JPH09224666A - 低温活性プロテアーゼｃｐ５８および低温性細菌 - Google Patents
低温活性プロテアーゼｃｐ５８および低温性細菌Info
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- JPH09224666A JPH09224666A JP2961696A JP2961696A JPH09224666A JP H09224666 A JPH09224666 A JP H09224666A JP 2961696 A JP2961696 A JP 2961696A JP 2961696 A JP2961696 A JP 2961696A JP H09224666 A JPH09224666 A JP H09224666A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
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- C11D3/16—Organic compounds
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- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規な低温活性プロテアーゼの提供。
【構成】 次の性質を有するプロテアーゼ。作用および
基質特異性：カゼイン、ゼラチン、アルブミン、および
ヘモグロビンに作用して、これらをカゼイン、ゼラチ
ン、アルブミン、ヘモグロビンの順で特異的に分解す
る。至適作用ｐＨ：７．５〜８．０、ｐＨ安定性：２０
℃、１時間保持の条件下でｐＨ５．５〜１０．５におい
て安定である、至適作用温度：ｐＨ１０．５の条件下で
２０℃、ｐＨ８．０の条件下で４０℃である、温度安定
性：ｐＨ１０．５、１時間保持の条件下で、１０〜３０
℃の温度ではほとんど失活せず、４０℃で約３０％失活
し、５０℃で完全に失活する、酵素活性：２０℃におい
て、最大活性の約６０％以上の活性を有する、酵素の活
性中心：金属イオン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量：
約５８ｋＤａ。
基質特異性：カゼイン、ゼラチン、アルブミン、および
ヘモグロビンに作用して、これらをカゼイン、ゼラチ
ン、アルブミン、ヘモグロビンの順で特異的に分解す
る。至適作用ｐＨ：７．５〜８．０、ｐＨ安定性：２０
℃、１時間保持の条件下でｐＨ５．５〜１０．５におい
て安定である、至適作用温度：ｐＨ１０．５の条件下で
２０℃、ｐＨ８．０の条件下で４０℃である、温度安定
性：ｐＨ１０．５、１時間保持の条件下で、１０〜３０
℃の温度ではほとんど失活せず、４０℃で約３０％失活
し、５０℃で完全に失活する、酵素活性：２０℃におい
て、最大活性の約６０％以上の活性を有する、酵素の活
性中心：金属イオン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量：
約５８ｋＤａ。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、低温域で高い活性を有するプロテアーゼおよ
びその利用並びに低温活性プロテアーゼを生産する微生
物に関する。
びその利用並びに低温活性プロテアーゼを生産する微生
物に関する。
【０００２】背景技術 低温性細菌はかなり古くから知られており、その存在は
広く低温環境に確認できる。たとえば土壌、魚介類、乳
製品に加え、人工的に作られた低温環境などからも分離
することができるとされている。従来より食品微生物学
上の必要性から低温性細菌の研究が行われてきたが、そ
れは主として微生物の系統学的研究に関するものにとど
まっていた。
広く低温環境に確認できる。たとえば土壌、魚介類、乳
製品に加え、人工的に作られた低温環境などからも分離
することができるとされている。従来より食品微生物学
上の必要性から低温性細菌の研究が行われてきたが、そ
れは主として微生物の系統学的研究に関するものにとど
まっていた。
【０００３】低温性細菌から得られる酵素は、低温に最
適温度を持つ低温酵素であることが期待できる。低温で
効率よく作用する酵素は、例えば、衣料用洗剤に添加さ
れて、低水温でも利用可能な洗剤を実現できると思われ
る。さらに、常温で揮発性である有機溶媒の存在下での
化学反応への利用、腐敗を起こさない低温度での食品の
品質改善への利用などが考えられる。また、低温性細菌
由来の酵素を検討することで、低温性細菌の生理学的機
能および低温度への適用機構を解明する上で意義深いも
のと思われる。
適温度を持つ低温酵素であることが期待できる。低温で
効率よく作用する酵素は、例えば、衣料用洗剤に添加さ
れて、低水温でも利用可能な洗剤を実現できると思われ
る。さらに、常温で揮発性である有機溶媒の存在下での
化学反応への利用、腐敗を起こさない低温度での食品の
品質改善への利用などが考えられる。また、低温性細菌
由来の酵素を検討することで、低温性細菌の生理学的機
能および低温度への適用機構を解明する上で意義深いも
のと思われる。
【０００４】
【発明の概要】今般本発明者らは、Serratia marcescen
s ＡＰ３８０１株の培養上清からプロテアーゼを単離、
精製し、該プロテアーゼが低温において活性を有するこ
とを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものであ
る。従って、本発明は、低温活性プロテアーゼ、前記プ
ロテアーゼを生産する微生物、前記微生物を用いた前記
プロテアーゼの製造法、および前記プロテアーゼのＮ末
端に存在するアミノ酸配列からなるペプチド等の提供を
その目的としている。
s ＡＰ３８０１株の培養上清からプロテアーゼを単離、
精製し、該プロテアーゼが低温において活性を有するこ
とを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものであ
る。従って、本発明は、低温活性プロテアーゼ、前記プ
ロテアーゼを生産する微生物、前記微生物を用いた前記
プロテアーゼの製造法、および前記プロテアーゼのＮ末
端に存在するアミノ酸配列からなるペプチド等の提供を
その目的としている。
【０００５】そして、本発明によるプロテアーゼは、下
記の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、アルブ
ミン、およびヘモグロビンに作用して、これらをカゼイ
ン、ゼラチン、アルブミン、およびヘモグロビンの順で
特異的に分解する。 ・至適作用ｐＨ：７．５〜８．０である。 ・ｐＨ安定性：２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ５．
５〜１０．５において安定である。
記の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、アルブ
ミン、およびヘモグロビンに作用して、これらをカゼイ
ン、ゼラチン、アルブミン、およびヘモグロビンの順で
特異的に分解する。 ・至適作用ｐＨ：７．５〜８．０である。 ・ｐＨ安定性：２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ５．
５〜１０．５において安定である。
【０００６】本発明によるプロテアーゼは、更に、下記
の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・至適作用温度：ｐＨ１０．５の条件下で２０℃、ｐＨ
８．０の条件下で４０℃である。 ・温度安定性：ｐＨ１０．５、１時間保持の条件下で、
１０〜３０℃の温度ではほとんど失活せず、４０℃で約
３０％失活し、５０℃で完全に失活する。 ・酵素活性：２０℃において、本発明によるプロテアー
ゼは、ｐＨ１０．５で最大活性を有し、ｐＨ８．０で最
大活性の約６０％以上の活性を有する。 ・本発明によるプロテアーゼは金属プロテアーゼまたは
金属活性プロテアーゼに属する。 ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約５８ｋＤａであ
る。 ・等電点電気泳動による等電点は約７．４である。 ・配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を
含んでなるタンパク質からなるものであるか、または配
列番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末
端に含んでなるタンパク質からなるものである。
の理化学的性質の一部または全部を有するもの、であ
る。 ・至適作用温度：ｐＨ１０．５の条件下で２０℃、ｐＨ
８．０の条件下で４０℃である。 ・温度安定性：ｐＨ１０．５、１時間保持の条件下で、
１０〜３０℃の温度ではほとんど失活せず、４０℃で約
３０％失活し、５０℃で完全に失活する。 ・酵素活性：２０℃において、本発明によるプロテアー
ゼは、ｐＨ１０．５で最大活性を有し、ｐＨ８．０で最
大活性の約６０％以上の活性を有する。 ・本発明によるプロテアーゼは金属プロテアーゼまたは
金属活性プロテアーゼに属する。 ・ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約５８ｋＤａであ
