JP2525592B2 - カルボキシペプチダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents
カルボキシペプチダ−ゼおよびその製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はカルボキシペプチダーゼおよびその製造法に
関し、詳しくは75〜80℃に最適作用温度を示し、耐熱性
にすぐれたカルボキシペプチダーゼおよびその製造法に
関する。
関し、詳しくは75〜80℃に最適作用温度を示し、耐熱性
にすぐれたカルボキシペプチダーゼおよびその製造法に
関する。
カルボキシペプチダーゼは微生物界，動物界，植物界
から多数分離され、それぞれの構造，性質等が詳細に調
べられている。カルボキシペプチダーゼは、その触媒活
性の発現の違いによって、セリンカルボキシペプチダー
ゼ，メタロカルボキシペプチダーゼ，システィンカルボ
キシペプチダーゼに分類されている。
から多数分離され、それぞれの構造，性質等が詳細に調
べられている。カルボキシペプチダーゼは、その触媒活
性の発現の違いによって、セリンカルボキシペプチダー
ゼ，メタロカルボキシペプチダーゼ，システィンカルボ
キシペプチダーゼに分類されている。
しかし、これまでに報告されているカルボキシペプチ
ダーゼは常温生物から得られたものであり、好熱性細菌
をはじめとした好熱性生物からはまだ精製されていな
い。また、細菌から分離されたメタロカルボキシペプチ
ダーゼの報告は少ない。
ダーゼは常温生物から得られたものであり、好熱性細菌
をはじめとした好熱性生物からはまだ精製されていな
い。また、細菌から分離されたメタロカルボキシペプチ
ダーゼの報告は少ない。
そこで本発明者らは、耐熱性にすぐれたカルボキシペ
プチダーゼを生産する好熱性細菌を探索すべく研究を重
ねた結果、サーマス（Thermus）属に属する高度好熱性
細菌が目的とする酵素を生産することを見出し、本発明
を完成した。
プチダーゼを生産する好熱性細菌を探索すべく研究を重
ねた結果、サーマス（Thermus）属に属する高度好熱性
細菌が目的とする酵素を生産することを見出し、本発明
を完成した。
すなわち本発明は、下記の理化学的性質を有するカル
ボキシペプチダーゼ並びにサーマス属に属し、該カルボ
キシペプチダーゼを生産する能力のある高度好熱性細菌
を培養し、培養物中に該カルボキシペプチダーゼを生成
せしめ、これを採取することを特徴とするカルボキシペ
プチダーゼの製造法を提供するものである。
ボキシペプチダーゼ並びにサーマス属に属し、該カルボ
キシペプチダーゼを生産する能力のある高度好熱性細菌
を培養し、培養物中に該カルボキシペプチダーゼを生成
せしめ、これを採取することを特徴とするカルボキシペ
プチダーゼの製造法を提供するものである。
作用：ペプチドのＣ末端からアミノ酸を順次遊離す
る。
る。
基質特異性:C末端にProを含むCbz−Gly−Proを除い
たペプチドに対して広い特異性を示す。
たペプチドに対して広い特異性を示す。
最適作用pH:8.0〜9.0 最適作用温度:75〜80℃ 熱安定性：高い熱安定性を有し、80℃,20時間の加
熱で約75％、90℃,20時間の加熱で約40％の活性が残存
する。
熱で約75％、90℃,20時間の加熱で約40％の活性が残存
する。
金属イオンの影響:Ca2+,Co2+,Mg2+に対して安定で
あるが、Zn2+により失活する。
あるが、Zn2+により失活する。
分子量:62000（ゲル濾過法） 本発明のカルボキシペプチダーゼは、サーマス属に属
し、該酵素生産能を有する高度好熱性性細菌を栄養培地
に培養し、培養物中に該酵素を生成せしめ、これを採取
することによって製造することができる。
し、該酵素生産能を有する高度好熱性性細菌を栄養培地
に培養し、培養物中に該酵素を生成せしめ、これを採取
することによって製造することができる。
目的とするカルボキシペプチダーゼを生産する能力の
ある微生物としては、たとえばサーマス・アクアテイカ
ス（Thermus aquaticus）YT−１（ATCC 25104）があ
り、本菌のほかその自然的もしくは人工的変異株なども
該酵素生産能を有する限り本発明に使用することができ
る。
ある微生物としては、たとえばサーマス・アクアテイカ
ス（Thermus aquaticus）YT−１（ATCC 25104）があ
り、本菌のほかその自然的もしくは人工的変異株なども
該酵素生産能を有する限り本発明に使用することができ
る。
栄養培地は、上記微生物が十分に生育し、目的とする
酵素を生産しうるものであればよく、たとえばポリペプ
トン，酵母エキス，ホエイ蛋白質等の硫酸カルシウムな
どの無機塩類等を加えたものが好適に用いられる。
酵素を生産しうるものであればよく、たとえばポリペプ
トン，酵母エキス，ホエイ蛋白質等の硫酸カルシウムな
どの無機塩類等を加えたものが好適に用いられる。
培養は通常、通気攪拌培養法により行うことが好まし
く、必要に応じて消泡剤を添加する。一般に、培養は中
性付近のpHに調整し、40〜80℃の温度で12時間〜10日間
程度行い、カルボキシペプチダーゼを十分に生成せしめ
る。この酵素は主として菌体中に蓄積される。
く、必要に応じて消泡剤を添加する。一般に、培養は中
性付近のpHに調整し、40〜80℃の温度で12時間〜10日間
程度行い、カルボキシペプチダーゼを十分に生成せしめ
る。この酵素は主として菌体中に蓄積される。
培養物からのカルボキシペプチダーゼの採取は適宜既
知の手法を組合せて行えばよく、その１例を示すと、培
養終了後、培養物から遠心分離などによって菌体を集
め、必要により凍結保存する。菌体を破砕処理したのち
遠心分離して得た上清液を適当な緩衝液で透析して菌体
抽出粗酵素液を得る。
知の手法を組合せて行えばよく、その１例を示すと、培
養終了後、培養物から遠心分離などによって菌体を集
