JPH0530968A - 新規プロリンジペプチダーゼおよびその製造法 - Google Patents
新規プロリンジペプチダーゼおよびその製造法Info
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- JPH0530968A JPH0530968A JP20874691A JP20874691A JPH0530968A JP H0530968 A JPH0530968 A JP H0530968A JP 20874691 A JP20874691 A JP 20874691A JP 20874691 A JP20874691 A JP 20874691A JP H0530968 A JPH0530968 A JP H0530968A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 サーマス・アクアティカス(Thermus aquatic
us) YT−１株（ＡＴＣＣ２５１０４）に由来し、下記の
性質を有する新規プロリンジペプチダーゼ。 ａ）この酵素の活性の至適pHは7.０〜7.５である。 ｂ）この酵素の活性の至適温度は７０〜８０℃である。 ｃ）この酵素は、Leu-Pro を基質として、６０℃で酵素
濃度0.５μg/ml、５０mM燐酸塩緩衝液（pH7.５）を用い
た条件で、４８時間後で７０％以上の残存活性を示す。 ｄ）この酵素は、EDTA、２−メルカプトエタノールによ
って強く阻害される。 ｅ）この酵素は、EDTAで処理した後、Co2+もしくはMn2+
あるいはZn2+により賦活される。 ｆ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約３２万であり、
ＳＤＳ電気泳動法で約４万のサブユニットからなる８量
体酵素である。 【効果】 本発明のプロリンジペプチダーゼは、高度好
熱細菌であるサーマス・アクアティカスに由来するもの
であり、極めて高い耐熱性を有し、７０〜８０℃でも活
性を失わないという特色がある。そのため、食品工業な
どで有利に利用できる他、研究用試薬等としても有用で
ある。
us) YT−１株（ＡＴＣＣ２５１０４）に由来し、下記の
性質を有する新規プロリンジペプチダーゼ。 ａ）この酵素の活性の至適pHは7.０〜7.５である。 ｂ）この酵素の活性の至適温度は７０〜８０℃である。 ｃ）この酵素は、Leu-Pro を基質として、６０℃で酵素
濃度0.５μg/ml、５０mM燐酸塩緩衝液（pH7.５）を用い
た条件で、４８時間後で７０％以上の残存活性を示す。 ｄ）この酵素は、EDTA、２−メルカプトエタノールによ
って強く阻害される。 ｅ）この酵素は、EDTAで処理した後、Co2+もしくはMn2+
あるいはZn2+により賦活される。 ｆ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約３２万であり、
ＳＤＳ電気泳動法で約４万のサブユニットからなる８量
体酵素である。 【効果】 本発明のプロリンジペプチダーゼは、高度好
熱細菌であるサーマス・アクアティカスに由来するもの
であり、極めて高い耐熱性を有し、７０〜８０℃でも活
性を失わないという特色がある。そのため、食品工業な
どで有利に利用できる他、研究用試薬等としても有用で
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は耐熱性のプロリンジペプ
チダーゼおよびその精製方法に関するものである。
チダーゼおよびその精製方法に関するものである。
【０００２】プロリンジペプチダーゼはEC3.4.13.9に分
類される酵素である。本発明の酵素は、高度好熱性細菌
に由来し、極めて高い耐熱性を有し、７０〜８０℃でも
活性を失わないという特徴を有しており、極めて安定で
ある。そのため、本酵素は研究試薬，バイオリアクター
用酵素等として極めて有用である。
類される酵素である。本発明の酵素は、高度好熱性細菌
に由来し、極めて高い耐熱性を有し、７０〜８０℃でも
活性を失わないという特徴を有しており、極めて安定で
ある。そのため、本酵素は研究試薬，バイオリアクター
