JP2908933B2

JP2908933B2 - アルカリプロテアーゼｋ−１６ｍ

Info

Publication number: JP2908933B2
Application number: JP4141032A
Authority: JP
Inventors: 徹小林; 佳宏袴田; 潤人見; 修次川合; 進伊藤
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1992-05-07
Filing date: 1992-05-07
Publication date: 1999-06-23
Anticipated expiration: 2014-06-23
Also published as: JPH05308967A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアルカリプロテアーゼＫ
−１６Ｍに関し、更に詳細には界面活性剤に対して極め
て優れた安定性を有し、洗浄剤配合酵素として有用なア
ルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、洗浄剤配合用のアルカリプロ
テアーゼは、種々報告され、すでに種々の洗剤に配合さ
れている。

【０００３】ところで、プロテアーゼが洗剤中に有効に
配合されるためには、単にアルカリ性条件下において作
用するというだけでは不十分であり、洗剤に配合される
界面活性剤中で安定であること、および衣類の汚れを分
解しうる能力、すなわち洗浄力を有することが要求され
る。

【０００４】しかしながら、このような洗剤に配合され
るプロテアーゼに要求される両特性を同時に満足させる
アルカリプロテアーゼは未だ提示されていないのが実情
である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記実情を鑑み、本発
明者らは先に、新たなアルカリプロテアーゼ生産菌を取
得すべく、日本全国の土壌を採取し探索した。その結
果、栃木県芳賀郡の土壌より分離されたバチルス属の一
菌株が、洗浄剤配合系において優れた洗浄力を有し、し
かも界面活性剤中で極めて高い安定性を有するアルカリ
プロテアーゼを生産することを見出し、特許出願を行っ
た（特願平３-３３１１６号及び特願平３-３３１１７
号）。

【０００６】上記微生物の産生するアルカリプロテアー
ゼＫ−１６は、実際の使用に十分な安定性と洗浄力を
有する優れたものであるが、更に、より優れた界面活性
剤中での安定性と、より優れた洗浄剤配合酵素としての
機能を有するアルカリプロテアーゼを探求することは極
めて意義のあることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記アル
カリプロテアーゼＫ−１６について種々研究を行なっ
た結果、当該酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、アルカリプロテアーゼ活性を有する少なくと
も３成分から構成されていることを見出した。そして、
これら成分を分離、精製すべく、検討を重ねた結果、種
々のカラムクロマトグラフィーを用いることにより、電
気泳動的に均一な成分としてアルカリプロテアーゼＫ−
１６Ｍを取得することに成功し、本発明を完成するに至
った。

【０００８】すなわち本発明は、下記の特性を有する新
規なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍを提供するもので
ある。

【０００９】（１）作用単純蛋白質及び複合蛋白質を加水分解し、オリゴペプチ
ド又はアミノ酸を生成する。（２）基質特異性カゼイン、ヘモグロビン等の水可溶性蛋白質ならびにケ
ラチン、エラスチン等の水不溶性蛋白質に対して良好な
活性を有する。合成基質であるＮα−ベンゾイルチロシ
ンエチルエステル、Ｎ−アセチルチロシンエチルエステ
ルには作用するが、Ｎα−ベンゾイルアルギニンエチル
エステル、Ｎ−トルエンスルフォニルアルギニンメテル
エステルには作用しない。（３）至適ｐＨカゼインを基質とし、種々の緩衝液中で４０℃、１０分
間反応を行った場合、至適ｐＨは１１.０〜１２.３であ
る。さらにｐＨ６.０〜１２.８で最大活性の５０％以
上の活性を有する。

【００１０】（４）ｐＨ安定性種々の緩衝液中にＣａ²⁺を加え、５５℃、１０分間処理
した場合、ｐＨ５.０〜１２.０の範囲で極めて安定であ
る。（５）至適温度カゼインを基質とし、ｐＨ１０.０で反応を行った場
合、至適温度は５５℃である。（６）耐熱性ｐＨ９.０、５０℃にて１０分間処理した場合、または
Ｃａ²⁺を加え６０℃にて１０分間処理した場合、９０％
以上の残存活性を有する。