め、必要により凍結保存する。菌体を破砕処理したのち
遠心分離して得た上清液を適当な緩衝液で透析して菌体
抽出粗酵素液を得る。
次いで、粗酵素液を硫安塩析，カラムクロマトグラフ
ィー，ゲル濾過，電気泳動などの酵素精製に用いられる
通常の操作を適宜組合せることによって精製されたカル
ボキシペプチダーゼを得ることができる。
ィー，ゲル濾過，電気泳動などの酵素精製に用いられる
通常の操作を適宜組合せることによって精製されたカル
ボキシペプチダーゼを得ることができる。
次に、本発明の酵素の性質を以下に示す。なお、酵素
活性の測定は以下の方法で行った。
活性の測定は以下の方法で行った。
１） 一般の合成ペプチドに対する活性の測定 一般の合成ペプチドに対する酵素活性の測定は、Math
esonら（Can.J.Biochem.,42,95,1864）の方法に準じて
行い、酵素作用によって生じたアミノ酸などをニンヒド
リンと反応させて比色定量した。実際に、緩衝液に溶解
した1mMの各種プチド溶液0.1mlを酵素反応温度とした後
に、酵素溶液0.1mlをそれぞれ加えて一定時間反応させ
た後,0.1M酢酸溶液0.1mlを加えて反応を停止させた。反
応停止溶液に蒸留水0.7mlを加えて1mlとした後に、0.2M
クエン酸緩衝液（pH5.0）0.5mlとニンヒドリン試薬1.2m
lを加え攪拌混合後、沸騰水浴中で7.5分間加熱を行っ
た。その後、速かに氷水中で十分に冷却した後、60％エ
タノール2.5mlで希釈し、室温で570nmにおける吸光値を
分光高度計で測定した。また、分析内容によっては、酵
素反応時の基質溶液，酵素溶液，蒸留水または緩衝液の
割合を変えて行った。酵素活性の単位は、精製工程中は
pH9.0,80℃，その他はpH8.5,70℃において酵素溶液1ml
が１分間に生成するニンヒドリン陽性物質をロイシン量
に換算し、１μＭにロイシンに相当するニンヒドリン陽
性物質を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
esonら（Can.J.Biochem.,42,95,1864）の方法に準じて
行い、酵素作用によって生じたアミノ酸などをニンヒド
リンと反応させて比色定量した。実際に、緩衝液に溶解
した1mMの各種プチド溶液0.1mlを酵素反応温度とした後
に、酵素溶液0.1mlをそれぞれ加えて一定時間反応させ
た後,0.1M酢酸溶液0.1mlを加えて反応を停止させた。反
応停止溶液に蒸留水0.7mlを加えて1mlとした後に、0.2M
クエン酸緩衝液（pH5.0）0.5mlとニンヒドリン試薬1.2m
lを加え攪拌混合後、沸騰水浴中で7.5分間加熱を行っ
た。その後、速かに氷水中で十分に冷却した後、60％エ
タノール2.5mlで希釈し、室温で570nmにおける吸光値を
分光高度計で測定した。また、分析内容によっては、酵
素反応時の基質溶液，酵素溶液，蒸留水または緩衝液の
割合を変えて行った。酵素活性の単位は、精製工程中は
pH9.0,80℃，その他はpH8.5,70℃において酵素溶液1ml
が１分間に生成するニンヒドリン陽性物質をロイシン量
に換算し、１μＭにロイシンに相当するニンヒドリン陽
性物質を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
２） プロリン残基を含むペプチドに対する活性の測定 プロリン残基を含むペプチドに対する酵素活性の測定
は、YaronとMlyner（Biochem.Biophys.Res.Commun.,32,
658,1968）の方法に準じて行い、酵素作用によって生じ
たプロリンをニンヒドリンを反応させて比色定量した。
実際には、緩衝溶液に溶解した1mMの各種ペプチド溶液
0.1mlを酵素反応温度とした後に、酵素溶液0.1mlをそれ
ぞれ加えて反応を行った。反応条件は通常pH8.5で70℃,
30分間で行った。反応停止は0.1M酢酸溶液0.1mlを加え
て行い、さらに蒸留水を0.7ml加え全体で1mlとした。そ
の後、氷酢酸2.5mlとニンヒドリン試薬2.5mlを加えて攪
拌混合してから沸騰水浴中で30分間加熱を行った。加熱
終了後は氷水中で十分に冷却してから室温に戻して480n
mにおける吸光値を分光光度計で測定した。酵素活性の
単位は、通常pH8.5,7.5℃において酵素溶液1mlが１分間
に生成するプロリン量を算出し、１μＭのプロリンを生
成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
は、YaronとMlyner（Biochem.Biophys.Res.Commun.,32,
658,1968）の方法に準じて行い、酵素作用によって生じ
たプロリンをニンヒドリンを反応させて比色定量した。
実際には、緩衝溶液に溶解した1mMの各種ペプチド溶液
0.1mlを酵素反応温度とした後に、酵素溶液0.1mlをそれ
ぞれ加えて反応を行った。反応条件は通常pH8.5で70℃,
30分間で行った。反応停止は0.1M酢酸溶液0.1mlを加え
て行い、さらに蒸留水を0.7ml加え全体で1mlとした。そ
の後、氷酢酸2.5mlとニンヒドリン試薬2.5mlを加えて攪
拌混合してから沸騰水浴中で30分間加熱を行った。加熱
終了後は氷水中で十分に冷却してから室温に戻して480n
mにおける吸光値を分光光度計で測定した。酵素活性の
単位は、通常pH8.5,7.5℃において酵素溶液1mlが１分間
に生成するプロリン量を算出し、１μＭのプロリンを生
成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
以上の２種類の方法を用いて測定し、酵素の比加勢は
酵素溶液中の蛋白質1mg当りの活性単位で表わした。
酵素溶液中の蛋白質1mg当りの活性単位で表わした。
１） 分子量 本酵素の分子量はセファデックスＧ−200によるゲル
濾過法で求めた。精製酵素および標準蛋白質の溶出位置