る。 ・等電点電気泳動による等電点は約７．４である。 ・配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部を
含んでなるタンパク質からなるものであるか、または配
列番号１に記載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末
端に含んでなるタンパク質からなるものである。
【０００７】また、本発明による微生物は、上記プロテ
アーゼ産生能を有するSerratia marcescens に属する微
生物（ＡＰ３８０１株）である。本発明による上記プロ
テアーゼの製造法は、前記微生物を培養し、そしてその
培養物から該プロテアーゼを採取することを含んでなる
もの、である。
アーゼ産生能を有するSerratia marcescens に属する微
生物（ＡＰ３８０１株）である。本発明による上記プロ
テアーゼの製造法は、前記微生物を培養し、そしてその
培養物から該プロテアーゼを採取することを含んでなる
もの、である。
【０００８】
【発明の具体的説明】低温活性プロテアーゼを産生する微生物 本発明による低温プロテアーゼは、微生物を用いて生産
される。その生産菌としてはSerratia属に属し、かつ上
記性質を有するプロテアーゼを産出する能力を有するも
のであればよい。また、実施例１２に示されるように、
上記微生物は、１０〜２５℃において良好に生育でき
る。
される。その生産菌としてはSerratia属に属し、かつ上
記性質を有するプロテアーゼを産出する能力を有するも
のであればよい。また、実施例１２に示されるように、
上記微生物は、１０〜２５℃において良好に生育でき
る。
【０００９】本発明によるプロテアーゼを産生する能力
を有する微生物の好ましい具体例としては、Serratia m
arcescens ＡＰ３８０１株が挙げられる。この菌株は、
本発明者が土壌（標高約１０００ｍ）から単離した微生
物であり、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８
年２月１５日付けで寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０１
のもと寄託されている。
を有する微生物の好ましい具体例としては、Serratia m
arcescens ＡＰ３８０１株が挙げられる。この菌株は、
本発明者が土壌（標高約１０００ｍ）から単離した微生
物であり、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８
年２月１５日付けで寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０１
のもと寄託されている。
【００１０】本発明によるSarratia marcescens ＡＰ３
８０１株の菌学的性質を列挙すれば下記の通りである。 （１）形態的性質 運動性を持ち、形態は単捍菌である。 （２）培地上での性状 寒天培地上および液体培地で生育し、白色または淡い黄
色を呈する。 （３）生育最適条件 少なくとも１０℃から２５℃までは良好に生育するが、
３７℃以上になると生育しない。
８０１株の菌学的性質を列挙すれば下記の通りである。 （１）形態的性質 運動性を持ち、形態は単捍菌である。 （２）培地上での性状 寒天培地上および液体培地で生育し、白色または淡い黄
色を呈する。 （３）生育最適条件 少なくとも１０℃から２５℃までは良好に生育するが、
３７℃以上になると生育しない。
【００１１】（４）菌体外に放出されるプロテアーゼ １０℃から２５℃で生育させた菌体からはいずれもプロ
テアーゼが放出される。１０℃で生育させた菌体由来の
プロテアーゼのほうが２５℃で生育させた菌体由来のプ
ロテアーゼよりもプロテアーゼ活性が高い。 （５）好気性または嫌気性の区別 生化学的試験から通性嫌気性と判断される。 （６）グラム染色 グラム染色による測定から陰性と認められる。 （７）生化学的性状 Serratia marcescens ＡＰ３８０１株の主な生化学的性
状は、次の第１表に示される通りであった。
テアーゼが放出される。１０℃で生育させた菌体由来の
プロテアーゼのほうが２５℃で生育させた菌体由来のプ
ロテアーゼよりもプロテアーゼ活性が高い。 （５）好気性または嫌気性の区別 生化学的試験から通性嫌気性と判断される。 （６）グラム染色 グラム染色による測定から陰性と認められる。 （７）生化学的性状 Serratia marcescens ＡＰ３８０１株の主な生化学的性
状は、次の第１表に示される通りであった。
【００１２】
【表１】
【００１３】以上の性質から、本発明で得られた微生物
はSerratia marcescens と判断され、１６Ｓリボソーム
ＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を既知の微生物と
比較したところでも、本菌株はSerratia marcescens に
分類されるのが適切と判断された。
はSerratia marcescens と判断され、１６Ｓリボソーム
ＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列を既知の微生物と
比較したところでも、本菌株はSerratia marcescens に
分類されるのが適切と判断された。
【００１４】微生物の培養 本発明に使用される菌株の培養にあたっては、培地は液
体でも固体でもよいが通常は液体培地による振とう培
養、または通気攪拌培養が用いられる。この微生物を培
養する培地としては、生育に適し、プロテアーゼを生産
し得るものであればどのようなものでもよい。すなわち
炭素源としては、例えばグルコース、トレハロース、フ
ラクトース、マルトース、シュークロース、デンプン、
マルトオリゴ糖等が用いられる。窒素源としては例えば
ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、大豆
粉、綿実粉、コーンステイープリカー、各種アミノ酸
類、およびその塩類、硝酸塩等が用いられる。その他、
リン酸マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウ
ム、鉄、マンガン等の無機塩類、さらに必要に応じてそ
の他の栄養物を程よく含有する合成培地または天然培地
を使用することができる。
体でも固体でもよいが通常は液体培地による振とう培
養、または通気攪拌培養が用いられる。この微生物を培
養する培地としては、生育に適し、プロテアーゼを生産
し得るものであればどのようなものでもよい。すなわち
炭素源としては、例えばグルコース、トレハロース、フ
ラクトース、マルトース、シュークロース、デンプン、
マルトオリゴ糖等が用いられる。窒素源としては例えば
ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、大豆
粉、綿実粉、コーンステイープリカー、各種アミノ酸
類、およびその塩類、硝酸塩等が用いられる。その他、
リン酸マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、カリウ
ム、鉄、マンガン等の無機塩類、さらに必要に応じてそ
の他の栄養物を程よく含有する合成培地または天然培地
を使用することができる。
【００１５】培地のｐＨ、培養温度などの培養条件はプ
ロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液体
振とう培養、または通気攪拌培養の場合は、ｐＨはアル
カリ性（例えばｐＨ１０）、培養温度は１０℃付近の培
養が適当である。本発明によるプロテアーゼは培養上清
のみならず菌体の細胞壁、菌体内に存在する。その使用
形態としては、菌体、菌体や培養上清等からの粗酵素、
あるいは抽出精製酵素などいずれの形態でも良い。また
公知の方法により固定化したものも利用できる。上記培
養液からの本発明によるプロテアーゼの採取、精製に
は、既知の精製法が単独もしくは併用して利用できる。
ロテアーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、液体
振とう培養、または通気攪拌培養の場合は、ｐＨはアル
カリ性（例えばｐＨ１０）、培養温度は１０℃付近の培
養が適当である。本発明によるプロテアーゼは培養上清
のみならず菌体の細胞壁、菌体内に存在する。その使用
形態としては、菌体、菌体や培養上清等からの粗酵素、
あるいは抽出精製酵素などいずれの形態でも良い。また
公知の方法により固定化したものも利用できる。上記培
養液からの本発明によるプロテアーゼの採取、精製に
は、既知の精製法が単独もしくは併用して利用できる。
【００１６】本発明によるプロテアーゼは、主として菌
体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘過
または遠心分離により菌体を除去することによって容易
に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さらに
既知の精製法によって精製することができる。好ましい
精製法としては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例え
ば、メタノール、エタノール、アセトンなど）による沈
殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、そ
