間安定であり、８５〜９０％の活性を保持していた（図８ａおよび図８ｂ）。
実施例５１
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５の粗製プロテアーゼ、バイオマス濾液およびバイオマスを用いた廃棄Ｘ線フィルムからの銀の除去を例示する。１ｃｍ×１ｃｍに切断した５ｇの黒いＸ線フィルムを蒸留水で洗浄した。これらの断片を、２５０ｍｌの円錐形のフラスコ中で、５０ｍｌの総体積で２０ｕのプロテアーゼの１０ｍＭ炭酸−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）と共に３７℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。プロテアーゼを含まない対照も同一条件下でインキュベートした。フィルムからのゼラチン層の剥離が数分以内に始まり、１時間以内に完了した。黒みがかった銀により溶液は黒みがかっているように見え、フィルムは綺麗であり、白色であった（図９ａ）。バイオマス濾液を用いた除去のために、微生物を、その組成が麦芽エキス−３、酵母エキス−３、ペプトン−５およびグルコース−１０（１リットル当たりのグラム数）であるＭＧＹＰ液体培地で、２００ｒｐｍおよび２８℃で振盪しながら２４時間増殖させた。４グラムのバイオマス（含水重量）を、１０，０００ｒｐｍの遠心分離で回収し、５０ｍｌの再蒸留水で二回洗浄し、５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、２８℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。２時間後、ワットマンＮｏ．１濾紙で濾過によって濾液を回収した。２グラムの洗浄したＸ線フィルム（２ｃｍ×２ｃｍの断片に切断した）を、５０ｍｌのバイオマス濾液と共に、３７℃および２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。バイオマス濾液を含まない対照を同一条件下でインキュベートした。フィルムからのゼラチン層の剥離が数分以内に始まり、１時間以内に完了した。黒みがかった銀により溶液は黒みがかっているように見え、フィルムは綺麗であり、白色であった（図９ｂ）。バイオマスを用いた除去のために、上記のようなＭＧＹＰ液体培地で、２８℃および２００ｒｐｍで２４時間好気的に真菌を増殖させた。バイオマスを遠心分離で回収し、再蒸留水で二回洗浄した。湿ったバイオマス（０．１ｇ）を、洗浄したＸ線フィルム（３ｃｍ×２ｃｍ）にペーストとして塗布し、３７℃でインキュベートした。１時間後に、ゼラチン層の完全な除去および綺麗なフィルムの外観が観察された（図９ｃ）。
実施例５２
本実施例は、絹の精練のための、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼの使用を例示する。絹の撚糸をオーブンに入れて１１０℃で３時間（または一定の重量に到達するまで）乾燥した。１ｇの乾燥した絹を、実施例３に記載されているように５０℃で１時間断続的に手動で振盪しながら調製した粗製プロテアーゼと共にインキュベートした。精練のために、４種類の異なるプロテアーゼ濃度（５０〜２００ｕ／ｇの絹）を使用した。固体：液体の比を１：３０に維持した。精練後に、絹繊維を、最初に水道水（冷たい洗浄液）、次いで、熱い洗浄液（６５℃で２０分間）で洗った。洗浄後、絹を一晩空気乾燥した後、オーブン（１１０〜１２０℃）に入れて２〜３時間（または一定の重量に到達するまで）乾燥し、精練した絹の重量を記録した。最初の重量と最終的な重量との差から、精練後の重量の減少を計算した。精練後の重量の減少は、酵素濃度の増加に伴って増加し、１３〜２２％の範囲であった（表２４）。従来どおりに精練した繊維の重量の減少は約２４．４％であった。得られた繊維は、滑らかな感触および光沢を有していた（図１０ａおよび図１０ｂ）。走査型電子顕微鏡写真は、繊維の強度特性に影響を与えないセレシンの除去を示した（図１１ａおよび図１１ｂ）。精練液中の不溶性残留物（セリシン除去による）は、プロテアーゼ濃度の増加に伴って増加した（図１２）。

実施例５３
本実施例は、絹の精練および精練液からのセリシンタンパク質／ペプチドの分離のための、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来のプロテアーゼの使用を例示する。４ｇの絹の撚糸をオーブンに入れて１１０℃で３時間（または一定の重量に到達するまで）乾燥し、実施例３に記載されているように５０℃で１時間断続的に手動で振盪しながら調製した８００Ｕのプロテアーゼと共にインキュベートした。固体：液体の比を１：３０に維持した。精練後に、絹繊維を、最初に水道水（冷たい洗浄液）、次いで、熱い洗浄液（６５℃で２０分間）で洗った。洗浄後、絹を一晩空気乾燥した後、オーブン（１１０〜１２０℃）に入れて２〜３時間（または一定の重量に到達するまで）乾燥し、精練した絹の重量を記録した。精練後の重量の減少は約２０％であった。精練液（ＤＧＬ）からの不溶性セリシン（白みがかった残留物）を、６０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって分離した。この不溶性残留物を再蒸留水に懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。従来の方法（１２１℃で６０分間の加圧滅菌）によって得られたセリシンを比較のために含めた。従来の方法によって得られたセリシンではゲル上に筋模様が存在するのに対して、酵素精練の場合には銀染色後に３種類のタンパク質バンドが可視化され、これは、その完全な分解を示していた（図１３）。