と分子量の関係を第１図に示した。この結果、本酵素の
分子量は62,000と推定された。
濾過法で求めた。精製酵素および標準蛋白質の溶出位置
と分子量の関係を第１図に示した。この結果、本酵素の
分子量は62,000と推定された。
２） アミノ酸組成 本酵素のトリプトファンを除いたアミノ酸分析の結果
と分子量62,000とした場合の計算上の残基数を第１表に
示した。構成するアミノ酸組成はGlu（ｎ）,Gly,Ser,Al
aの含量が比較的多くCysは含まなかった。
と分子量62,000とした場合の計算上の残基数を第１表に
示した。構成するアミノ酸組成はGlu（ｎ）,Gly,Ser,Al
aの含量が比較的多くCysは含まなかった。
３） 最適作用pH 本酵素の最適作用pHはpH5.0から10.0の範囲で、カル
ボベンゾキシ（Cbz）−Phe−Tyrを基質として70℃,30分
間の反応条件で測定した。緩衝液は室温で各pHに調製し
た0.5Mクエン酸塩緩衝液（pH5〜６）,0.05Mリン酸塩緩
衝液（pH6〜８）,0.05M Tris-HCl緩衝液（pH8〜９）お
よび0.05M H3BO4・KCl-NaOH緩衝液（pH9〜10）を使用し
た。結果は第２図に示した。最適作用pHは8.0から9.0の
範囲であった。pH9.5よりアルカリ性側,pH7より酸性側
では相対的活性は低下した。
ボベンゾキシ（Cbz）−Phe−Tyrを基質として70℃,30分
間の反応条件で測定した。緩衝液は室温で各pHに調製し
た0.5Mクエン酸塩緩衝液（pH5〜６）,0.05Mリン酸塩緩
衝液（pH6〜８）,0.05M Tris-HCl緩衝液（pH8〜９）お
よび0.05M H3BO4・KCl-NaOH緩衝液（pH9〜10）を使用し
た。結果は第２図に示した。最適作用pHは8.0から9.0の
範囲であった。pH9.5よりアルカリ性側,pH7より酸性側
では相対的活性は低下した。
４） 最適作用温度 精製酵素の最適作用温度は30℃から95℃の温度で、Cb
z-Phe-Tyrを基質としてpH8.5 0.05M Tris-HCl緩衝液を
用いて30分間の反応で測定した。結果は第３図に示し
た。本酵素は75℃から80℃に最適作用温度を示し、85℃
では相対的活性で約95％,95℃でも約85％と非常に高温
度でも活性を有した。低い反応温度での活性は、60℃で
は約75％,50℃では約55％,30℃では約20％であった。
z-Phe-Tyrを基質としてpH8.5 0.05M Tris-HCl緩衝液を
用いて30分間の反応で測定した。結果は第３図に示し
た。本酵素は75℃から80℃に最適作用温度を示し、85℃
では相対的活性で約95％,95℃でも約85％と非常に高温
度でも活性を有した。低い反応温度での活性は、60℃で
は約75％,50℃では約55％,30℃では約20％であった。
５） 熱安定性 酵素活性の熱安定性は菌体抽出粗酵素液と精製酵素で
測定した。酵素の加熱処理は、pH7.2 0.05M Tris-HCl緩
衝液を用いて80℃から95℃の範囲で20時間行い、加熱後
に残存する活性はpH8.5でCbz-Tyrを基質として70℃,30
分間の反応で測定し、それぞれの未加熱の酵素活性を基
準として相対的活性値を示した。加熱時の蛋白質濃度は
精製酵素は10μg/mlで行い、菌体抽出粗酵素液は未加熱
時に精製酵素と同じ活性を有する濃度で行った。得られ
た結果を第図に示した。精製酵素は80℃,20時間の加熱
で約75％、90℃,20時間の加熱でも約40％の活性が残存
した。また、菌体抽出粗酵素液は精製酵素より更に高い
熱安定性を示し、80℃,20時間の加熱で約85％、90℃,20
時間の加熱で約65％の活性が残存した。
測定した。酵素の加熱処理は、pH7.2 0.05M Tris-HCl緩
衝液を用いて80℃から95℃の範囲で20時間行い、加熱後
に残存する活性はpH8.5でCbz-Tyrを基質として70℃,30
分間の反応で測定し、それぞれの未加熱の酵素活性を基
準として相対的活性値を示した。加熱時の蛋白質濃度は
精製酵素は10μg/mlで行い、菌体抽出粗酵素液は未加熱
時に精製酵素と同じ活性を有する濃度で行った。得られ
た結果を第図に示した。精製酵素は80℃,20時間の加熱
で約75％、90℃,20時間の加熱でも約40％の活性が残存
した。また、菌体抽出粗酵素液は精製酵素より更に高い
熱安定性を示し、80℃,20時間の加熱で約85％、90℃,20
時間の加熱で約65％の活性が残存した。
６） 金属イオンの影響 本酵素の活性におよぼす各種金属イオンの影響を測定
した結果を第２表に示した。各種金属イオンをそれぞれ
酵素溶液に1mMとなるように加え、25℃で30分間放置し
た後に金属イオン混在下でCbz-Phe-Tyrを基質としてpH
8.5で70℃,30分間の反応を行った。本酵素はCa2+,Co2+,
Mg2+に対しては安定であったが、Zn2+によって殆ど活性
を失った。また、Cu2+,Fe2+,Su2+,Mn2+によってある程
度影響を受けた。
した結果を第２表に示した。各種金属イオンをそれぞれ
酵素溶液に1mMとなるように加え、25℃で30分間放置し
た後に金属イオン混在下でCbz-Phe-Tyrを基質としてpH
8.5で70℃,30分間の反応を行った。本酵素はCa2+,Co2+,
Mg2+に対しては安定であったが、Zn2+によって殆ど活性
を失った。また、Cu2+,Fe2+,Su2+,Mn2+によってある程
度影響を受けた。
７） 試薬の影響 本酵素の活性におよぼす各種試薬の影響を測定した結
果を第３表に示した。酵素溶液とそれぞれの濃度の各種
試薬を混合し、25℃で30分間放置した後に、試薬混在下
でCbz-Phe-Tyrを基質としてpH8.5で70℃,30分間の反応
を行った。本酵素の活性は1mM EDTA,1mM 1−10フェナン
トロリンのような金属キレート剤によって強く阻害され