用酵素等として極めて有用である。
【０００３】
【従来の技術、発明が解決しようとする課題】プロリン
ジペプチダーゼはアミノアシルプロリンを特異的に加水
分解する酵素で、生体内ではアミノ酸の代謝回転、特に
コラーゲンの代謝系において重要な役割を果たしてい
る。この酵素は現在、多くの動物組織から分離され、そ
れぞれの構造，性質などが詳細に調べられている。
ジペプチダーゼはアミノアシルプロリンを特異的に加水
分解する酵素で、生体内ではアミノ酸の代謝回転、特に
コラーゲンの代謝系において重要な役割を果たしてい
る。この酵素は現在、多くの動物組織から分離され、そ
れぞれの構造，性質などが詳細に調べられている。
【０００４】従来、プロリンジペプチダーゼは特に工業
的には利用されていなかった。しかし、食品蛋白質等の
酵素的分解において、従来用いられているエンドペプチ
ダーゼやエキソペプチダーゼのみではプロリンを含むジ
ペプチドは分解されにくいという問題点があり、かかる
問題点の解消を図るために、プロリンジペプチダーゼを
併用することにり、より効率的な酵素分解が可能とな
る。
的には利用されていなかった。しかし、食品蛋白質等の
酵素的分解において、従来用いられているエンドペプチ
ダーゼやエキソペプチダーゼのみではプロリンを含むジ
ペプチドは分解されにくいという問題点があり、かかる
問題点の解消を図るために、プロリンジペプチダーゼを
併用することにり、より効率的な酵素分解が可能とな
る。
【０００５】一方、酵素を工業的に利用する場合、耐熱
性が高く、安定な酵素を用いることは経済的に極めて有
利な条件となる。また、反応温度を高く設定できること
によって、食品工業では殺菌工程と同時に酵素処理もで
きるといった利点も生ずる。しかし、これまで報告され
ているプロリンジペプチダーゼは常温生物から得られた
ものであり、好熱性細菌、特にサーマス属などの高度好
熱性細菌由来のプロリンジペプチダーゼについてはまだ
報告されていない。
性が高く、安定な酵素を用いることは経済的に極めて有
利な条件となる。また、反応温度を高く設定できること
によって、食品工業では殺菌工程と同時に酵素処理もで
きるといった利点も生ずる。しかし、これまで報告され
ているプロリンジペプチダーゼは常温生物から得られた
ものであり、好熱性細菌、特にサーマス属などの高度好
熱性細菌由来のプロリンジペプチダーゼについてはまだ
報告されていない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、耐
熱性に優れ、食品の製造プロセスに有利に用いることが
できる新規プロリンジペプチダーゼを生産する好熱性細
菌を探索すべく研究を重ねた結果、サーマス(Thermus)
属に属する高度好熱性細菌が目的とする酵素を生産する
ことを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
熱性に優れ、食品の製造プロセスに有利に用いることが
できる新規プロリンジペプチダーゼを生産する好熱性細
菌を探索すべく研究を重ねた結果、サーマス(Thermus)
属に属する高度好熱性細菌が目的とする酵素を生産する
ことを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【０００７】本発明は、第１にサーマス・アクアティカ
ス(Thermus aquaticus) YT−１株に由来し、下記の性質
を有する新規プロリンジペプチダーゼに関する。 ａ）この酵素の活性の至適pHは7.０〜7.５である。 ｂ）この酵素の活性の至適温度は７０〜８０℃である。 ｃ）この酵素は、Leu-Pro を基質として、６０℃で酵素
濃度0.５μg/ml、５０mM燐酸塩緩衝液（pH7.５）を用い
た条件で、４８時間後で７０％以上の残存活性を示す。 ｄ）この酵素は、EDTA、２−メルカプトエタノールによ
って強く阻害される。 ｅ）この酵素は、EDTAで処理した後、Co2+もしくはMn2+
あるいはZn2+により賦活される。 ｆ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約３２万であり、