実施例５４
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来の粗製プロテアーゼを用いたペースト法によるヤギ皮の脱毛プロセスを例示する。実施例６に記載されているように産生したプロテアーゼを、硫酸アンモニウム沈殿（９０％飽和）に供し、脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵ヤギ皮を取り出し、６時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。水漬け重量に基づいて０．５〜１．５％のプロテアーゼおよび１０％の水からなるペーストを皮の肉面に塗布し、６時間積み重ねた。１０％の石灰、３％の硫化物および１５％の水からなるペーストを用いて、対応する化学物質系対照プロセスも行った。対照の皮も６時間積み重ねた。次いで、対照および実験用の皮を脱毛した。実験用の皮の脱毛有効性は、８５〜１００％の範囲であり、これは、化学物質系脱毛プロセスでの脱毛有効性に類似していることが分かった。その毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物系の脱毛によって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、ＣＯＤおよび硫化物の有意な減少が認められることを示している。実験的プロセスの廃液流のＢＯＤ／ＣＯＤ比が０．７２であることが分かり、これは、上記廃水の分解性および処理可能性が、ＢＯＤ／ＣＯＤ比が０．４であった化学プロセス系の廃水と比べて非常に良好であることを示している。
実施例５５
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来の粗製プロテアーゼを用いた牛皮の脱毛プロセスを例示する。実施例６に記載されているように産生したプロテアーゼを、硫酸アンモニウム沈殿（９０％飽和）に供し、脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵牛皮を洗浄して、８時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。この皮を、１５％の水および３〜４％の酵素を用いてドラムで処理した。１５０％の水、１０％の石灰および３％の硫化ナトリウムを用いて、対応する化学物質系対照プロセスも行った。実験的プロセスの場合には、１時間ごとに１０分間断続的にドラムを稼働させた。６時間の稼動後、毛皮を洗浄した。脱毛は１００％であった。対照の場合、１時間ごとに５分間断続的に１日中ドラムを稼働させた。翌日、毛皮を脱毛した。脱毛有効性は１００％であった。実験用の毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物による脱毛プロセスによって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、実験の場合には、０．６９のＢＯＤ／ＣＯＤ比によりＣＯＤおよび硫化物の有意な減少を示し、これは、廃水の分解性および処理可能性が高まったことを示している。
実施例５６
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来の粗製プロテアーゼを用いたペースト法による羊皮の脱毛プロセスを例示する。実施例６に記載されているようにプロテアーゼを産生した。これを硫酸アンモニウム沈殿（９０％飽和）に供し、羊皮の脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵羊皮を洗浄し、５時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。水漬け重量に基づいて０．５〜１．５％のプロテアーゼおよび１０％〜１５％の水からなるペーストを調製し、皮の肉面に塗布した。この皮を６時間積み重ねた。１０％の石灰、３％の硫化物および１５％の水からなるペーストを用いて、化学物質に基づく対照プロセスも行った。対照の皮も６時間積み重ねた。次いで、対照および実験用の皮を脱毛した。実験用の皮の脱毛有効性は、８５〜１００％の範囲であり、これは、化学物質系脱毛プロセスでの脱毛有効性に類似していることが分かった。その毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物系の脱毛によって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、ＣＯＤおよび硫化物の有意な減少が認められることを示している。実験の廃液流のＢＯＤ／ＣＯＤ比は０．７０であることが分かった。これは、実験からの廃水の分解性および処理可能性が高まったことを示している。