【００１１】（７）分子量２８,０００±１,０００（ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る）。（８）金属イオンの影響カゼインを基質とした場合、Ｈｇ²⁺で活性が阻害され
る。また、Ｃａ²⁺で熱安定性及びｐＨ安定性が増大す
る。（９）阻害剤の影響エチレンジアミン四酢酸、ｐ−クロロマーキュリー安息
香酸、アンチバインで活性が阻害されない。フェニルメ
タンスルホニルフルオリド、キモスタチンによって活性
が阻害される。（１０）界面活性剤の影響直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキ
シエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
リウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルカ
ンスルホン酸ナトリウム、α−スルホ脂肪酸エステル等
の界面活性剤が高濃度に存在しても、極めて安定であ
る。

【００１２】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍ
は、例えばバチルス属に属するバチルス・エスピーＫＳ
Ｍ−Ｋ１６（Bacillus ｓｐ. ＫＳＭ−Ｋ１６；微工研
条寄第３３７６号）を適当な培地に接種し、常法に従っ
て培養を行った後、その培養上清液を適当な分離、精製
処理に付すことにより得ることができる。なお、この
バチルス・エスピーＫＳＭ−Ｋ１６の菌学的性質および
その取得方法は、特願平３−３３１１６号、同３−３
３１１７号等に記載されている。

【００１３】培養に使用される培地としては、通常の微
生物の培養に用いられ、本菌株に利用可能なものであれ
ば何れをも使用することができるが、該培地中には資化
しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくこと
が好ましい。

【００１４】培地中に含有せしめる炭素源及び窒素源に
ついては特に制限はないが、窒素源の好ましい例として
は、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イ
ワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿
実油粕、カルチベーター、アミフレックス及びアジプロ
ン、ゼスト等が挙げられる。

【００１５】また、炭素源としては、資化しうる炭素
源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗糖、麦芽
糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトー
ル、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転化糖
等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられ
る。更に、その他、リン酸、Ｍｇ²⁺、Ｃａ²⁺、Ｍ
ｎ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎａ⁺ 、Ｋ⁺等の無機塩や、必
要であれば無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加す
ることもできる。

【００１６】斯して得られた培養物中からの目的物質で
あるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの採取及び精製
は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うこと
ができる。

【００１７】すなわち、培養物を遠心分離または瀘過等
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養瀘液
から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、
溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、インプロピル
アルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させ
たり、また、限外瀘過（例えばダイアフローメンブレン
フィルター；アミコン社製）により濃縮させたり、ある
いは、セファデックスＧ−２５、ポリビニルピロリドン
等により濃縮して、粗酵素としてアルカリプロテアーゼ
Ｋ−１６を得ることができる。

【００１８】上記分離手段のうち、塩析法では例えば硫
安（３０-７０％飽和画分）中で、沈澱法では、例えば
７５％エタノール中でアルカリプロテアーゼＫ−１６を
沈澱させた後、瀘過あるいは遠心分離、脱塩することに
よってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。こ
こで採用しうる脱塩の方法としては、透析または、セフ
ァデックスＧ−２５等を用いるゲル瀘過法等の一般的方
法が用いられる。

【００１９】さらに、粗酵素であるアルカリプロテアー
ゼＫ−１６からアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍを精
製、採取するには、例えば、ヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ
−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セル
ロースやＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラ
フィー及びセファデックスやバイオゲルのような分子篩
ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製す
ればよい。望ましくは、ＤＥＡＥ−バイオゲル、ＣＭ
−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びヒ
ドロキシアパタイト等の吸着クロマトグラフィーを適宜
組合せて精製することにより良好な結果を得ることがで
きる。

【００２０】斯して得られた本発明のアルカリプロテア
ーゼＫ−１６Ｍは、以下に示すような酵素学的性質を有
する。尚、以下において、酵素活性の測定は次の如く
して行った。

【００２１】（酵素活性測定法）カゼイン（HAMMARST
EN；メルク社製）１％（w/v）を含む５０ｍＭホウ酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）１ｍｌを４０℃で５
分間保温した後、０.１ｍｌの酵素液を加え、反応を開
始した。４０℃で１０分間反応させた後、反応停止液
（０.１２３Ｍトリクロロ酢酸−０.２４６Ｍ酢酸ナト
リウム−０.３６９Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、室温にて約
２０分間放置した。生成した沈澱物を瀘紙（Ｎｏ.２濾
紙；ワットマン社製）により除去し、瀘液中の酸可溶性
蛋白分解物をフォーリン・ローリー法により比色定量し
た。尚、酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条件下におい
て、１分間に１μmolのチロシンに相当する酸可溶性蛋
白分解物を遊離する酵素量とした。