ＳＤＳ電気泳動法で約４万のサブユニットからなる８量
体酵素である。
ス(Thermus aquaticus) YT−１株に由来し、下記の性質
を有する新規プロリンジペプチダーゼに関する。 ａ）この酵素の活性の至適pHは7.０〜7.５である。 ｂ）この酵素の活性の至適温度は７０〜８０℃である。 ｃ）この酵素は、Leu-Pro を基質として、６０℃で酵素
濃度0.５μg/ml、５０mM燐酸塩緩衝液（pH7.５）を用い
た条件で、４８時間後で７０％以上の残存活性を示す。 ｄ）この酵素は、EDTA、２−メルカプトエタノールによ
って強く阻害される。 ｅ）この酵素は、EDTAで処理した後、Co2+もしくはMn2+
あるいはZn2+により賦活される。 ｆ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約３２万であり、
ＳＤＳ電気泳動法で約４万のサブユニットからなる８量
体酵素である。
【０００８】本発明は、第２にサーマス・アクアティカ
ス(Thermus aquaticus) YT−１株の菌体を超音波処理で
破砕抽出し、その後、硫安による塩析、EDTA−セファセ
ルおよびフェニルセファロース、クロマトフォーカシン
グ、ゲル濾過などの酵素精製に用いられる通常の操作を
適宜組み合わせることを特徴とする、上述ａ）〜ｆ）の
性質を有する新規プロリンジペプチダーゼの精製方法に
関する。
ス(Thermus aquaticus) YT−１株の菌体を超音波処理で
破砕抽出し、その後、硫安による塩析、EDTA−セファセ
ルおよびフェニルセファロース、クロマトフォーカシン
グ、ゲル濾過などの酵素精製に用いられる通常の操作を
適宜組み合わせることを特徴とする、上述ａ）〜ｆ）の
性質を有する新規プロリンジペプチダーゼの精製方法に
関する。
【０００９】本発明に用いるサーマス・アクアティカス
(Thermus aquaticus) YT−１株は、すでにアメリカンタ
イプカルチャーコレクションに寄託番号ＡＴＣＣ２５１
０４で寄託されており、何人も入手可能である。なお、
本菌の他．その自然的もしくは人工的変異株であって
も、プロリンジペプチダーゼ生産能を有するものは本発
明に使用することができる。
(Thermus aquaticus) YT−１株は、すでにアメリカンタ
イプカルチャーコレクションに寄託番号ＡＴＣＣ２５１
０４で寄託されており、何人も入手可能である。なお、
本菌の他．その自然的もしくは人工的変異株であって
も、プロリンジペプチダーゼ生産能を有するものは本発
明に使用することができる。
【００１０】本発明の新規プロリンジペプチダーゼは、
上記サーマス・アクアティカスYT−１株（ＡＴＣＣ２５
１０４）によって生産され、該酵素の単離、精製は例え
ば下記の手法によって行うことができる。
上記サーマス・アクアティカスYT−１株（ＡＴＣＣ２５
１０４）によって生産され、該酵素の単離、精製は例え
ば下記の手法によって行うことができる。
【００１１】まず、上記微生物をポリペプトンや酵母エ
キスなどを含む栄養培地で４０〜８０℃で１２時間〜１
０日間好気的条件下に培養する。次いで、培養物を遠心
分離等の固液分離して菌体を回収する。この菌体は、必
要に応じて凍結保存する。この菌体から目的とする酵素
を得るには、先ず菌体を超音波処理して破砕処理する。
このときの条件は、例えば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ7.５）に菌体を懸濁し、超音波処理（ブラ
ンソン社 モデル４５０，３０Ｗ，２０ＫＨｚ）を行
う。次いで、破砕処理物を遠心分離（１６，２２０×
ｇ，２０分）して上清を得る。この上清を上記緩衝液で
透析して菌体抽出粗酵素液とする。
キスなどを含む栄養培地で４０〜８０℃で１２時間〜１
０日間好気的条件下に培養する。次いで、培養物を遠心
分離等の固液分離して菌体を回収する。この菌体は、必
要に応じて凍結保存する。この菌体から目的とする酵素
を得るには、先ず菌体を超音波処理して破砕処理する。
このときの条件は、例えば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ7.５）に菌体を懸濁し、超音波処理（ブラ