実施例５７
本実施例は、コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５由来の粗製プロテアーゼを用いた水牛皮の脱毛プロセスを例示する。実施例６Ｂに記載されているように産生したプロテアーゼを、硫酸アンモニウム沈殿（９０％飽和）に供し、脱毛調査のために使用した。湿った塩蔵水牛皮を取り出し、洗浄し、８時間水漬けした。水漬け後、皮の重量は顕著となった。この皮を、１５％の水および３〜４％の酵素を用いてドラムで処理した。１５０％の水、１０％の石灰および３％の硫化ナトリウムを用いて、対応する化学物質系対照プロセスも行った。実験の場合、１時間ごとに１０分間断続的にドラムを稼働させた。６時間の稼動後、毛皮を洗浄した。脱毛は１００％であった。対照の場合、１時間ごとに５分間断続的に１日中ドラムを稼働させた。翌日、毛皮を脱毛した。脱毛有効性は１００％であった。実験用の毛皮は綺麗であり、垢を含んでいなかった。脱毛した毛皮をなめし、クラストレザーにさらに加工し、クラストレザーの品質も評価した。引張強さ、引裂強さおよび粒子破裂強さに関する革の品質は、石灰および硫化物による脱毛プロセスによって得られたものに匹敵していた。対照および実験的プロセスの両方の廃液流を分析することによって、汚濁負荷量の減少も評価した。その結果は、実験の場合には、０．７４のＢＯＤ／ＣＯＤ比によりＣＯＤおよび硫化物の有意な減少を示し、それは、廃水の分解性および処理可能性が高まったことを示している。
実施例５８
本実施例は、洗剤処方へのプロテアーゼの適用について記載する。１枚の白色の布を血液に浸し、空気乾燥した。血液のシミがついた布をそれぞれ０．５ｇの４つの等しい断片に切断し、４つの異なるペトリ皿に入れた２％のホルムアルデヒドに２分間浸し、水で洗い流して、過剰なホルムアルデヒドを除去した。これらの断片を３０ｍｌの反応混合物に浸し、異なる条件下で２８〜３０℃で３０分間インキュベートした：（ａ）対照（水のみ）、（ｂ）洗剤のみ、（ｃ）粗製プロテアーゼのみ（１０Ｕ）、および（ｄ）洗剤＋粗製プロテアーゼ（１０Ｕ）。布の断片を水道水で４回洗い流した。洗剤およびプロテアーゼを一緒に使用した場合に、洗浄能力は最高であった。洗剤のみでは凝血塊は除去されなかったが、プロテアーゼ単独で、凝血塊と共に血液のシミを除去することができた（図１４）。

本発明の主要な利点は以下のとおりである：
１．当該真菌株は、新規な単離株である。
２．本発明に記載されている真菌株は、単独またはキチナーゼ、リパーゼ、コンドロイチナーゼおよびケラチナーゼと共に、プロテアーゼを産生することができる。
３．これらの酵素混合物は、革、織物、洗剤および食品産業などの多くの産業上の用途を有する。
４．プロテアーゼは、皮革工業における事前なめし作業でのその用途について既に評価されている。
５．粗製プロテアーゼは、石灰および硫化物などのあらゆる添加化学物質を必要とすることなく動物の皮／生皮を脱毛することができる。
６．粗製プロテアーゼ調製物は、幅広い基質特異性を有し、革および洗剤産業での用途で必要とされるように、アルブミン、ヘモグロビン、ゼラチン、ケラチンなどの様々なタンパク質を分解することができる。
７．粗製プロテアーゼは、絹の精練に使用することができる。
８．セリシンペプチドなどの付加価値産物を、プロテアーゼによる酵素精練後に廃液から分離することができる。

Claims

受託番号ＭＴＣＣ−５１８５を有するコニディオボルス・ブレフェルディアヌス（Conidiobolus brefeldianus）真菌株。
炭素、窒素および使用される誘導物質に応じて、受託番号ＭＴＣＣ−５１８５を有するコニディオボルス・ブレフェルディアヌス由来のプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼからなる群から単独または同時に選択される１種以上の酵素の調製方法であって、
ａ）好気条件下、５．０〜１０の範囲のｐＨおよび１５℃〜３７℃の範囲の温度ならびに２〜５日間の期間で、炭素および窒素源ならびに誘導物質を含む培地で該コニディオボルス・ブレフェルディアヌスＭＴＣＣ−５１８５真菌株を培養すること、
ｂ）該培地を回収すること、および
ｃ）従来の方法によって液相中で該酵素を分離／抽出すること、
を含む方法。
液中条件で該コニディオボルス属の種を培養することを含む、請求項２に記載の方法。
固相発酵で該コニディオボルス属の種を培養することを含む、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼが、限定されるものではないが、アルカリプロテアーゼ、エラスターゼ、ケラチナーゼおよびペプチダーゼの単独またはそれらの組合せから選択される、請求項２に記載の方法。