【００２２】（１）作用単純蛋白質及び複合蛋白質を加水分解し、オリゴペプチ
ド又はアミノ酸を生成する。

【００２３】（２）基質特異性アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの各種基質に対する特
異性を、他の市販プロテアーゼと比較した。用いた基
質は、カゼイン、ヘモグロビン、獣毛ケラチン、エラス
チン、卵黄およびヒト由来α−ケラチンで、これらに対
する分解活性を測定した。すなわち、５０ｍＭホウ酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）に各基質を１％（α
−ケラチンは、０.２５％）加え、各酵素液０.０３７〜
０.０４３Ｕ（エラスチンの場合は、０.１８５〜０.２
１５Ｕ）を添加し、４０℃で１０分間反応を行った。
各酵素のカゼインに対する活性を１００とし、それぞれ
の基質に対する相対活性を表１に示した。

【００２４】

【００２５】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｍは、代表的なバチルス属のアルカリプロテアーゼに比
べ、特に、難溶性蛋白（獣毛ケラチン、α−ケラチン、
エラスチン）に対し、優れた分解作用を示した。

【００２６】（３）至適ｐＨ１％のカゼインを含む５０ｍＭの各種ｐＨ緩衝液１ｍｌ
にアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍを０.０５７Ｕ加
え、反応を行った。図１に示すように、最適ｐＨでの活
性を１００とした各ｐＨでの活性を相対値で表わした。
この結果からアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの至適
ｐＨは、１１.０〜１２.３であり、さらにｐＨ６.０以
上からｐＨ１２.８までの広範囲に渡り、５０％以上の
活性を有するものであった。尚、使用した各種緩衝
液、及びそのｐＨ範囲は次のとおりであった。

【００２７】（使用緩衝液およびそのｐＨ範囲）酢酸緩衝液ｐＨ４.１〜６.２リン酸緩衝液ｐＨ６.３〜８.５炭酸緩衝液ｐＨ８.９〜１１.０リン酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１１.０〜１２.３ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１２.０〜１３.２

【００２８】（４）ＰＨ安定性（３）で用いた各種緩衝液（２０ｍＭ）中に２ｍＭＣ
ａＣｌ₂を添加した系及び無添加の系をそれぞれ調製
し、これに０.２９ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｍを加え、５５℃で１０分間放置した。この処理液を
５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１
０倍に希釈し、酵素活性を測定した。処理前の酵素活
性を１００とした各ｐＨでの相対活性を図２に示した。

【００２９】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｍは、上記条件下で、ＣａＣｌ₂無添加の場合、ｐＨ６
〜１１の間で、２ｍＭＣａＣｌ₂添加の場合、ｐＨ５〜
１２の間で極めて安定であった。

【００３０】（５）至適温度０.０３２ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍを用
い、３０℃〜８０℃の各温度において、５ｍＭＣａＣ
ｌ₂を添加した系及び無添加の系を調製し、温度以外は
標準反応条件と同様に反応を行った。標準反応条件に
おける活性を１００とした各温度での相対活性を図３に
示した。アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの至適反応
温度は、ＣａＣｌ₂無添加系の場合５５℃であり、５ｍ
ＭＣａＣｌ₂添加系では７０℃であった。

【００３１】（６）耐熱性２０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.０）中に５
ｍＭＣａＣｌ₂を添加した系及び無添加の系を調製し、
３０〜７０℃の各温度で５分間保温した。次いで、
０.３８ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍを加え、
１０分間熱処理を行った。氷水中で急冷した後、５０
ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で２倍に
希釈した酸素液を用いて残存活性を測定した。３０℃
で処理した酵素活性を１００とした各温度処理での相対
活性を図４に示した。

【００３２】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍは、Ｃａ
Ｃｌ₂無添加系では５０℃まで、また５ｍＭＣａＣｌ₂
添加系では６０℃まで９０％以上の活性が維持された。
この結果、本酵素はＣａ²⁺により安定化することが判
った。