ンソン社 モデル４５０，３０Ｗ，２０ＫＨｚ）を行
う。次いで、破砕処理物を遠心分離（１６，２２０×
ｇ，２０分）して上清を得る。この上清を上記緩衝液で
透析して菌体抽出粗酵素液とする。
【００１２】この粗酵素液に硫安を加えて３０％飽和に
なるようにしたのち、遠心分離を行って沈澱物を除き、
上清に再び硫安を加え８０％飽和とし、再度遠心分離を
行い、沈澱物を前記緩衝液に懸濁し、同緩衝液で透析を
行う。
なるようにしたのち、遠心分離を行って沈澱物を除き、
上清に再び硫安を加え８０％飽和とし、再度遠心分離を
行い、沈澱物を前記緩衝液に懸濁し、同緩衝液で透析を
行う。
【００１３】上記硫安沈澱画分をＤＥＡＥセファセルク
ロマトグラフィーにより分画し、活性画分を得る。次
に、この活性画分をフェニルセファロースＣＬ−４Ｂク
ロマトグラフィーおよびモノＱクロマトグラフィーによ
り順次分画して活性画分を回収したのち、クロマトフォ
ーカシングによる分画とジオール３００カラムによるゲ
ル濾過を行って最終の活性画分を得る。
ロマトグラフィーにより分画し、活性画分を得る。次
に、この活性画分をフェニルセファロースＣＬ−４Ｂク
ロマトグラフィーおよびモノＱクロマトグラフィーによ
り順次分画して活性画分を回収したのち、クロマトフォ
ーカシングによる分画とジオール３００カラムによるゲ
ル濾過を行って最終の活性画分を得る。
【００１４】このようにして精製された本発明のプロリ
ンジペプチダーゼは、前記した性質を有しており、文献
未載の新規酵素である。
ンジペプチダーゼは、前記した性質を有しており、文献
未載の新規酵素である。
【００１５】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。なお、本発明のプロリンジペプチダーゼの活性の測
定法を以下に示す。 １）プロリン残基を含むペプチドに対する活性の測定 プロリン残基を含むペプチドに対する酵素活性の測定
は、Yaron とMlyner(Biochem. Biophys. Res. Commun.,
32,658,1968)の方法に準じて行い、酵素作用によって生
じたプロリンをニンヒドリンを反応させて比色定量し
た。実際には、緩衝液に溶解した１mMの各種ペプチド溶
液および１mMのCoCl2 各0.１mlを混合し、酵素反応温度
とした後に、酵素溶液0.１mlをそれぞれ加えて反応を行
った。反応条件は通常pH7.５で７５℃、３０分間で行っ
た。反応停止は0.１Ｍ酢酸溶液0.１mlを加えて行い、さ
らに蒸留水を0.６mlを加え、全体で１mlとした。その
後、氷酢酸2.５mlとニンヒドリン試薬2.５mlを加えて攪
拌混合してから沸騰水浴中で３０分間加熱を行った。加
熱終了後は氷水中で十分に冷却してから室温に戻して４
８０nmにおける吸光値を分光光度計で測定した。また、
分析内容によっては、酵素反応時の基質溶液，酵素溶
液，蒸留水または緩衝液の種類および割合、反応温度お
よび反応時間を変えて行った。酵素活性の単位は、通常
pH7.５，７５℃において酵素溶液１mlが１分間に生成す
るプロリン量を算出し、１μmol のプロリンを生成する
酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
る。なお、本発明のプロリンジペプチダーゼの活性の測
定法を以下に示す。 １）プロリン残基を含むペプチドに対する活性の測定 プロリン残基を含むペプチドに対する酵素活性の測定
は、Yaron とMlyner(Biochem. Biophys. Res. Commun.,
32,658,1968)の方法に準じて行い、酵素作用によって生
じたプロリンをニンヒドリンを反応させて比色定量し
た。実際には、緩衝液に溶解した１mMの各種ペプチド溶
液および１mMのCoCl2 各0.１mlを混合し、酵素反応温度
とした後に、酵素溶液0.１mlをそれぞれ加えて反応を行
った。反応条件は通常pH7.５で７５℃、３０分間で行っ
た。反応停止は0.１Ｍ酢酸溶液0.１mlを加えて行い、さ