の他の各種クロマトグラフィーなどが挙げられる。好ま
しい精製法の具体例は後記する実施例において記載す
る。
体外、すなわち培養液中に分泌されるため、例えば瀘過
または遠心分離により菌体を除去することによって容易
に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さらに
既知の精製法によって精製することができる。好ましい
精製法としては、硫安などによる塩析、有機溶媒（例え
ば、メタノール、エタノール、アセトンなど）による沈
殿法、生デンプンによる吸着法、限外瀘過、ゲル瀘過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、そ
の他の各種クロマトグラフィーなどが挙げられる。好ま
しい精製法の具体例は後記する実施例において記載す
る。
【００１７】酵素の性質 本発明による酵素の性質は、次に示される通りである。 （１） 作用および基質特異性 本発明による酵素は、カゼイン、ゼラチン、アルブミ
ン、およびヘモグロビンに作用してこれらを特異的に分
解した。基質特異性は、カゼイン、ゼラチン、アルブミ
ン、ヘモグロビンの順で小さくなる。 （２） 至適ｐＨ 本発明による酵素の至適作用ｐＨは７．５〜８．０であ
った。また、ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．５まで約５０％以
上の活性を保持していた。 （３） ｐＨ安定性 本発明による酵素は、２０℃、１時間保持の条件下で、
ｐＨ５．５〜１０．５において６０％以上の活性を保持
していた。
ン、およびヘモグロビンに作用してこれらを特異的に分
解した。基質特異性は、カゼイン、ゼラチン、アルブミ
ン、ヘモグロビンの順で小さくなる。 （２） 至適ｐＨ 本発明による酵素の至適作用ｐＨは７．５〜８．０であ
った。また、ｐＨ５．５〜ｐＨ１０．５まで約５０％以
上の活性を保持していた。 （３） ｐＨ安定性 本発明による酵素は、２０℃、１時間保持の条件下で、
ｐＨ５．５〜１０．５において６０％以上の活性を保持
していた。
【００１８】（４） 至適温度 本発明による酵素の至適作用温度は、ｐＨ１０．５の条
件で２０℃であり、ｐＨ８．０の条件では４０℃であっ
た。３０℃においても、いずれの場合でもほぼ８０％近
い活性を保持していた。また、１０℃では約５０％の活
性を保持していた。市販の酵素であるサビナーゼでは、
至適温度が６０℃である。また、既知の低温酵素の至適
温度や、約４０℃付近であることが多い。従って、本発
明による酵素は、低温酵素であると考えられる。 （５） 温度安定性 本発明による酵素は、ｐＨ１０．５、１時間保持の条件
下で、１０〜３０℃までの温度ではほとんど失活せず、
４０℃で約３０％失活し、５０℃で完全に失活する。従
って、本発明による酵素は、低温酵素であると考えられ
る。
件で２０℃であり、ｐＨ８．０の条件では４０℃であっ
た。３０℃においても、いずれの場合でもほぼ８０％近
い活性を保持していた。また、１０℃では約５０％の活
性を保持していた。市販の酵素であるサビナーゼでは、
至適温度が６０℃である。また、既知の低温酵素の至適
温度や、約４０℃付近であることが多い。従って、本発
明による酵素は、低温酵素であると考えられる。 （５） 温度安定性 本発明による酵素は、ｐＨ１０．５、１時間保持の条件
下で、１０〜３０℃までの温度ではほとんど失活せず、
４０℃で約３０％失活し、５０℃で完全に失活する。従
って、本発明による酵素は、低温酵素であると考えられ
る。
【００１９】（６） 酵素活性 本発明による酵素は、２０℃において、ｐＨ０．５で最
大活性を有し、ｐＨ８．０で最大活性の約６０％以上の
活性を有する。従って、本発明の別の面によれば、２０
℃において、その最大活性の約６０％以上の活性を有す
るプロテアーゼが提供される。 （７） 活性の阻害 本発明による酵素は、ペプスタチン、L-trans-エポキシ
スクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン（Ｅ
−６４）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭ
ＳＦ）によってそのプロテアーゼ活性を阻害されること
なく、１，１０−フェナントロリン、エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）によって顕著に阻害された。また、
後述のように本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列は
金属プロテアーゼと約５０％相同性を有していた。従っ
て、本発明による酵素は金属プロテアーゼまたは金属活
性プロテアーゼであることが示唆された。即ち、本発明
による酵素の活性中心は、金属イオンであると考えられ
る。
大活性を有し、ｐＨ８．０で最大活性の約６０％以上の
活性を有する。従って、本発明の別の面によれば、２０
℃において、その最大活性の約６０％以上の活性を有す
るプロテアーゼが提供される。 （７） 活性の阻害 本発明による酵素は、ペプスタチン、L-trans-エポキシ
スクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン（Ｅ
−６４）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭ
ＳＦ）によってそのプロテアーゼ活性を阻害されること
なく、１，１０−フェナントロリン、エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）によって顕著に阻害された。また、
後述のように本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列は
金属プロテアーゼと約５０％相同性を有していた。従っ
て、本発明による酵素は金属プロテアーゼまたは金属活
性プロテアーゼであることが示唆された。即ち、本発明
による酵素の活性中心は、金属イオンであると考えられ
る。
【００２０】（８） 分子量 本発明による酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定し
た分子量が約５８ｋＤａであった。 （９） 等電点 等電点電気泳動による測定の結果、等電点は約７．４で
あった。この値は既知のプロテアーゼと比較して高いと
考えられる。 （10） Ｎ末端アミノ酸配列 本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列は、図７および
配列番号１に記載される通りである。従って、本発明に
よるプロテアーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列
の一部または全部を含んでなるタンパク質からなるも
の、または配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部また
は全部をＮ末端に含んでなるタンパク質からなるもので
あってもよい。
た分子量が約５８ｋＤａであった。 （９） 等電点 等電点電気泳動による測定の結果、等電点は約７．４で
あった。この値は既知のプロテアーゼと比較して高いと
考えられる。 （10） Ｎ末端アミノ酸配列 本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列は、図７および
配列番号１に記載される通りである。従って、本発明に
よるプロテアーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列
の一部または全部を含んでなるタンパク質からなるも
の、または配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部また
は全部をＮ末端に含んでなるタンパク質からなるもので
あってもよい。
【００２１】本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列に
ついてデータバンク「Ｅｎｔｒｅｚ」を用いて既知のタ
ンパク質のアミノ酸配列との相同性を調べたところ、金
属プロテアーゼのアミノ酸配列と約５０％相同性があっ
た。
ついてデータバンク「Ｅｎｔｒｅｚ」を用いて既知のタ
ンパク質のアミノ酸配列との相同性を調べたところ、金
属プロテアーゼのアミノ酸配列と約５０％相同性があっ
た。
【００２２】本発明の更に別の面によれば、配列番号１
に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んでなるタ
ンパク質からなるプロテアーゼ、および配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含んでな
るタンパク質からなるプロテアーゼが提供される。この
プロテアーゼは、上記（１）〜（９）に記載されるよう
な性質を有していてもよい。ここで、「配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部を含んでなるタンパ
ク質」とは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列の一
部または全部のＮ末端および／またはＣ末端に任意のア
ミノ酸配列を付加したタンパク質が挙げられる。
に記載のアミノ酸配列の一部または全部を含んでなるタ