【００３３】（７）分子量アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの分子量を１２．５％
アクリルアミドを用いたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定し
た。分子量マーカーには、エレクトロフォレシス・キァ
リブレイションキット（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ
ｓＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎｋｉｔ）［ホスホリラー
ゼｂ（分子量９４，０００）、牛血清アルブミン（分子
量６７，０００）、卵白アルブミン（分子量４３，００
０）、カルボニックアンヒドロラーゼ（分子量３０，０
００）、大豆トリプシンインヒビター（分子量２０，１
００）およびα−ラクトアルブミン（分子量１４，４０
０）の混合試料；ファルマシア社製］を用いた。この方
法により、アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの分子量は
２８，０００±１，０００と決定された。また、ゲルロ
過法で測定した分子量は、１５，０００±１，０００で
あった。

【００３４】（８）金属イオンの影響各種金属イオンのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍに及
ぼす影響を調べた。２０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ９.０）に各種金属塩を１ｍＭとなるように添加
し、２.０Ｕの酵素を加えて３０℃で２０分間放置した
後、５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）
で１０倍に希釈した酵素液を用いて活性を測定した。
金属塩無添加で同様に処理したもの（対照）の活性を１
００とし、各種金属塩を添加した場合の相対活性を表２
に示した。

【００３５】

【００３６】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｍは、Ｈｇ²⁺により５０％程度阻害されることが判っ
た。また、その他の金属イオンに対しては、充分に安
定であった。

【００３７】（９）各種化合物の影響各種化合物のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍに及ぼす
影響を調べた。すなわち、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７.０）に各種化合物を所定濃度になるように添加し、
２.０ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍを加えた。
３０℃で２０分間放置した後、５０ｍＭホウ酸−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１０倍に希釈した酵素液
を用いて活性を測定した。化合物無添加で同様に処理
したもの（対照）の活性を１００とし、各化合物を添加
した場合の相対活性を表３に示した。

【００３８】

【００３９】＊阻害剤略号ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸ＤＴＴ：ジチオスレイトールＮＥＭ：Ｎ−エチルマレイミドＨＮＢ：２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミ
ドＤＮＴＢ：５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香
酸ＰＣＭＢ：ｐ−クロロマーキュリー安息香酸ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルホニルフルオリド

【００４０】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍは、フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモス
タチンで阻害されることから、活性発現にセリンが関与
するアルカリセリンプロテアーゼであることが判った。
また、他の化合物に対しては、極めて安定であった。

【００４１】（１０）界面活性剤の影響各種界面活性剤のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍに及
ぼす影響を調べた。すなわち、５％（w/v）の界面活性
剤及び１０％（v/v）エタノールを含む０.１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）に２.２Ｕのアルカリプロテ
アーゼＫ−１６Ｍを加え、４０℃にて４時間放置した。
この処理液を５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
１０.０）で１０倍に希釈し、酵素活性を測定した。酵
素添加直後の活性を１００とし、残存活性をその相対値
として表４に示した。

【００４２】

【００４３】なお、具体的な界面活性剤は次の通りであ
る。

【化１】

【００４４】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍは、各種
界面活性剤が高濃度（５％）存在しても高い安定性を示
すものであった。また、市販の洗剤用アルカリプロテア
ーゼの１.０％（w/v）各種界面活性剤に対する安定性
と比較しても、本酵素は界面活性剤中で非常に安定であ
った。

【００４５】（１１）アミノの酸組成１００μｇのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍを６Ｎ塩
酸（０．０１％フェノール、４％チオグリコーム酸を含
む）中で１１０℃、２４〜７２時間加水分解し、アミノ
酸自動分析計により、アミノ酸の定量を行った。尚、ト
リプトファンの分析は、エデルホッフ（Ｅｄｅｌｈｏｃ
ｈ）の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６．１９４
８．（１９６７））また、システインの分析は、ヨシ
ダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）らの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．４１，７４５，（１９７７））により定
量した。得られた結果を表５に示した。

【００４６】

【００４７】* Horikoshi,K. Agric.Biol.Chem. 35, 14
07 (1971) ** Francis,S.b J.Biol.chem. 242, 5198 (1967) + Smith:E.L.b J.Biol.Chem. 243, 2184 (1968) ++ Kaneko,R.b J.Bacteriol. 171, 5232 (1989)

【００４８】上記から、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｍのアミノ酸組成を他のアルカリプロテアーゼのそれと
比較すると同一の組成のものはないことが判った。