らに蒸留水を0.６mlを加え、全体で１mlとした。その
後、氷酢酸2.５mlとニンヒドリン試薬2.５mlを加えて攪
拌混合してから沸騰水浴中で３０分間加熱を行った。加
熱終了後は氷水中で十分に冷却してから室温に戻して４
８０nmにおける吸光値を分光光度計で測定した。また、
分析内容によっては、酵素反応時の基質溶液，酵素溶
液，蒸留水または緩衝液の種類および割合、反応温度お
よび反応時間を変えて行った。酵素活性の単位は、通常
pH7.５，７５℃において酵素溶液１mlが１分間に生成す
るプロリン量を算出し、１μmol のプロリンを生成する
酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００１６】２）一般の合成ペプチドに対する活性の測
定 一般の合成ペプチドに対する酵素活性の測定は、Mathes
onら(Can. J. Biochem.,42,95,1964）の方法に準じて行
い、酵素作用によって生じたアミノ酸などをニンヒドリ
ンと反応させて比色定量した。実際には、緩衝液に溶解
した１mMの各種ペプチド溶液および１mMのCoCl2 各0.１
mlを混合し、酵素反応温度とした後に、酵素溶液0.１ml
をそれぞれ加えて一定時間反応させた後、0.１Ｍ酢酸溶
液0.１mlを加えて反応を停止させた。反応停止溶液に蒸
留水0.７mlを加えて１mlとした後に0.２Ｍクエン酸緩衝
液（pH5.０）0.５mlとニンヒドリン試薬1.２mlを加えて
攪拌混合したのち、沸騰水浴中で7.５分間加熱を行っ
た。その後、速やかに氷水中で十分に冷却した後に、６
０％エタノール2.５mlで希釈し、室温で５７０nmにおけ
る吸光値を分光光度計で測定した。酵素活性の単位は、
通常pH7.５，７５℃において酵素溶液１mlが１分間に生
成するニンヒドリン陽性物質をロイシン量に換算し、１
μmol のロイシンに相当するニンヒドリン陽性物質を生
成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
定 一般の合成ペプチドに対する酵素活性の測定は、Mathes
onら(Can. J. Biochem.,42,95,1964）の方法に準じて行
い、酵素作用によって生じたアミノ酸などをニンヒドリ
ンと反応させて比色定量した。実際には、緩衝液に溶解
した１mMの各種ペプチド溶液および１mMのCoCl2 各0.１
mlを混合し、酵素反応温度とした後に、酵素溶液0.１ml
をそれぞれ加えて一定時間反応させた後、0.１Ｍ酢酸溶
液0.１mlを加えて反応を停止させた。反応停止溶液に蒸
留水0.７mlを加えて１mlとした後に0.２Ｍクエン酸緩衝
液（pH5.０）0.５mlとニンヒドリン試薬1.２mlを加えて
攪拌混合したのち、沸騰水浴中で7.５分間加熱を行っ
た。その後、速やかに氷水中で十分に冷却した後に、６
０％エタノール2.５mlで希釈し、室温で５７０nmにおけ
る吸光値を分光光度計で測定した。酵素活性の単位は、
通常pH7.５，７５℃において酵素溶液１mlが１分間に生
成するニンヒドリン陽性物質をロイシン量に換算し、１
μmol のロイシンに相当するニンヒドリン陽性物質を生
成する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。
【００１７】実施例１
（１）菌の培養および保存
高度好熱性細菌サーマス・アクアティカス(Thermus aqu
aticus) YT−１株の培養は、ポリペプトン0.８％，酵母
エキス0.４％，CaSO4 ・2H2O 0.１５ｇ/l，ホエイ蛋白
質0.４％を含む混合培地（pH7.２）を用いて６５℃で定
常期となるまで行い、培養終了後に常法により遠心分離
して菌体を回収し、凍結保存した。
aticus) YT−１株の培養は、ポリペプトン0.８％，酵母
エキス0.４％，CaSO4 ・2H2O 0.１５ｇ/l，ホエイ蛋白
質0.４％を含む混合培地（pH7.２）を用いて６５℃で定
常期となるまで行い、培養終了後に常法により遠心分離
して菌体を回収し、凍結保存した。
【００１８】（２）菌体抽出粗酵素の調製
菌体（湿重量２０ｇ）を５０mMTris-HCl緩衝液（pH7.