ンパク質からなるプロテアーゼ、および配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部をＮ末端に含んでな
るタンパク質からなるプロテアーゼが提供される。この
プロテアーゼは、上記（１）〜（９）に記載されるよう
な性質を有していてもよい。ここで、「配列番号１に記
載のアミノ酸配列の一部または全部を含んでなるタンパ
ク質」とは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列の一
部または全部のＮ末端および／またはＣ末端に任意のア
ミノ酸配列を付加したタンパク質が挙げられる。
【００２３】酵素の利用 本発明による低温活性プロテアーゼは、低温に最適温度
をもつ。そこで、本発明による低温活性プロテアーゼに
よれば、低温環境においてタンパク質の分解反応を行う
ことが可能となる。例えば、衣料用洗剤組成物に添加す
ることで、低水温でも利用可能な洗剤を実現できる。こ
の洗剤組成物は、本発明による低温活性プロテアーゼが
添加された以外は、常法に従って構成することができ
る。すなわち、洗剤用界面活性剤、漂白剤、ビルダーな
ど、通常の洗剤組成物と組み合わせて構成することがで
きる。
をもつ。そこで、本発明による低温活性プロテアーゼに
よれば、低温環境においてタンパク質の分解反応を行う
ことが可能となる。例えば、衣料用洗剤組成物に添加す
ることで、低水温でも利用可能な洗剤を実現できる。こ
の洗剤組成物は、本発明による低温活性プロテアーゼが
添加された以外は、常法に従って構成することができ
る。すなわち、洗剤用界面活性剤、漂白剤、ビルダーな
ど、通常の洗剤組成物と組み合わせて構成することがで
きる。
【００２４】さらに、本発明による低温活性プロテアー
ゼは、低温で反応を進行させることができる。したがっ
て、反応系に常温で揮発性である有機溶媒が存在する場
合であっても、有機溶媒成分を揮発させることのない低
温下で反応を行うことができる。また、さらに、本発明
によるプロテアーゼを用いて、食品の品質改善を行う場
合、低温で反応が進むことから、食品の腐敗を有効に防
止できる点でも有利である。また、本発明によるプロテ
アーゼが提供されたことで、低温性細菌の生理学的機
能、および低温度への適用機構の解明が進むことが期待
される。
ゼは、低温で反応を進行させることができる。したがっ
て、反応系に常温で揮発性である有機溶媒が存在する場
合であっても、有機溶媒成分を揮発させることのない低
温下で反応を行うことができる。また、さらに、本発明
によるプロテアーゼを用いて、食品の品質改善を行う場
合、低温で反応が進むことから、食品の腐敗を有効に防
止できる点でも有利である。また、本発明によるプロテ
アーゼが提供されたことで、低温性細菌の生理学的機
能、および低温度への適用機構の解明が進むことが期待
される。
【００２５】Ｎ末端アミノ酸配列を有するタンパク質等 本発明によれば配列番号１に記載されるアミノ酸配列の
一部または全部からなるペプチド、並びに配列番号１に
記載されるアミノ酸配列の一部または全部を含んでなる
タンパク質および配列番号１に記載されるアミノ酸配列
の一部または全部をＮ末端に含んでなるタンパク質が提
供される。このタンパク質は、プロテアーゼ活性を有し
ていてもよい。このペプチドまたはタンパク質は、本発
明による酵素のＮ末端に存在するアミノ酸配列の一部ま
たは全部からなるもの、またはこのアミノ酸配列の一部
または全部を（好ましくはＮ端末に）含んでなるもの、
である。従って、上記ペプチドまたはタンパク質は、例
えば、本発明による酵素に対する抗体を作成する際の抗
原として有用である。
一部または全部からなるペプチド、並びに配列番号１に
記載されるアミノ酸配列の一部または全部を含んでなる
タンパク質および配列番号１に記載されるアミノ酸配列
の一部または全部をＮ末端に含んでなるタンパク質が提
供される。このタンパク質は、プロテアーゼ活性を有し
ていてもよい。このペプチドまたはタンパク質は、本発
明による酵素のＮ末端に存在するアミノ酸配列の一部ま
たは全部からなるもの、またはこのアミノ酸配列の一部
または全部を（好ましくはＮ端末に）含んでなるもの、
である。従って、上記ペプチドまたはタンパク質は、例
えば、本発明による酵素に対する抗体を作成する際の抗
原として有用である。
【００２６】
【実施例】以下に、具体的な実施例を示し、本発明をよ
り詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定さ
れないことは言うまでもない。試験方法 特に断らない限り、タンパク質量の測定は、色素結合法
であるバイオラッドプロテインアッセイ（バイオラッド
社）を用いて行った。また、クロマトグラフィーのタン
パク質の検出は、２８０ｎｍの紫外部の吸収を測定する
ことにより行った。また、プロテアーゼの活性の測定
は、次の（ａ）または（ｂ）の方法に従って行った。
り詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定さ
れないことは言うまでもない。試験方法 特に断らない限り、タンパク質量の測定は、色素結合法
であるバイオラッドプロテインアッセイ（バイオラッド
社）を用いて行った。また、クロマトグラフィーのタン
パク質の検出は、２８０ｎｍの紫外部の吸収を測定する
ことにより行った。また、プロテアーゼの活性の測定
は、次の（ａ）または（ｂ）の方法に従って行った。
【００２７】（ａ）アゾカゼインによるタンパク質の分
解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む５００ｍＭグリシン
ー水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）０．３ｍｌ
に対して、試料酵素液０．０５ｍｌ加え、３０分間２０
℃で保温した。その後、６％トリクロロ酢酸１ｍｌで反
応を止め、室温で約３０分間放置後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ、室温、１０分）した。その上清を分光光度
計を用いて、３４０ｎｍの吸光度を測定した。
解活性 １％（Ｗ／Ｖ）アゾカゼインを含む５００ｍＭグリシン
ー水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）０．３ｍｌ
に対して、試料酵素液０．０５ｍｌ加え、３０分間２０
℃で保温した。その後、６％トリクロロ酢酸１ｍｌで反
応を止め、室温で約３０分間放置後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ、室温、１０分）した。その上清を分光光度
計を用いて、３４０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２８】（ｂ）フェノール試薬法 １％（Ｗ／Ｖ）基質溶液を含む１００ｍＭグリシンー水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）１３０μｌに対
して、試料酵素液２０μｌ加え、３０分間２０℃で保温
した。その後、トリクロロ酢酸溶液（０．１１Ｍ トリ
クロロ酢酸、０．２２Ｍ 酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ
酢酸）を１５０μｌ加え反応を止めた。３０分間室温
で放置後、遠心（１００００ｒｐｍ、室温、１０分）
し、その上清１００μｌに０．５Ｍ 炭酸ナトリウム溶
液５００μｌ、および蒸留水で２培希釈したフェノール
試薬溶液を１００μｌ加え、室温で１時間放置後、６６
０ｎｍの吸収を測定した。
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．５）１３０μｌに対
して、試料酵素液２０μｌ加え、３０分間２０℃で保温
した。その後、トリクロロ酢酸溶液（０．１１Ｍ トリ
クロロ酢酸、０．２２Ｍ 酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ
酢酸）を１５０μｌ加え反応を止めた。３０分間室温
で放置後、遠心（１００００ｒｐｍ、室温、１０分）
し、その上清１００μｌに０．５Ｍ 炭酸ナトリウム溶
液５００μｌ、および蒸留水で２培希釈したフェノール
試薬溶液を１００μｌ加え、室温で１時間放置後、６６
０ｎｍの吸収を測定した。
【００２９】実施例１ 新規微生物のスクリーニング 新規微生物の分離は、寒天平板培地上で行った。福井県
和泉村九頭龍ダム付近で採取した土壌を０．１ｇ生理的
食塩水に懸濁し、その上清を原液とし、この原液の１０
2 希釈液を調製した。原液および１０2 希釈液をスクリ
ーニング用寒天平板培地上（グルコース ５ｇ／リット
ル、酵母エキス ５ｇ／リットル、カゼインナトリウム
１ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／
リットル、Ｋ2 ＨＳＯ4 １．０ｇ／リットル Ｎａ2
ＣＯ3 １０ｇ／リットル、寒天１．５／リットル）に
散布し、１０℃で３日から４日間培養した。上記の寒天
培地上に生育したコロニーのなかで、生育の良いものを
選びこれを継体培養、および保持培地に植菌した。
和泉村九頭龍ダム付近で採取した土壌を０．１ｇ生理的
食塩水に懸濁し、その上清を原液とし、この原液の１０
2 希釈液を調製した。原液および１０2 希釈液をスクリ