た。また、SH試薬であるPCMBにもかなり阻害を受けた。
1mM N−エチルマレイミド,1mMモノヨード酢酸,1mM 2−
メルカプトエタノール,0.1mMシスティン,10μＭアマス
タチン,10μＭベスタチンに対して殆ど影響を受けなか
った。SDSに対しては0.05％，グアニジン塩酸には0.5M
でかなり強く阻害を受けた。
果を第３表に示した。酵素溶液とそれぞれの濃度の各種
試薬を混合し、25℃で30分間放置した後に、試薬混在下
でCbz-Phe-Tyrを基質としてpH8.5で70℃,30分間の反応
を行った。本酵素の活性は1mM EDTA,1mM 1−10フェナン
トロリンのような金属キレート剤によって強く阻害され
た。また、SH試薬であるPCMBにもかなり阻害を受けた。
1mM N−エチルマレイミド,1mMモノヨード酢酸,1mM 2−
メルカプトエタノール,0.1mMシスティン,10μＭアマス
タチン,10μＭベスタチンに対して殆ど影響を受けなか
った。SDSに対しては0.05％，グアニジン塩酸には0.5M
でかなり強く阻害を受けた。
８） km値およびVmax. 本酵素のkm値およびVmax.はCbz-Phe-Tyrを基質として
酵素反応温度を変えて求めた。各種濃度の基質をpH8.5
の0.05M Tris-HCl緩衝液で調製して30℃,50℃,70℃,90
℃の温度で酵素反応を行った後に、遊離したチロシンを
日立アミノ酸自動分析計835型で同定、定量した。得ら
れた結果からそれぞれの温度のLineweaver-Burkプロッ
トを第５図に示した。km値は30,50,70,90℃でそれぞれ
0.056,0.057,0.058,0.068mMであった。一方、Vmax.はそ
れぞれ0.48,1.64,5.41,9.52μM/minであった。反応温度
によってkm値は殆ど変化しなかったが、Vmax.はかなり
異っており90℃で最も高い値を示した。
酵素反応温度を変えて求めた。各種濃度の基質をpH8.5
の0.05M Tris-HCl緩衝液で調製して30℃,50℃,70℃,90
℃の温度で酵素反応を行った後に、遊離したチロシンを
日立アミノ酸自動分析計835型で同定、定量した。得ら
れた結果からそれぞれの温度のLineweaver-Burkプロッ
トを第５図に示した。km値は30,50,70,90℃でそれぞれ
0.056,0.057,0.058,0.068mMであった。一方、Vmax.はそ
れぞれ0.48,1.64,5.41,9.52μM/minであった。反応温度
によってkm値は殆ど変化しなかったが、Vmax.はかなり
異っており90℃で最も高い値を示した。
９） 基質特異性 本酵素の各種基質に対する特異性を測定しCbz-Phe-Ty
rを基準とした相対的活性値を第４表に示した。酵素反
応はpH8.5で70℃30分間行った。本酵素はＣ末端にProを
含むCbz-Gly-Proを除いたペプチドに対して広い（低
い）特異性を示し、Ｃ末端から２残基目にProを持つペ
プチドに対しても弱いながら活性を示した。疎水性アミ
ノ酸からなるCbz-Phe-Tyrに対して高い活性を示したが
Ｃ末端がPhe,Tyrといった疎水性アミノ酸でもＣ末端か
ら２残基目のアミノ酸の種類によって活性は大きく異っ
た。Ｃ末端がPheで２残基目にGluを持つペプチドとGly
を持つペプチドの活性を比較するとGlyの方が高い活性
を示した。また、Ｃ末端にTyrを持ち２残基目がGluとPh
eのペプチドを比較するとPheの方が高い活性を示した。
このような結果はCbz-Gly-LeuとCbz-Gly-Pro-Leu,Cbz-G
ly-GlyとCbz-Gly-Pro-Leu-Glyの比較でも得られた。
rを基準とした相対的活性値を第４表に示した。酵素反
応はpH8.5で70℃30分間行った。本酵素はＣ末端にProを
含むCbz-Gly-Proを除いたペプチドに対して広い（低
い）特異性を示し、Ｃ末端から２残基目にProを持つペ
プチドに対しても弱いながら活性を示した。疎水性アミ
ノ酸からなるCbz-Phe-Tyrに対して高い活性を示したが
Ｃ末端がPhe,Tyrといった疎水性アミノ酸でもＣ末端か
ら２残基目のアミノ酸の種類によって活性は大きく異っ
た。Ｃ末端がPheで２残基目にGluを持つペプチドとGly
を持つペプチドの活性を比較するとGlyの方が高い活性
を示した。また、Ｃ末端にTyrを持ち２残基目がGluとPh
eのペプチドを比較するとPheの方が高い活性を示した。
このような結果はCbz-Gly-LeuとCbz-Gly-Pro-Leu,Cbz-G
ly-GlyとCbz-Gly-Pro-Leu-Glyの比較でも得られた。
10） ペプチドに対する加水分解作用 本酵素のCbz-Gly-Pro-Leu-Gly,Thr-Thr-Met-Pro-Leu-
Trp,Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Argに対す
る加水分解作用を測定した。酸素反応はpH8.5 0.1Mギ酸
−アンモニア緩衝液を用いて70℃で行い、酵素／基質
（W/W）は各々1:30,1:40,1:70で行った。Cbz-Gly-Pro-L
eu-Glyに対する作用は最初にGlyが遊離した後、Leuは比
較的ゆっくり遊離した。そして、Ｃ末端がProになったC
bz-Gly-Proに対しては作用せず、先の基質特異性の分析
結果と同じであった。Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trpに対し
てはＣ末端からTrp,Leuと速やかに遊離し、Leuの遊離速
度はProが同じ条件で位置する（Ｃ末端から２残基目）
先のペプチドとは異った結果を示した。次に、Ｃ末端が
ProになったThr-Thr-Met-Proに対しても弱いながら活性
を示し、このProが遊離するとMet,Thrと殆ど同時に遊離