【００４９】（１２）エステラーゼ活性Ｎα−ベンゾイルアルギニンエチルエステル（ＢＡＥ
Ｅ）、Ｎ−トルエンスルホニルアルギニンメチルエスチ
ル（ＴＡＭＥ）、Ｎα−ベンゾイルチロシンエチルエス
テル（ＢＴＥＥ）及びＮ−アセチルチロシンエチルエス
テル（ＡＴＥＥ）に対するアルカリプロテアーゼＫ−１
６Ｍの作用を調べた。０．５ｍＭＢＴＥＥおよび２ｍ
Ｍ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に１．８ＵのアルカリプロテアーゼＫ−
１６Ｍを加え、２５６ｎｍにおける吸光度（Ａ）の変化
を２分間測定し、反応初速度を求めた。その結果、ＢＴ
ＥＥに対するｋｍ値は２．１ｍＭ、Ｖｍａｘ値は１．０
Ａ_２５６／ｍｉｎであった。

【００５０】ＡＴＥＥの場合は、５０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ９．５）を用い、加えた酵素量は、０．９
Ｕ、２３７ｎｍにおける吸光度（Ａ）の変化を測定した
以外は、上記条件と同一であった。その結果、ＡＴＥＥ
に対するＫｍ値は、１．７ｍＭ、Ｖｍａｘ値は、０．３
３Ａ_２３７／ｍｉｎであった。尚、ＢＡＥＥ、ＴＡＭＥ
について上記反応条件を用いて活性測定を行ったが、吸
光度の変化は全く認められなかった。

【００５１】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。

【００５２】実施例１アルカリプロテアーゼＫ−１６の生産：バチルス・エス
ピーＫＳＭ−Ｋ１６（微工研条寄第３３７６号）株
を、下記の培地Ａに１白金耳接種し、３０℃で２４時間
好気的に振盪培養を行ない、種培養液を得た。次に、得
られた種培養液を、下記の培地Ｂへ２％（v/v）接種
し、３０℃で４８時間好気的に振盪培養を行い、アルカ
リプロテアーゼＫ−１６を含む培養液１ｌを得た。

【００５３】培地Ａ：グルコース２.０％（w/v）ポリペプトンＳ１.０〃酵母エキス０.０５〃リン酸一カリウム０.１〃硫酸マグネシウム・７水塩０.０２〃炭酸ナトリウム（別滅菌）１.０〃（ｐＨ無調整）

【００５４】培地Ｂ：グルコース２.０％（w/v）魚肉エキス１.０〃大豆粉１.０〃リン酸一カリウム０.１〃硫酸マグネシウム・７水塩０.０２〃（ｐＨ１０.０）

【００５５】実施例２アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの精製：（１）実施例１で得た培養液１ｌを遠心分離（１０,０
００rpm ：５分間）して菌体を除去し、その上清液を限
外瀘過膜（分画分子量５,０００）にて、濃縮し、凍結
乾燥した。得られた粉末１.５ｇをイオン交換水１５
ｍｌに溶解後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ
Ｃａ²⁺を含む、ｐＨ８.０）に対し一昼夜透析を行っ
た。次にあらかじめ１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（２
ｍＭＣａ²⁺を含む、ｐＨ８.０）にて平衡化しておいた
ＤＥＡＥ Bio-GelＡカラム（２.５×１６ｃｍ、バイオ
ラッド社製）へ得られた透析内液を吸着させ、同緩衝液
にて洗浄溶出を行った。洗浄溶出された非吸着蛋白部
分を集め（１５０ｍｌ）、限外瀘過（ＹＭ−５メンブレ
ン、アミコン社製）にて濃縮をおこなった。

【００５６】この濃縮液を、あらかじめ１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（２ｍＭＣａ²⁺を含む、ｐＨ８.０）に
て平衡化しておいたＣＭ Bio-GelＡカラム（２.５×１
６ｃｍ；バイオラッド社製）へ吸着させ、２５０ｍｌの
同緩衝液にて洗浄溶出後、３０ｍＭ塩化カリウムを含
む同緩衝液にて、０から３０ｍＭの塩化カリウム濃度勾
配溶出を行った（２２５ｍｌずつ）。さらに、同様に
３０ｍＭから１００ｍＭの塩化カリウム濃度勾配溶出を
行った（２２５ｍｌずつ）。５０ｍＭ以上の塩化カリ
ウムにて溶出されてくるアルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｍを含有する画分を集め（１７５ｍｌ）、限外瀘過にて
濃縮を行った。