ーニング用寒天平板培地上（グルコース ５ｇ／リット
ル、酵母エキス ５ｇ／リットル、カゼインナトリウム
１ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．２ｇ／
リットル、Ｋ2 ＨＳＯ4 １．０ｇ／リットル Ｎａ2
ＣＯ3 １０ｇ／リットル、寒天１．５／リットル）に
散布し、１０℃で３日から４日間培養した。上記の寒天
培地上に生育したコロニーのなかで、生育の良いものを
選びこれを継体培養、および保持培地に植菌した。
【００３０】菌体外にプロテアーゼを放出しているかど
うかの確認は寒天培地上で行った。上記のスクリーニン
グ用寒天培地に分離し、１０℃、７２時間培養した。そ
の後、菌の生育した寒天培地上に１０％トリクロロ酢酸
溶液を散布し、コロニーのまわりの透明斑の有無の存在
によりプロテアーゼを菌体外に放出するものかを確認し
た。
うかの確認は寒天培地上で行った。上記のスクリーニン
グ用寒天培地に分離し、１０℃、７２時間培養した。そ
の後、菌の生育した寒天培地上に１０％トリクロロ酢酸
溶液を散布し、コロニーのまわりの透明斑の有無の存在
によりプロテアーゼを菌体外に放出するものかを確認し
た。
【００３１】菌の生育活性を安定化させるために、菌株
を下記の培養培地１５０ｍｌ（１００ｍｌ三角フラスコ
６本に２５ｍｌずつ分注）に接種し、１０℃、７２時
間、トリプルシェイカーＮＲ−８０（タイテック社）を
用いて、１４０ｒｐｍで回転振盪培養した。本培養は、
ラボラトリーファーメンターＬＳ−５（オリエンタル酵
母工業株式会社）を用いて下記の培養地３リットルに前
培養液１５０ｍｌ接種し、１０℃、９６時間、１４０ｒ
ｐｍで回転培養した。
を下記の培養培地１５０ｍｌ（１００ｍｌ三角フラスコ
６本に２５ｍｌずつ分注）に接種し、１０℃、７２時
間、トリプルシェイカーＮＲ−８０（タイテック社）を
用いて、１４０ｒｐｍで回転振盪培養した。本培養は、
ラボラトリーファーメンターＬＳ−５（オリエンタル酵
母工業株式会社）を用いて下記の培養地３リットルに前
培養液１５０ｍｌ接種し、１０℃、９６時間、１４０ｒ
ｐｍで回転培養した。
【００３２】培養培地の組成 グルコース ０．５％ 酵母エキス ０．２５％ カゼインナトリウム ０．１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０２５％ Ｎａ2 ＣＯ3 １．２５％ ｐＨ１０．５ 培地等は、主としてオートクレーブで１．２kgf/cm2 ga
uge （１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌した。また
Serratia marcescens ＡＰ３８０１株は寒天平板培地を
用いて２週間から１か月で継代培養し、１０℃で保存し
た。
uge （１２１℃）、１５分間、高圧蒸気殺菌した。また
Serratia marcescens ＡＰ３８０１株は寒天平板培地を
用いて２週間から１か月で継代培養し、１０℃で保存し
た。
【００３３】実施例２ 酵素の精製 プロテアーゼのすべての精製操作は、４℃において行っ
た。 （ａ）イオン交換クロマトグラフィー 上記（１）で得られた培養液を、遠心分離（８．０００
×ｇ、４℃、１５分）を行い菌体と粗酵素とに分けた。
その粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィーに付し精
製を行った。カラムはＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換体（ファルマシアバイ
オテク社）を２リットル充填したＩＮｄＥＸ１００カラ
ム（ファルマシアバイオテク社）を用いた。上記のカラ
ムに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を
用いて、線速度（１５０ｃｍ／ｈ）でゲル体積の５倍以
上（１０リットル）の緩衝液を用いて平衡化した。粗酵
素液を線速度１００ｃｍ／ｈで添加した。溶出は、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に０．２
Ｍ、０．４Ｍ、および０．６Ｍ ＮａＣｌを加えたもの
をそれぞれ３リットルずつ用いて、線速度１００ｃｍ／
ｈで溶出し、ＵＶ計でタンパク質が検出された部分だけ
を分取した。
た。 （ａ）イオン交換クロマトグラフィー 上記（１）で得られた培養液を、遠心分離（８．０００
×ｇ、４℃、１５分）を行い菌体と粗酵素とに分けた。
その粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィーに付し精
製を行った。カラムはＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換体（ファルマシアバイ
オテク社）を２リットル充填したＩＮｄＥＸ１００カラ
ム（ファルマシアバイオテク社）を用いた。上記のカラ
ムに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を
用いて、線速度（１５０ｃｍ／ｈ）でゲル体積の５倍以
上（１０リットル）の緩衝液を用いて平衡化した。粗酵
素液を線速度１００ｃｍ／ｈで添加した。溶出は、２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に０．２
Ｍ、０．４Ｍ、および０．６Ｍ ＮａＣｌを加えたもの
をそれぞれ３リットルずつ用いて、線速度１００ｃｍ／
ｈで溶出し、ＵＶ計でタンパク質が検出された部分だけ
を分取した。
【００３４】（ｂ）硫安塩析 上記のようにして得られた分画に、氷冷下で硫安を８０
％飽和になるように加えた。低温室で４℃に保ち一晩ゆ
っくりと撹拌した後、遠心分離（１８，０００×ｇ、４
℃、３０分）して酵素を沈殿させ、飽和分画を得た。硫
安の添加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用いた。
％飽和になるように加えた。低温室で４℃に保ち一晩ゆ
っくりと撹拌した後、遠心分離（１８，０００×ｇ、４
℃、３０分）して酵素を沈殿させ、飽和分画を得た。硫
安の添加量は、２５℃での飽和濃度添加量を用いた。
【００３５】（ｃ）ゲル濾過 次に、HiLoad 16/60 Superdex 200 perp gradeカラム
（ファルマシアバイオテク社）を用いてゲル濾過を行っ
た。装置はHiLOAD System 50（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。HiLoad 16/60 Superdex 200 perp grade
カラムに線速度約６０ｃｍ／ｈでゲル体積の３倍以上
（４００ｍｌ）のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
を流し平衡化した。硫安塩析後の試料酵素液をカラムに
Superloop を用いて５ｍｌ添加した。溶出液はＴｒｉｓ
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、線速度６０ｃｍ
／ｈで溶出し、５ｍｌづつ分取した。
（ファルマシアバイオテク社）を用いてゲル濾過を行っ
た。装置はHiLOAD System 50（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。HiLoad 16/60 Superdex 200 perp grade
カラムに線速度約６０ｃｍ／ｈでゲル体積の３倍以上
（４００ｍｌ）のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
を流し平衡化した。硫安塩析後の試料酵素液をカラムに
Superloop を用いて５ｍｌ添加した。溶出液はＴｒｉｓ
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、線速度６０ｃｍ
／ｈで溶出し、５ｍｌづつ分取した。
【００３６】実施例３ 酵素の精製純度および分子量測
定 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて本発明による酵素の
精製純度および分子量を測定した。支持体として１ｍｍ
厚の７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた。電気泳
動は、２０ｍＡ通電し、ブロモフェノールブルー（ＢＰ
Ｂ）が下端まで泳動するまで行った。染色法は、３０％
メタノール、１０％酢酸水溶液に０．０２％クマシーブ
リリアントブルーＲ２５０を溶解したもので１時間染色
し、脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）で一晩か
けて脱色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果および検量線は
図１および２に示される通りであった。
定 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて本発明による酵素の
精製純度および分子量を測定した。支持体として１ｍｍ
厚の７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた。電気泳
動は、２０ｍＡ通電し、ブロモフェノールブルー（ＢＰ
Ｂ）が下端まで泳動するまで行った。染色法は、３０％
メタノール、１０％酢酸水溶液に０．０２％クマシーブ