５）に１０％W/V となるように懸濁した後、超音波処理
（ブランソン社 モデル４５０ ３０Ｗ，２０ＫＨｚ）
を３０分間行って破砕した。この時の試料の温度は１０
℃以下となるようにして行った。その後、遠心分離（１
6,２２０×ｇ，２０分）で得られた上清を同上緩衝液で
透析して菌体抽出粗酵素液とした。
５）に１０％W/V となるように懸濁した後、超音波処理
（ブランソン社 モデル４５０ ３０Ｗ，２０ＫＨｚ）
を３０分間行って破砕した。この時の試料の温度は１０
℃以下となるようにして行った。その後、遠心分離（１
6,２２０×ｇ，２０分）で得られた上清を同上緩衝液で
透析して菌体抽出粗酵素液とした。
【００１９】（３）硫安による塩析
菌体抽出粗酵素液３２０mlに硫安を加えて３０％飽和と
なるようにし、３０分間放置した後、遠心分離（１6,２
２０×ｇ，３０分間）を行って沈澱物を除き、さらに上
清に８０％飽和となるように硫安を加え、３０分間放置
した後、再び遠心分離（１6,２２０×ｇ，３０分間）を
行い、沈澱物を５０mMTris-HCl緩衝液（pH7.５）に懸濁
し、同緩衝液で透析を行った。
なるようにし、３０分間放置した後、遠心分離（１6,２
２０×ｇ，３０分間）を行って沈澱物を除き、さらに上
清に８０％飽和となるように硫安を加え、３０分間放置
した後、再び遠心分離（１6,２２０×ｇ，３０分間）を
行い、沈澱物を５０mMTris-HCl緩衝液（pH7.５）に懸濁
し、同緩衝液で透析を行った。
【００２０】（４）DEAEセファセルクロマトグラフィー
による分画 硫安沈澱画分１８５mlを５０mMTris-HCl緩衝液（pH7.
５）で平衡化したDEAEセファセルカラム（５×３０cm）
に吸着させた。０Ｍ〜0.５Ｍ NaCl の直線的濃度勾配で
９００mlの同緩衝液で溶出した。その結果を図１に示
す。溶出速度１８０ml/h、６ml／画分で分画した。各画
分について活性を測定し、No. １７１〜２０６を活性画
分として回収した。
による分画 硫安沈澱画分１８５mlを５０mMTris-HCl緩衝液（pH7.
５）で平衡化したDEAEセファセルカラム（５×３０cm）
に吸着させた。０Ｍ〜0.５Ｍ NaCl の直線的濃度勾配で
９００mlの同緩衝液で溶出した。その結果を図１に示
す。溶出速度１８０ml/h、６ml／画分で分画した。各画
分について活性を測定し、No. １７１〜２０６を活性画
分として回収した。
【００２１】（５）フェニルセファロースCL-4B クロマ
トグラフィーによる分画 （４）の活性画分６７５mlを同上緩衝液（pH7.５）で透
析を行い、さらにNaClを１Ｍとなるように添加した後
に、予め１Ｍ NaClを含んだ５０mM Tris-HCl 緩衝液（p
H7.５）で平衡化を行ったカラム（1.６×２０cm）に吸
着させた。１Ｍ〜０Ｍ NaCl の直線的濃度勾配で５０mM
Tris-HCl 緩衝液（pH7.５）１８０ml、５０mM〜０Ｍ T
ris-HCl の直線的濃度勾配で同緩衝液９０ml、蒸留水１
８０ml、さらに０％〜５％エタノールの直線的濃度勾配
で２０％エタノール１８０mlにて順次溶出を行った結果
を図２に示す。なお、溶出速度１８０ml/h、６ml／画分
で分画した。各画分について活性を測定し、No. ７０〜
９５を活性画分として回収した。
トグラフィーによる分画 （４）の活性画分６７５mlを同上緩衝液（pH7.５）で透
析を行い、さらにNaClを１Ｍとなるように添加した後
に、予め１Ｍ NaClを含んだ５０mM Tris-HCl 緩衝液（p
H7.５）で平衡化を行ったカラム（1.６×２０cm）に吸
着させた。１Ｍ〜０Ｍ NaCl の直線的濃度勾配で５０mM
Tris-HCl 緩衝液（pH7.５）１８０ml、５０mM〜０Ｍ T
ris-HCl の直線的濃度勾配で同緩衝液９０ml、蒸留水１
８０ml、さらに０％〜５％エタノールの直線的濃度勾配
で２０％エタノール１８０mlにて順次溶出を行った結果
を図２に示す。なお、溶出速度１８０ml/h、６ml／画分
で分画した。各画分について活性を測定し、No. ７０〜
９５を活性画分として回収した。
【００２２】（６）モノＱクロマトグラフィーによる分
画 （５）の活性画分３００mlを５０mM Tris-HCl 緩衝液
（pH7.５）で透析後、モノＱカラム(Pharmacia社製、1.