した。Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Argに対
してはＣ末端のArgから順次加水分解しGlu,Gluに対して
も作用した。
Trp,Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Argに対す
る加水分解作用を測定した。酸素反応はpH8.5 0.1Mギ酸
−アンモニア緩衝液を用いて70℃で行い、酵素／基質
（W/W）は各々1:30,1:40,1:70で行った。Cbz-Gly-Pro-L
eu-Glyに対する作用は最初にGlyが遊離した後、Leuは比
較的ゆっくり遊離した。そして、Ｃ末端がProになったC
bz-Gly-Proに対しては作用せず、先の基質特異性の分析
結果と同じであった。Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trpに対し
てはＣ末端からTrp,Leuと速やかに遊離し、Leuの遊離速
度はProが同じ条件で位置する（Ｃ末端から２残基目）
先のペプチドとは異った結果を示した。次に、Ｃ末端が
ProになったThr-Thr-Met-Proに対しても弱いながら活性
を示し、このProが遊離するとMet,Thrと殆ど同時に遊離
した。Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Argに対
してはＣ末端のArgから順次加水分解しGlu,Gluに対して
も作用した。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例 ポリペプトン0.4％，酵母エキス0.2％,CaSO4・2H2O0.
15g/lを地下水で溶解し、NaOHでpH7.2に調整後、120℃
で60分間滅菌を行ったものを栽培とした。この培地にサ
ーマス・アクアティカスYT−１（ATCC 25104）を接種
し、75℃で24時間振盪培養を行った。
15g/lを地下水で溶解し、NaOHでpH7.2に調整後、120℃
で60分間滅菌を行ったものを栽培とした。この培地にサ
ーマス・アクアティカスYT−１（ATCC 25104）を接種
し、75℃で24時間振盪培養を行った。
次いで、3l容ジャーファーメンターに上記と同じ組成
の培地１を入れて滅菌したのち前培養液を２％の割合
で接種し、250rpm,1.0VVM,0.5kg/cm2にて75℃で24時間
第２次前培養を行った。
の培地１を入れて滅菌したのち前培養液を２％の割合
で接種し、250rpm,1.0VVM,0.5kg/cm2にて75℃で24時間
第２次前培養を行った。
本培養は、ポリペプトン0.8％，酵母エキス0.4％,CaS
O4・2H2O0.15g/l,ホエイ蛋白質0.4％を地下水で溶解
し、前培地と同様にpH調整，滅菌した培地を用い、第２
次培養液を４％接種し、65℃で定常期になるまで培養を
行った。なお、第２次前培養，本培養では必要に応じて
消泡剤（Adecanol LG126）を添加した。培養後菌体は遠
心分離で常法にもとづいて集菌した。
O4・2H2O0.15g/l,ホエイ蛋白質0.4％を地下水で溶解
し、前培地と同様にpH調整，滅菌した培地を用い、第２
次培養液を４％接種し、65℃で定常期になるまで培養を
行った。なお、第２次前培養，本培養では必要に応じて
消泡剤（Adecanol LG126）を添加した。培養後菌体は遠
心分離で常法にもとづいて集菌した。
次いで、菌体を0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）に懸
濁（10％W/V）した後に、強力超音波振盪器（ブランソ
ン社，モデル200 100V 20KHz）を用いて最大出力で10分
間超音波処理を行い、菌体を粉砕した。この時の試料の
温度は10℃以下で行った。その後、菌体の破片を遠心分
離（35,000×g20分間）で除去し、得られた上清液を同
上緩衝液で十分に透析して菌体抽出粗酵素液とした。
濁（10％W/V）した後に、強力超音波振盪器（ブランソ
ン社，モデル200 100V 20KHz）を用いて最大出力で10分
間超音波処理を行い、菌体を粉砕した。この時の試料の
温度は10℃以下で行った。その後、菌体の破片を遠心分
離（35,000×g20分間）で除去し、得られた上清液を同
上緩衝液で十分に透析して菌体抽出粗酵素液とした。
次いで、以下の方法により酵素を精製した。
１） 硫酸アルモニウムによる塩析 菌体抽出粗酵素液50mlに硫酸アンモニウム28.05gを加
えて80％飽和となるようにし、30分間放置した後、遠心
分離（10,000×g30分間）を行う。得られた沈殿物は0.0
5M、Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で溶解し、同緩衝液で十
分に透析した後に、硫酸アンモニウム沈殿酵素画分とす
る。
えて80％飽和となるようにし、30分間放置した後、遠心
分離（10,000×g30分間）を行う。得られた沈殿物は0.0
5M、Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で溶解し、同緩衝液で十
分に透析した後に、硫酸アンモニウム沈殿酵素画分とす
る。
２） DEAEセファセルクロマトグラフィー 80％硫酸アンモニウム沈殿酵素画分70mlを予め0.5M T
ris-HCl緩衝液（pH7.2）で平衡化したDEAEセファセルカ
ラム（2.4×24cm）に吸着させる。カラムを同緩衝液で
洗浄してから、0M〜0.5M塩化ナトリウム（NaCl）の直線
的濃度勾配となる条件で同緩衝液1000mlを用いて溶出す
る。溶出速度は40ml/時間で行い、溶出液は１画分10ml
づつ分取する。分画した各画分蛋白質量（280mmの吸光
値）およびCbz-Phe-Tyrに対する加水分解活性を測定
し、カルボキシペプチダーゼ活性を含む溶出画分No.24