リリアントブルーＲ２５０を溶解したもので１時間染色
し、脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）で一晩か
けて脱色した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果および検量線は
図１および２に示される通りであった。
【００３７】実施例４ 酵素反応へのｐＨの影響 本発明による酵素を用いて、アゾカゼインの分解反応を
種々のｐＨにおいて実施した。反応液の緩衝液の組成
は、それぞれ１００ｍＭで、ＭＥＳ（２−モルホリノエ
タンスルホン酸−水和物）緩衝液（ｐＨ５．５−６．
５）、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）
緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸）緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳ（Ｎ
−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝
液（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘ
キシル−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ
１０．０−１１．０）、グリシン−塩化ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０−１３．０）とし
た。その結果は、図３に示される通りであった。
種々のｐＨにおいて実施した。反応液の緩衝液の組成
は、それぞれ１００ｍＭで、ＭＥＳ（２−モルホリノエ
タンスルホン酸−水和物）緩衝液（ｐＨ５．５−６．
５）、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）
緩衝液（ｐＨ６．５−８．０）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸）緩衝液（ｐＨ８．０−９．０）、ＣＨＥＳ（Ｎ
−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）緩衝
液（ｐＨ９．０−１０．０）、ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘ
キシル−３−アミノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ
１０．０−１１．０）、グリシン−塩化ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０−１３．０）とし
た。その結果は、図３に示される通りであった。
【００３８】至適ｐＨであるｐＨ７．５から８．０の相
対活性がｐＨ５．５からｐＨ１０．５まで約５０％以上
で維持された。よって、本発明による酵素は、中性ｐＨ
を中心としたかなり広範囲のｐＨにおいて作用するが、
ｐＨ１１．０以上のアルカリｐＨではあまり作用せず、
さらにアルカリ性のｐＨではプロテアーゼ活性は急速に
低下することがわかった。
対活性がｐＨ５．５からｐＨ１０．５まで約５０％以上
で維持された。よって、本発明による酵素は、中性ｐＨ
を中心としたかなり広範囲のｐＨにおいて作用するが、
ｐＨ１１．０以上のアルカリｐＨではあまり作用せず、
さらにアルカリ性のｐＨではプロテアーゼ活性は急速に
低下することがわかった。
【００３９】実施例５ 酵素のｐＨ安定性 本発明による酵素を上記の緩衝液を用いて２０℃で１時
間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。その結果
は、図４に示されるとおりであった。本発明による酵素
は、３０℃、１時間の条件で、ｐＨ６．０からｐＨ９．
５の範囲で８０％以上の残存活性があり、ｐＨ１１．０
以上のｐＨでは残存活性は４０％以下になった。
間保温し、残存プロテアーゼ活性を調べた。その結果
は、図４に示されるとおりであった。本発明による酵素
は、３０℃、１時間の条件で、ｐＨ６．０からｐＨ９．
５の範囲で８０％以上の残存活性があり、ｐＨ１１．０
以上のｐＨでは残存活性は４０％以下になった。
【００４０】実施例６ 酵素反応への温度の影響 本発明による酵素を用いてアゾカゼインの分解反応を５
０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．
５）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中における種
々の温度下において実施した。反応温度は１０から６０
℃まで変化させた。その結果は図５に示される通りであ
った。本発明による酵素の至適温度は、ｐＨ１０．５に
おいて至適作用温度は２０℃であり、また、ｐＨ８．０
においては４０℃であった。３０℃においても、いずれ
のｐＨでも活性はほぼ８０％以上有していた。また、４
０℃以上の温度では急速に活性は減少し、６０℃で完全
に失活した。このような本発明による酵素の至適作用温
度と、市販のプロテアーゼ酵素として知られているサビ
ナーゼの至適作用温度（６０℃）とから、本発明による
酵素は低温で活性を有するものと考えられる。
０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．
５）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中における種
々の温度下において実施した。反応温度は１０から６０
℃まで変化させた。その結果は図５に示される通りであ
った。本発明による酵素の至適温度は、ｐＨ１０．５に
おいて至適作用温度は２０℃であり、また、ｐＨ８．０
においては４０℃であった。３０℃においても、いずれ
のｐＨでも活性はほぼ８０％以上有していた。また、４
０℃以上の温度では急速に活性は減少し、６０℃で完全
に失活した。このような本発明による酵素の至適作用温
度と、市販のプロテアーゼ酵素として知られているサビ
ナーゼの至適作用温度（６０℃）とから、本発明による
酵素は低温で活性を有するものと考えられる。
【００４１】実施例７ 酵素の温度安定性 本発明による酵素を１時間保持の条件下において、１０
℃〜６０℃で保温した。その活性の経時変化は図６に示
されるとおりであった。本発明による酵素は、１時間の
１０℃、２０℃、３０℃での保温ではあまり変化しなか
った。しかし４０℃での保温では約７０％まで失活し、
その後徐々に失活していった。そして、５０℃、６０℃
では、急速に失活し、残存活性は１０％以下であった。
℃〜６０℃で保温した。その活性の経時変化は図６に示
されるとおりであった。本発明による酵素は、１時間の
１０℃、２０℃、３０℃での保温ではあまり変化しなか
った。しかし４０℃での保温では約７０％まで失活し、
その後徐々に失活していった。そして、５０℃、６０℃
では、急速に失活し、残存活性は１０％以下であった。
【００４２】実施例８ 酵素の阻害剤による影響 阻害剤として、アスパラギン酸プロテアーゼに作用する
ペプスタチン、システインプロテアーゼに作用するL-tr
ans-エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジ
ノブタン（Ｅ−６４）、セリンプロテアーゼに作用する
フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、金
属プロテアーゼおよび金属依存性プロテアーゼに作用す
る１，１０−フェナントロリン、エチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）を用いた。種々の終濃度になるように阻
害剤を加えた後、２０℃で１時間保温し、残存プロテア
ーゼ活性を調べた。その結果は、第２表に示されるとお
りであった。
ペプスタチン、システインプロテアーゼに作用するL-tr
ans-エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジ
ノブタン（Ｅ−６４）、セリンプロテアーゼに作用する
フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、金
属プロテアーゼおよび金属依存性プロテアーゼに作用す
る１，１０−フェナントロリン、エチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）を用いた。種々の終濃度になるように阻
害剤を加えた後、２０℃で１時間保温し、残存プロテア
ーゼ活性を調べた。その結果は、第２表に示されるとお
りであった。
【００４３】
【表２】
【００４４】本発明による酵素は、ペプスタチン、L-tr
ans-エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジ
ノブタン（Ｅ−６４）、フェニルメタンスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）によってはそのプロテアーゼ活性を
阻害されることなく、１，１０−フェナントロリン、エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって顕著に阻害