該カルボヒドラーゼは、限定されるものではないが、グリコシダーゼ、特にグリカナーゼ、より詳細には、キチナーゼ、ラミナリナーゼ、コンドロイチナーゼの単独またはそれらの組合せから選択される、請求項２に記載の方法。
該リパーゼがエステラーゼを含む、請求項２に記載の方法。
該炭素源が、限定されるものではないが、糖類、糖アルコール類、多糖類、オリーブ油、ヒマワリ油、大豆油、胡麻油、カラシ油、ヒマシ油、ヤシ油、落花生油、トリブチリンからなる群から選択される油脂、農産物、農業副産物／廃棄物などの単独またはそれらの組合せを含む、請求項２に記載の方法。
該糖類が、グルコース、フルクトース、アラビノース、スクロースおよびラクトースからなる群から選択され、糖アルコール類が、グリセリン、マンニトールおよびソルビトールであり、多糖類が澱粉であり、農産物／廃棄物が、大豆粉、大豆ミール、落花生粕、カラシ種子粕、綿実粕、小麦ふすまおよび米糠、酪農、家禽、肉および食品加工からの廃棄物、毛髪、羽毛などのケラチン豊富な廃棄物、漁場からの廃棄物、酸で膨張したキチン、キチン含有廃棄物である、請求項８に記載の方法。
該窒素源が、任意に有機または無機窒素源の単独またはそれらの組合せである、請求項２に記載の方法。
該無機窒素源が、限定されるものではないが、リン酸水素二アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムおよび尿素から選択される、請求項１０に記載の方法。
該有機窒素源が、限定されるものではないが、ペプトン、トリプトン、ソイトース、大豆ペプトン、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、魚粉、羽毛粉、羽毛、コーンスティープリカーならびに大豆粉、大豆ミール、ベサン粉、緑豆粉、カラシ種子粕、綿実粕、落花生粕、小麦ふすまおよび米糠によって例示される窒素豊富なマメ科の基質の単独またはそれらの組合せから選択される、請求項２に記載の方法。
該酵素を、従来の方法によって液相で分離／抽出する、請求項２に記載の方法。
該酵素を、凍結乾燥、噴霧乾燥によって、あるいは有機溶媒、塩析法または限外濾過を用いて濃縮する、請求項２に記載の方法。
該酵素を、無機塩を用いて部分的に精製および濃縮する、請求項２に記載の方法。
該無機塩が、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムの群から選択される、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼが、４〜４０℃の範囲の温度で安定である、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼが、３０〜６０℃の温度範囲で活性であり、３〜１２のｐＨ範囲、好ましくはｐＨ７で安定である、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼが、洗剤、水混和性有機溶媒および水不混和性有機溶媒の存在下で安定である、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼが５０℃まで安定である、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼが、６〜１１のｐＨ範囲、およびキレート剤、金属イオンの存在下で活性である、請求項２に記載の方法。
該粗製プロテアーゼおよび部分精製プロテアーゼが、カゼイン、アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン、エラスチン−オルシン、アゾカゼイン、アゾコール、Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）およびゼラチンに対して活性である、請求項２に記載の方法。
該プロテアーゼが、セリンプロテアーゼであり、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）によって阻害される、請求項２に記載の方法。
プロテアーゼが本物のコラーゲンに対して不活性である、請求項２に記載の方法によって調製された酵素。
該リパーゼが、４〜９のｐＨ範囲および２０〜６０℃の温度範囲で活性である、請求項２に記載の方法によって調製された酵素。
該酵素が、粗製型、固定化型、細胞結合型、純化型および精製型であり、限定されるものではないが、噴霧乾燥、凍結乾燥、濾過、濃縮、純化および精製から選択される方法に供される、請求項２に記載の方法によって調製された酵素。
革の製造での脱毛作業、写真フィルムからの銀の回収、絹の精練、廃棄精練液および洗剤組成物からの付加価値生成物の回収のための、限定されるものではないが、受託番号ＭＴＣＣ−５１８５を有するコニディオボルス属の種由来のプロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択された少なくとも１種の酵素を含む請求項２に記載の方法によって調製された酵素の使用。