〜54を集め、0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で透析を
行った後に、DEAEセファセルクロマトグラフィー酵素画
分とする。
ris-HCl緩衝液（pH7.2）で平衡化したDEAEセファセルカ
ラム（2.4×24cm）に吸着させる。カラムを同緩衝液で
洗浄してから、0M〜0.5M塩化ナトリウム（NaCl）の直線
的濃度勾配となる条件で同緩衝液1000mlを用いて溶出す
る。溶出速度は40ml/時間で行い、溶出液は１画分10ml
づつ分取する。分画した各画分蛋白質量（280mmの吸光
値）およびCbz-Phe-Tyrに対する加水分解活性を測定
し、カルボキシペプチダーゼ活性を含む溶出画分No.24
〜54を集め、0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で透析を
行った後に、DEAEセファセルクロマトグラフィー酵素画
分とする。
３） フェニルセファロースCL-4Bクロマトグラフィ フェニルセファロースCL-4Bカラム（1.2×20cm）を予
め1M NaClを含んだ0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で平
衡化を行った。先の酵素溶液300mlは同緩衝液で1M NaCl
とした後にカラムに吸着させた。その後、1M〜0.05M Na
Clの直線的濃度勾配となる条件で0.05M Tris-HCl緩衝液
（pH7.2）700ml,0.05M〜0M NaClの条件で同緩衝液200m
l,NaClを含まない同緩衝液100ml,0.05M Tris-HCl緩衝液
（pH9.0）100ml,蒸留水100ml,更にエタノール100mlで順
次溶出を行う。溶出速度は20ml/時間で行い、溶出液は
１画分5mlづつ分取する。分画した各画分の蛋白質量（2
80mmの吸光値）およびCbz-Phe-Tyrに対する加水分解活
性を測定し、カルボキシペプチダーゼ活性を含む溶出画
分No.38〜160を集め、0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）
で透析を繰り返した後にフェニルセファロースCL-4Bク
ロマトグラフィ酵素画分とする。
め1M NaClを含んだ0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で平
衡化を行った。先の酵素溶液300mlは同緩衝液で1M NaCl
とした後にカラムに吸着させた。その後、1M〜0.05M Na
Clの直線的濃度勾配となる条件で0.05M Tris-HCl緩衝液
（pH7.2）700ml,0.05M〜0M NaClの条件で同緩衝液200m
l,NaClを含まない同緩衝液100ml,0.05M Tris-HCl緩衝液
（pH9.0）100ml,蒸留水100ml,更にエタノール100mlで順
次溶出を行う。溶出速度は20ml/時間で行い、溶出液は
１画分5mlづつ分取する。分画した各画分の蛋白質量（2
80mmの吸光値）およびCbz-Phe-Tyrに対する加水分解活
性を測定し、カルボキシペプチダーゼ活性を含む溶出画
分No.38〜160を集め、0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）
で透析を繰り返した後にフェニルセファロースCL-4Bク
ロマトグラフィ酵素画分とする。
４） セファデックスＧ−200ゲルクロマトグラフィ 先の酵素溶液610mlはコロジオンバックで濃縮した後
に、0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で平衡化し、最終
的に3mlまで濃縮を行う。濃縮試料は、予め同緩衝液で
平衡化したセファデックスＧ−200カラム（２×70cm）
にのせ、同緩衝液で溶出を行う。溶出速度は5ml/時間で
行い、溶出液は１画分2.5mlづつ分取する。分画した各
画分の蛋白質量（280mmの吸光値）およびCbz-Phe-Tyrに
対する加水分解活性を測定し、カルボキシペプチダーゼ
活性を含む溶出画分No.48〜74を集め、セファデックス
Ｇ−200クロマログラフィ酵素画分とする。
に、0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で平衡化し、最終
的に3mlまで濃縮を行う。濃縮試料は、予め同緩衝液で
平衡化したセファデックスＧ−200カラム（２×70cm）
にのせ、同緩衝液で溶出を行う。溶出速度は5ml/時間で
行い、溶出液は１画分2.5mlづつ分取する。分画した各
画分の蛋白質量（280mmの吸光値）およびCbz-Phe-Tyrに
対する加水分解活性を測定し、カルボキシペプチダーゼ
活性を含む溶出画分No.48〜74を集め、セファデックス
Ｇ−200クロマログラフィ酵素画分とする。
５） DEAEセファセルによる再クロマトグラフィ 先のゲル濾過により精製で得た酵素溶液65mlを、予め
0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で平衡化したDEAEセフ
ァセルカラム（1.7×20cm）に吸着させる。同緩衝液で
洗浄してから、0M〜0.4M NaClの直線的濃度勾配となる
条件で400mlの同緩衝液で溶出を行う。溶出速度は20ml/
時間で行い、溶出液は１画分5mlづつ分取する。溶出し
た各画分の蛋白質量（280mmの吸光値）およびCbz-Phe-T
yrに対する加水分解活性を測定する。酵素の活性は１回
目のDEAEセファセルによる精製工程でも認められたよう
に今回も活性の主ピークの前部分で活性が肩のように広
がって分画されたため、カルボキシペプチダーゼ活性を
含む溶出画分を２画分に分けて集め、最初に活性が肩の
ように溶出した画分No.23〜32をDEAEセファセル再クロ