された。このことから、本発明による酵素は金属プロテ
アーゼであることが示唆された。したがって、酵素の活
性中心が金属イオンであると考えられる。また、エチレ
ンジアミン四酢酸では同じ金属プロテアーゼを阻害する
１，１０−フェナントロリンよりも残存活性が高かっ
た。以下の理論に拘束されるわけではないが、これはエ
チレンジアミン四酢酸がプロテアーゼの立体構造を形成
している金属イオンに対してキレート剤として働いてい
るのではないかと考えられる。
ans-エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジ
ノブタン（Ｅ−６４）、フェニルメタンスルホニルフル
オリド（ＰＭＳＦ）によってはそのプロテアーゼ活性を
阻害されることなく、１，１０−フェナントロリン、エ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）によって顕著に阻害
された。このことから、本発明による酵素は金属プロテ
アーゼであることが示唆された。したがって、酵素の活
性中心が金属イオンであると考えられる。また、エチレ
ンジアミン四酢酸では同じ金属プロテアーゼを阻害する
１，１０−フェナントロリンよりも残存活性が高かっ
た。以下の理論に拘束されるわけではないが、これはエ
チレンジアミン四酢酸がプロテアーゼの立体構造を形成
している金属イオンに対してキレート剤として働いてい
るのではないかと考えられる。
【００４５】実施例９ プロテアーゼの基質特異性 水に対して可溶な基質タンパク質として、カゼイン、ヘ
モグロビン、アルブミン、ゼラチンを用い、水に対して
難溶あるいは不溶な基質タンパク質であるケラチンのう
ちの２種（人の毛髪由来、牛のひづめ由来）、エラスチ
ン、コラーゲンを用いて、フェノール試薬法によってタ
ンパク質分解活性を測定した。その結果は、第３表に示
される通りであった。
モグロビン、アルブミン、ゼラチンを用い、水に対して
難溶あるいは不溶な基質タンパク質であるケラチンのう
ちの２種（人の毛髪由来、牛のひづめ由来）、エラスチ
ン、コラーゲンを用いて、フェノール試薬法によってタ
ンパク質分解活性を測定した。その結果は、第３表に示
される通りであった。
【００４６】
【表３】
【００４７】本発明による酵素の基質特異性は、低温に
おいて、カゼインが一番大きく、ゼラチン、アルブミ
ン、ヘモグロビンの順に小さくなる。また、不溶性な基
質の場合では人の毛髪由来のケラチンに基質特異性を示
す。
おいて、カゼインが一番大きく、ゼラチン、アルブミ
ン、ヘモグロビンの順に小さくなる。また、不溶性な基
質の場合では人の毛髪由来のケラチンに基質特異性を示
す。
【００４８】実施例１０ Ｎ末端アミノ酸配列の決定 本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列を３６残基決定
した。結果は図７および配列番号１に示される通りであ
った。本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定
し、データバンク「Entrez」を用いて既知のアミノ酸配
列との相同性を調べたところ、金属プロテアーゼと約５
０％相同性があった。
した。結果は図７および配列番号１に示される通りであ
った。本発明による酵素のＮ末端アミノ酸配列を決定
し、データバンク「Entrez」を用いて既知のアミノ酸配
列との相同性を調べたところ、金属プロテアーゼと約５
０％相同性があった。
【００４９】実施例１１ 等電点電気泳動による等電点
の測定 等電点電気泳動(IEF isoelectric focuing) はPhast sy
stem（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行った。
電気泳動条件は定電圧のもとで２．５ｍＡ、１５℃、４
１０Ｖｈで行った。染色は２０％トリクロロ酢酸溶液で
固定し、脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）で洗
浄した。その結果は図８に示される通りであった。等電
点電気泳動の結果、本発明による酵素はほぼ単一のバン
ドとして染色され、等電点はｐＩ＝７．４と測定され
た。
の測定 等電点電気泳動(IEF isoelectric focuing) はPhast sy
stem（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行った。
電気泳動条件は定電圧のもとで２．５ｍＡ、１５℃、４
１０Ｖｈで行った。染色は２０％トリクロロ酢酸溶液で
固定し、脱色液（３０％メタノール、１０％酢酸）で洗
浄した。その結果は図８に示される通りであった。等電
点電気泳動の結果、本発明による酵素はほぼ単一のバン
ドとして染色され、等電点はｐＩ＝７．４と測定され
た。
【００５０】実施例１２ ＡＰ３８０１株に対する培養
温度の影響等 本発明による微生物を、培養温度を１０℃、２５℃、お
よび３７℃とした以外は、実施例１に記載される条件と
同様にして培養した。その後、液体培地の濁度を測定し
た。その結果は図９に示される通りであった。また、そ
れぞれの培養温度において得られた液体培地から実施例
２に記載される方法に従って本発明による酵素を精製
し、これらの酵素活性を測定した。結果は同様に図９に
示される通りであった。その結果、本発明による微生物
の最適培養温度は少なくとも３７℃以下が好ましく、特
に１０〜２５℃が好ましいことが明らかとなった。ま
た、微生物が生産する低温性酵素も少なくとも３７℃以
下で生産されることが明らかとなった。
温度の影響等 本発明による微生物を、培養温度を１０℃、２５℃、お
よび３７℃とした以外は、実施例１に記載される条件と
同様にして培養した。その後、液体培地の濁度を測定し
た。その結果は図９に示される通りであった。また、そ
れぞれの培養温度において得られた液体培地から実施例
２に記載される方法に従って本発明による酵素を精製
し、これらの酵素活性を測定した。結果は同様に図９に
示される通りであった。その結果、本発明による微生物
の最適培養温度は少なくとも３７℃以下が好ましく、特
に１０〜２５℃が好ましいことが明らかとなった。ま
た、微生物が生産する低温性酵素も少なくとも３７℃以
下で生産されることが明らかとなった。
【００５１】
配列番号：１ 配列の長さ：３６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端 起源 生物名：Serratia marcescens 株 名：ＡＰ３８０１株 配列 Ser Leu Asn Gly Lys Thr Asn Gly Trp Asp Ser Val Asn Asp Leu Leu 1 5 10 15 Asn Tyr His Asn Arg Gly Asx Gly Leu Thr Ile Asn Asn Lys Pro Ser 20 25 30 Phe Asp Ile Ala 35
【図１】本発明による酵素の精製の結果を示した図であ
る。
る。
【図２】本発明による酵素の分子量を測定するための検
量線を示した図である。
量線を示した図である。
【図３】本発明による酵素の酵素反応へのｐＨの影響を
示した図である。白四角形はＭＥＳ（ｐＨ５．５〜６．
５）、白丸はＭＯＰＳ（ｐＨ６．５〜８．０）、白三角
形はＴＡＰＳ（ｐＨ８．０〜９．０）、黒丸はＣＨＥＳ
（ｐＨ９．０〜１０．０）、黒四角形はＣＡＰＳ（ｐＨ
１０．０〜１１．０）、黒三角形はグリシン−ＮａＯＨ
（ｐＨ１１．０〜１３．０）を表す。
示した図である。白四角形はＭＥＳ（ｐＨ５．５〜６．
５）、白丸はＭＯＰＳ（ｐＨ６．５〜８．０）、白三角
形はＴＡＰＳ（ｐＨ８．０〜９．０）、黒丸はＣＨＥＳ
（ｐＨ９．０〜１０．０）、黒四角形はＣＡＰＳ（ｐＨ
１０．０〜１１．０）、黒三角形はグリシン−ＮａＯＨ
（ｐＨ１１．０〜１３．０）を表す。
【図４】本発明による酵素のｐＨ安定性を示した図であ
る。白丸はＭＥＳ、黒四角形はＭＯＰＳ、黒三角形はＴ
ＡＰＳ、黒丸はＣＨＥＳ、白四角形はＣＡＰＳ、白三角
形はグリシン−ＮａＯＨを表す。
る。白丸はＭＥＳ、黒四角形はＭＯＰＳ、黒三角形はＴ
ＡＰＳ、黒丸はＣＨＥＳ、白四角形はＣＡＰＳ、白三角
形はグリシン−ＮａＯＨを表す。
【図５】本発明による酵素の酵素反応への温度の影響を
示した図である。白丸はｐＨ１０．５、黒四角形はｐＨ
８．０の場合である。
示した図である。白丸はｐＨ１０．５、黒四角形はｐＨ
８．０の場合である。
【図６】本発明による酵素の温度安定性を示した図であ
る。白丸は１０℃、白四角形は２０℃、白三角形は３０
℃、黒丸は４０℃、黒四角形は５０℃、黒三角形は６０
℃を示す。
る。白丸は１０℃、白四角形は２０℃、白三角形は３０
℃、黒丸は４０℃、黒四角形は５０℃、黒三角形は６０
℃を示す。
【図７】本発明による酵素のＮ末端アミノ酸残基を示
す。
す。
【図８】等電点電気泳動の結果を示した図である。
【図９】ＡＰ３８０１株の生育に対する培養温度の影響
およびその結果生じたプロテアーゼの活性を示した図で
ある。
およびその結果生じたプロテアーゼの活性を示した図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:43） (71)出願人 592043805 ＯＮＥ ＰＲＯＣＴＥＲ ＆ ＧＡＮＢＬ Ｅ ＰＬＡＺＡ，ＣＩＮＣＩＮＮＡＴＩ, ＯＨＩＯ，ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 エー．ケイ．エム．カムルール、ハサーン 兵庫県神戸市東灘区魚崎南５−４−10− 403 (72)発明者 民 谷 栄 一 石川県能美郡辰口町字大口１番地１ Ａ− １−15