【００５７】濃縮液（７．８ｍｌ）をあらかじめ１０ｍ
Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（２ｍＭＣａ^２＋を含む、ｐ
Ｈ９．５）にて平衡化しておいたＣＭＢｉｏ−Ｇｅｌ
Ａカラム（１．６×１６ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液に
て洗浄溶出後、１００ｍＭトリエタールアミンを含む
同緩衝液にて０から１００ｍＭのトリエタノールアミン
濃度勾配溶出を行った（１５０ｍｌずつ）。５０ｍＭ以
上のトリエタノールアミンにて溶出されてくるアルカリ
プロテアーゼＫ−１６Ｍを集め（１１０ｍｌ）、限外瀘
過にて濃縮し（６ｍｌ）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロー
ルを加え、使用時まで−２０℃にて保存した。

【００５８】以上の操作により、粗酵素粉末１.５ｇ
（総括性、７９,５６０Ｕ；総蛋白、９１８ｍｇ；比
活性、８６.７Ｕ／ｍｇ）より、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動並びにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にて均一なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍ（総活
性、２０,３３６Ｕ；精製蛋白質、１５９.４ｍｇ；比活
性、１２８Ｕ／ｍｇ）を収率２５.６％、精製倍率１.５
倍で得ることができた。また、本酵素の凍結乾燥標品よ
り求めた、Ｅ^1% ₂₈₀は９.１０であった。

【００５９】

【発明の効果】上述の如く、粗酵素アルカリプロテアー
ゼＫ−１６から均一に精製された本発明のアルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｍは、各種の界面活性剤中で安定であ
る。従って、本発明酵素は洗浄剤配合用酵素として極め
て優れたものであり、洗剤等に有利に利用することがで
きるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの至適ｐＨ
を示す図面。

【図２】アルカリプロテアーゼＫ−１６ＭのｐＨ安定
性試験の結果を示す図面。

【図３】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの至適温度
を示す図面。

【図４】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍの熱安定性
試験の結果を示す図面。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者伊藤進栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (56)参考文献特開平１−101884（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス属に属する微生物により産生さ
れるアルカリプロテアーゼＫ−１６を、吸着クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び分子篩ゲ
ルクロマトクラフィーを組み合わせた分別精製手段に付
すことにより得られ、下記の酵素学的性質を有する電気
泳動的に均一なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｍ（１）作用単純蛋白質及び複合蛋白を加水分解し、オリゴペプチド
又はアミノ酸を生成する。（２）基質特異性カゼイン、ヘモグロビン等の水可溶性蛋白質ならびにケ
ラチン、エラスチン等の水不溶性蛋白質に対して良好な
活性を有する。（３）至適ｐＨカゼインを基質とし、種々の緩衝液中で４０℃、１０分
間反応を行った場合、至適ｐＨは１１．０〜１２．３で
ある。さらに、ｐＨ６．０〜１２．８の範囲で最大活性
値の５０％以上の活性を有する。（４）ｐＨ安定性種々の緩衝液中にＣａ^２＋を加え、５５℃で１０分間処
理した場合、ｐＨ５．０〜１２．０の範囲で極めて安定
である。（５）至適温度カゼインを基質とし、ｐＨ１０．０で反応を行った場
合、至適温度は５５℃である。（６）耐熱性ｐＨ９．０、５０℃にて１０分間処理した場合、または
Ｃａ^２＋を加え６０℃にて１０分間処理した場合、９０
％以上の残存活性を有する。（７）分子量２８，０００±１，０００（ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る）（８）金属イオンの影響カゼインを基質とした場合、Ｈｇ^２＋で活性が阻害され
る。また、Ｃａ^２＋で熱安定性及びｐＨ安定性が増大す
る。（９）阻害剤の影響エチレンジアミン四酢酸、ｐ−クロロマーキュリー安息
香酸、アンチパインで活性が阻害されない。フェニルメ
タンスルホニルフルオリド、キモスタチンによって活性
が阻害される。（１０）界面活性剤の影響直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキ
シエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
リウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルカ
ンスルホン酸ナトリウム、α−スルホ脂肪酸エステル等
の界面活性剤が高濃度に存在しても、極めて安定であ
る。
【請求項２】バチルス属に属する微生物が、バチルス
・エスビー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＫＳＭ−Ｋ１
６である請求項第１項記載のアルカリプロテアーゼＫ−
１６Ｍ。