マトグラフィ酵素画分Ｉ、活性の主ピークが溶出した画
分No.33〜48をDEAEセファセル再クロマトグラフィ酵素
画分IIとする。それぞれの酵素画分は0.05M Tris-HCl緩
衝液（pH7.2）で透析を行う。ここで得られた比活性は
酵素画分Ｉは325.5U/mg,酵素画分IIは712.2U/mgであっ
た。
0.05M Tris-HCl緩衝液（pH7.2）で平衡化したDEAEセフ
ァセルカラム（1.7×20cm）に吸着させる。同緩衝液で
洗浄してから、0M〜0.4M NaClの直線的濃度勾配となる
条件で400mlの同緩衝液で溶出を行う。溶出速度は20ml/
時間で行い、溶出液は１画分5mlづつ分取する。溶出し
た各画分の蛋白質量（280mmの吸光値）およびCbz-Phe-T
yrに対する加水分解活性を測定する。酵素の活性は１回
目のDEAEセファセルによる精製工程でも認められたよう
に今回も活性の主ピークの前部分で活性が肩のように広
がって分画されたため、カルボキシペプチダーゼ活性を
含む溶出画分を２画分に分けて集め、最初に活性が肩の
ように溶出した画分No.23〜32をDEAEセファセル再クロ
マトグラフィ酵素画分Ｉ、活性の主ピークが溶出した画
分No.33〜48をDEAEセファセル再クロマトグラフィ酵素
画分IIとする。それぞれの酵素画分は0.05M Tris-HCl緩
衝液（pH7.2）で透析を行う。ここで得られた比活性は
酵素画分Ｉは325.5U/mg,酵素画分IIは712.2U/mgであっ
た。
６） ディスク電気泳動ゲル抽出 先のDEAEセファセル再クロマトグラフィで精製した酵
素画分I50mlおよび酵素画分II80mlは各々コロジオンバ
ックで濃縮を行う。ディスク電気泳動は7.5％ポリアク
リルアミドゲルを用いてpH8.0で行い、濃縮した酵素画
分I,IIはカラム１本当り蛋白質量で220μｇづつのせ、
１本当り3mAの定電流で約２時間電気泳動を行う。泳動
後、酵素画分I,IIの１本は染色し、他のゲルは2mm毎に
スライスして各々の画分を1mlの0.05M Tris-HCl緩衝液
（pH7.2）に浸し、破砕して酵素を抽出する。酵素画分
I,IIの染色したゲルの吸光値550mmのデンシトメーター
によるパターンと、分画した各画分のCbz-Phe-Tyrに対
する加水分解活性を測定した結果、DEAEセファセル再ク
ロマトグラフィで得た酵素画分I,IIをディスク電気泳動
ゲル抽出で精製したカルボキシペプチダーゼ活性のパタ
ーンは同じであった。ディスク電気泳動上のカルボキシ
ペプチダーゼ活性は、相対的移動度約0.35の位置に主な
活性ピークを示し、それより移動度の低い部分全体にも
弱い活性が認められた。以後は、先のDEAEセファセル再
クロマトグラフィによる精製工程で高い比活性の有した
酵素画分IIでディスク電気泳動による相対的移動度0.35
の主活性ピークの部分を精製することとし、このカルボ
キシペプチダーゼ活性画分を集めてディスク電気泳動酵
素画分とした。
素画分I50mlおよび酵素画分II80mlは各々コロジオンバ
ックで濃縮を行う。ディスク電気泳動は7.5％ポリアク
リルアミドゲルを用いてpH8.0で行い、濃縮した酵素画
分I,IIはカラム１本当り蛋白質量で220μｇづつのせ、
１本当り3mAの定電流で約２時間電気泳動を行う。泳動
後、酵素画分I,IIの１本は染色し、他のゲルは2mm毎に
スライスして各々の画分を1mlの0.05M Tris-HCl緩衝液
（pH7.2）に浸し、破砕して酵素を抽出する。酵素画分
I,IIの染色したゲルの吸光値550mmのデンシトメーター
によるパターンと、分画した各画分のCbz-Phe-Tyrに対
する加水分解活性を測定した結果、DEAEセファセル再ク
ロマトグラフィで得た酵素画分I,IIをディスク電気泳動
ゲル抽出で精製したカルボキシペプチダーゼ活性のパタ
ーンは同じであった。ディスク電気泳動上のカルボキシ
ペプチダーゼ活性は、相対的移動度約0.35の位置に主な
活性ピークを示し、それより移動度の低い部分全体にも
弱い活性が認められた。以後は、先のDEAEセファセル再
クロマトグラフィによる精製工程で高い比活性の有した
酵素画分IIでディスク電気泳動による相対的移動度0.35
の主活性ピークの部分を精製することとし、このカルボ
キシペプチダーゼ活性画分を集めてディスク電気泳動酵
素画分とした。
７） ディスク電気泳ぎ動による再ゲル抽出 酵素溶液IIのディスク電気泳動による主な活性画分溶
液をコロジオンバックで濃縮し、先と同じ方法で再度デ
ィスク電気泳動でゲル抽出を行い、Cbz-Phe-Tyrに対す
る加水分解活性を含む画分を集めて0.05M Tris-HCl緩衝
液（pH7.2）で透析を行った後に、精製酵素溶液とす
る。
液をコロジオンバックで濃縮し、先と同じ方法で再度デ
ィスク電気泳動でゲル抽出を行い、Cbz-Phe-Tyrに対す
る加水分解活性を含む画分を集めて0.05M Tris-HCl緩衝
液（pH7.2）で透析を行った後に、精製酵素溶液とす
る。
以上の精製工程における結果を第５表に要約する。精
製酵素はCbz-Phe-Tyrを基質として菌体抽出粗酵素液と
比較すると、比活性で412.5倍に精製され、活性の収率
は21.6％であった。
製酵素はCbz-Phe-Tyrを基質として菌体抽出粗酵素液と
比較すると、比活性で412.5倍に精製され、活性の収率
は21.6％であった。
〔発明の効果〕 本発明のカルボキシペプチダーゼは最適作用温度が75
〜80℃であり、高温下での熱安定性も優れている。この
ように高い耐熱性とペプチドのＣ末端からアミノ酸を順
次遊離する真のカルボキシダーゼ作用を有するので、本
酵素は酵素の構造や機能の研究，分析用試薬，食品工業
への応用など幅広い利用が期待される。
〜80℃であり、高温下での熱安定性も優れている。この
ように高い耐熱性とペプチドのＣ末端からアミノ酸を順
次遊離する真のカルボキシダーゼ作用を有するので、本