０×１０cm）に吸着させた。０Ｍ〜0.２Ｍ NaClの直線
的濃度勾配で同緩衝液１５ml、0.２Ｍ NaCl を含む同緩
衝液３０ml、0.２Ｍ〜0.４Ｍ NaCl の直線的濃度勾配で
同緩衝液６０ml、0.４Ｍ〜１Ｍ NaCl の直線的濃度勾配
で同緩衝液１５mlで順次溶出を行った結果を図３に示
す。溶出速度１８０ml/h、1.５ml／画分で分画した。各
画分について活性を測定し、No. ４７〜５１を活性画分
として回収した。
画 （５）の活性画分３００mlを５０mM Tris-HCl 緩衝液
（pH7.５）で透析後、モノＱカラム(Pharmacia社製、1.
０×１０cm）に吸着させた。０Ｍ〜0.２Ｍ NaClの直線
的濃度勾配で同緩衝液１５ml、0.２Ｍ NaCl を含む同緩
衝液３０ml、0.２Ｍ〜0.４Ｍ NaCl の直線的濃度勾配で
同緩衝液６０ml、0.４Ｍ〜１Ｍ NaCl の直線的濃度勾配
で同緩衝液１５mlで順次溶出を行った結果を図３に示
す。溶出速度１８０ml/h、1.５ml／画分で分画した。各
画分について活性を測定し、No. ４７〜５１を活性画分
として回収した。
【００２３】（７）クロマトフォーカシングによる分画
（６）の活性画分１5.６mlを同上緩衝液で透析後、予め
0.025Mメチルピペラジン−HCl 緩衝液（pH5.７）で平衡
化したモノＰカラム(Pharmacia社製、0.５×２０cm）に
吸着させた。１０倍に希釈したPolybuffer７−４緩衝液
（pH4.０）５０mlで溶出を行った結果を図４に示す。な
お、溶出速度６０ml/h、0.５ml／画分で分画した。各画
分について活性を測定し、No. １９〜２２を活性画分と
して回収した。
0.025Mメチルピペラジン−HCl 緩衝液（pH5.７）で平衡
化したモノＰカラム(Pharmacia社製、0.５×２０cm）に
吸着させた。１０倍に希釈したPolybuffer７−４緩衝液
（pH4.０）５０mlで溶出を行った結果を図４に示す。な
お、溶出速度６０ml/h、0.５ml／画分で分画した。各画
分について活性を測定し、No. １９〜２２を活性画分と
して回収した。
【００２４】（８）ジオール３００カラムゲル濾過によ
る分画 （７）の活性画分2.３８mlを脱塩・濃縮後、0.２Ｍ NaC
l を含む５０mM Tris-HCl 緩衝液（pH7.５）に溶解し、
予め同緩衝液で平衡化したジオール３００カラム（ＹＭ
Ｃ製・0.８×５０cm）にのせ、同緩衝液で溶出を行った
結果を図５に示す。溶出速度６０ml/h、ピーク毎に分画
した。各画分について活性を測定し、１4.７分後に溶出
したピーク画分を、活性画分として回収した。５０mM T
ris-HCl緩衝液（pH7.５）で透析後、精製酵素溶液（3.
３５ml）とした。
る分画 （７）の活性画分2.３８mlを脱塩・濃縮後、0.２Ｍ NaC
l を含む５０mM Tris-HCl 緩衝液（pH7.５）に溶解し、
予め同緩衝液で平衡化したジオール３００カラム（ＹＭ
Ｃ製・0.８×５０cm）にのせ、同緩衝液で溶出を行った
結果を図５に示す。溶出速度６０ml/h、ピーク毎に分画
した。各画分について活性を測定し、１4.７分後に溶出
したピーク画分を、活性画分として回収した。５０mM T
ris-HCl緩衝液（pH7.５）で透析後、精製酵素溶液（3.