Claims (17)
- 【請求項１】２０℃において、その最大活性の約６０％
以上の活性を有する、プロテアーゼ。 - 【請求項２】下記の理化学的性質を有する、プロテアー
ゼ。 （ａ）作用および基質特異性：カゼイン、ゼラチン、ア
ルブミン、およびヘモグロビンに作用してこれらを特異
的に分解する。基質特異性は、カゼイン、ゼラチン、ア
ルブミン、ヘモグロビンの順で小さくなる。 （ｂ）至適作用ｐＨ：７．５〜８．０である。 （ｃ）ｐＨ安定性：２０℃、１時間保持の条件下でｐＨ
５．５〜１０．５において安定である。 - 【請求項３】下記の理化学的性質を更に有する、請求項
２に記載のプロテアーゼ。 （ｄ）至適作用温度：ｐＨ１０．５の条件下で２０℃、
ｐＨ８．０の条件下で４０℃である。 （ｅ）温度安定性：ｐＨ１０．５、１時間保持の条件下
で、１０〜３０℃の温度ではほとんど失活せず、４０℃
で約３０％失活し、５０℃で完全に失活する。 （ｆ）酵素活性：２０℃において、最大活性の約６０％
以上の活性を有する。 - 【請求項４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約５８ｋ
Ｄａである、請求項２または３に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項５】等電点電気泳動法による等電点が約７．４
である、請求項２〜４いずれか一項に記載のプロテアー
ゼ。 - 【請求項６】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部を含んでなるタンパク質からなる、請求項１〜
５いずれか一項に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項７】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部をＮ末端に含んでなるタンパク質からなる、請
求項１〜５いずれか一項に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項８】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部を含んでなるタンパク質からなる、プロテアー
ゼ。 - 【請求項９】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部ま
たは全部をＮ末端に含んでなるタンパク質からなる、プ
ロテアーゼ。 - 【請求項１０】請求項１〜９いずれか一項に記載のプロ
テアーゼ産生能を有する、Serratia属に属する微生物。 - 【請求項１１】１０〜２５℃において良好に生育でき
る、請求項１０に記載の微生物。 - 【請求項１２】ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０１の寄託番号の
もと寄託された、請求項１０または１１に記載の微生
物。 - 【請求項１３】ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０１の寄託番号の
もと寄託された微生物。 - 【請求項１４】請求項１０〜１３いずれか一項に記載の
微生物を培養し、その培養物から請求項１〜９いずれか
一項に記載のプロテアーゼを採取することを含んでな
る、請求項１〜９いずれか一項に記載のプロテアーゼの
製造法。 - 【請求項１５】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部
または全部からなるペプチド。 - 【請求項１６】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部
または全部を含んでなるタンパク質。 - 【請求項１７】配列番号１に記載のアミノ酸配列の一部
または全部をそのＮ末端に含んでなる、タンパク質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2961696A JPH09224666A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | 低温活性プロテアーゼｃｐ５８および低温性細菌 |
| ARP970100599A AR005831A1 (es) | 1996-02-16 | 1997-02-14 | Proteasa cp-58 que tiene su maxima actividad a 20°c, microorganismo del genero serratia genus, que la produce, metodo de prepararla y peptido yproteinas contenidas en dicha proteasa. |
| PCT/US1997/002437 WO1997030172A1 (en) | 1996-02-16 | 1997-02-14 | Cold-active protease cp-58 and psychrotrophic bacteria |
| EP97905991A EP1007722A4 (en) | 1996-02-16 | 1997-02-14 | CP-58 COLD ACTIVE PROTEASE AND PSYCHROTROPHIC BACTERIA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2961696A JPH09224666A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | 低温活性プロテアーゼｃｐ５８および低温性細菌 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09224666A true JPH09224666A (ja) | 1997-09-02 |
Family
ID=12281018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2961696A Withdrawn JPH09224666A (ja) | 1996-02-16 | 1996-02-16 | 低温活性プロテアーゼｃｐ５８および低温性細菌 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1007722A4 (ja) |
| JP (1) | JPH09224666A (ja) |
| AR (1) | AR005831A1 (ja) |
| WO (1) | WO1997030172A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3464199A (en) * | 1999-04-01 | 2000-10-23 | Procter & Gamble Company, The | A detergent composition containing a metallo-protease |
| EP3275990A1 (en) | 2016-07-28 | 2018-01-31 | The Procter and Gamble Company | Process for reblending a first liquid detergent composition into a second liquid detergent composition |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61282075A (ja) * | 1985-06-07 | 1986-12-12 | Teruhiko Beppu | 新規セラチアプロテア−ゼｓｓｐ−１ |
| JPH09201195A (ja) * | 1996-01-26 | 1997-08-05 | Procter & Gamble Co:The | 低温活性プロテアーゼｃｐ７０ |
-
1996
- 1996-02-16 JP JP2961696A patent/JPH09224666A/ja not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-02-14 AR ARP970100599A patent/AR005831A1/es unknown
- 1997-02-14 EP EP97905991A patent/EP1007722A4/en not_active Withdrawn
- 1997-02-14 WO PCT/US1997/002437 patent/WO1997030172A1/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997030172A1 (en) | 1997-08-21 |
| EP1007722A1 (en) | 2000-06-14 |
| EP1007722A4 (en) | 2002-12-04 |
| AR005831A1 (es) | 1999-07-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20030506 |