酵素は酵素の構造や機能の研究，分析用試薬，食品工業
への応用など幅広い利用が期待される。
また、本酵素は好熱性細菌を用いて効率よく製造する
ことができる。
ことができる。
第１図は本発明の酵素および標準蛋白質の溶出位置と分
子量の関係を示すグラフであり、図中のＡはキモトリプ
シン（分子量25,000）,Bはオボアルブミン（分子量43,0
00）,Cは牛血清アルブミン（分子量67,000）,Dはアルド
ラーゼ（分子量160,000）,Eは本発明の酵素を示す。第
２図はpHと酵素の残存活性の関係を示すグラフであり、
pH5〜６はクエン酸ナトリウム,pH6〜８はリン酸ナトリ
ウム,pH8〜９はトリス−HCl,pH9〜10はホウ酸ナトリウ
ムの各緩衝液（0.05M）を用いた。第３図は温度と酵素
の相対活性の関係を示すグラフ、第４図は温度と酵素の
残存活性を示すグラフ、第５図は本発明の酵素のkm値と
Vmax.を示すグラフであり、30℃（黒丸）,50℃（四
角）,70℃（白丸）または90℃（三角）でpH8.5にて30分
間インキュベートしたときの結果を示している。
子量の関係を示すグラフであり、図中のＡはキモトリプ
シン（分子量25,000）,Bはオボアルブミン（分子量43,0
00）,Cは牛血清アルブミン（分子量67,000）,Dはアルド
ラーゼ（分子量160,000）,Eは本発明の酵素を示す。第
２図はpHと酵素の残存活性の関係を示すグラフであり、
pH5〜６はクエン酸ナトリウム,pH6〜８はリン酸ナトリ
ウム,pH8〜９はトリス−HCl,pH9〜10はホウ酸ナトリウ
ムの各緩衝液（0.05M）を用いた。第３図は温度と酵素
の相対活性の関係を示すグラフ、第４図は温度と酵素の
残存活性を示すグラフ、第５図は本発明の酵素のkm値と
Vmax.を示すグラフであり、30℃（黒丸）,50℃（四
角）,70℃（白丸）または90℃（三角）でpH8.5にて30分
間インキュベートしたときの結果を示している。
Claims (3)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するカルボキシペ
プチダーゼ。 作用：ペプチドのＣ末端からアミノ酸を順次遊離す
る。 基質特異性:C末端にProを含むCbz−Gly−Proを除い
たペプチドに対して広い特異性を示す。 最適作用pH:8.0〜9.0 最適作用温度:75〜80℃ 熱安定性：高い熱安定性を有し、80℃,20時間の加
熱で約75％、90℃,20時間の加熱で約40％の活性が残存
する。 金属イオンの影響:Ca2+,Co2+,Mg2+に対して安定で
あるが、Zn2+により失活する。 分子量:62000（ゲル濾過法） - 【請求項２】サーマス属に属し、下記の理化学的性質を
有するカルボキシペプチダーゼを生産する能力のある高
度好熱性細菌を栄養培地に培養し、培養物中に該カルボ
キシペプチダーゼを生成せしめ、これを採取することを
特徴とするカルボキシペプチダーゼの製造法。 作用：ペプチドのＣ末端からアミノ酸を順次遊離す
る。 基質特異性:C末端にProを含むCbz−Gly−Proを除い
たペプチドに対して広い特異性を示す。 最適作用pH:8.0〜9.0 最適作用温度:75〜80℃ 熱安定性：高い熱安定性を有し、80℃,20時間の加
熱で約75％、90℃,20時間の加熱で約40％の活性が残存
する。 金属イオンの影響:Ca2+,Co2+,Mg2+に対して安定で
あるが、Zn2+により失活する。 分子量:62000（ゲル濾過法） - 【請求項３】サーマス属に属するカルボキシペプチダー
ゼ生産能を有する高度好熱性細菌が、サーマス・アクア
ティカスYT−１（ATCC 25104）である特許請求の範囲第
２項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5127487A JP2525592B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | カルボキシペプチダ−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5127487A JP2525592B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | カルボキシペプチダ−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63216481A JPS63216481A (ja) | 1988-09-08 |
| JP2525592B2 true JP2525592B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=12882366
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5127487A Expired - Lifetime JP2525592B2 (ja) | 1987-03-06 | 1987-03-06 | カルボキシペプチダ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2525592B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0795898B2 (ja) * | 1992-10-30 | 1995-10-18 | 合名会社中村産業 | 土壌改良法 |
-
1987
- 1987-03-06 JP JP5127487A patent/JP2525592B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63216481A (ja) | 1988-09-08 |
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