３５ml）とした。
【００２５】酵素の精製過程を表１に要約する。新規プ
ロリンジペプチダーゼは、Leu-Proを基質として粗酵素
液と比較すると比活性で１４5.３倍に精製され、収率は
3.６％であった。
ロリンジペプチダーゼは、Leu-Proを基質として粗酵素
液と比較すると比活性で１４5.３倍に精製され、収率は
3.６％であった。
【００２６】
【表１】
【００２７】上記により製造された新規プロリンジペプ
チダーゼの各種性質を調べた。その結果を以下に説明す
る。 （１）図６および図７は各種酵素の分子量を示してお
り、図中のＥが本酵素である。図から明らかなように、
本酵素の分子量はジオール３００によるゲル濾過法（図
６）では３２万である。一方、ＳＤＳ電気泳動法（図
７）では約４万である。このことより、本酵素は分子量
約４万のサブユニットからなる８量体酵素であることが
判る。
チダーゼの各種性質を調べた。その結果を以下に説明す
る。 （１）図６および図７は各種酵素の分子量を示してお
り、図中のＥが本酵素である。図から明らかなように、
本酵素の分子量はジオール３００によるゲル濾過法（図
６）では３２万である。一方、ＳＤＳ電気泳動法（図
７）では約４万である。このことより、本酵素は分子量
約４万のサブユニットからなる８量体酵素であることが
判る。
【００２８】（２）図８は酵素活性と温度との関係につ
いて示しており、図から明らかなように、本酵素は高い
温度でより高い活性を示し、至適活性温度は７０〜８０
℃である。
いて示しており、図から明らかなように、本酵素は高い
温度でより高い活性を示し、至適活性温度は７０〜８０
℃である。
【００２９】（３）図９は精製酵素に対する温度の影響
を示している。酵素濃度0.５μ／ml，pH7.５ 5０mM燐酸
塩緩衝液を用いた条件で、本酵素は６０℃では４８時間
保持後も７０％以上の残存活性を示し、非常に熱に安定
である。
を示している。酵素濃度0.５μ／ml，pH7.５ 5０mM燐酸
塩緩衝液を用いた条件で、本酵素は６０℃では４８時間
保持後も７０％以上の残存活性を示し、非常に熱に安定
である。
【００３０】（４）図１０は酵素活性とpHの関係につい
て示しており、本酵素の至適pHは7.０〜7.５である。
て示しており、本酵素の至適pHは7.０〜7.５である。
【００３１】（５）表２は酵素活性に対する各種試薬の
影響を示したものである。表から明らかなように、本酵
素はEDTA，２−メルカプトエタノールで強く阻害された
が、Ｎ−エチルマレイミド，モノヨード酢酸，システィ
ン，PCMB，アマスタチン，ベスタチンでは影響を受けな
かった。したがって、本酵素は金属依存性酵素と考えら
れる。
影響を示したものである。表から明らかなように、本酵
素はEDTA，２−メルカプトエタノールで強く阻害された
が、Ｎ−エチルマレイミド，モノヨード酢酸，システィ
ン，PCMB，アマスタチン，ベスタチンでは影響を受けな
かった。したがって、本酵素は金属依存性酵素と考えら
れる。
【００３２】
【表２】
【００３３】また、EDTA処理した後、透析によりEDTAを
除去した本酵素に対する金属イオンの影響を表３に示し
た。本酵素はCo2+,Mn2+ 及びZn2+によって賦活化され
た。
除去した本酵素に対する金属イオンの影響を表３に示し
た。本酵素はCo2+,Mn2+ 及びZn2+によって賦活化され
た。
【００３４】
【表３】
【００３５】（６）表４は酵素の各種基質に対する特異
性を調べた結果を示している。表から明らかなように、
本酵素はLeu-Pro,Met-Pro,Val-Pro,Ala-Pro などのX-Pr
o タイプのジペプチドにのみ活性を有し、Z-Gly-Pro に
作用せず、また、Pro-Xタイプのジペプチド、Poly-Pro,
ブラジキニン、X-Pro-Y タイプのトリペプチドにも作
用しなかった。
性を調べた結果を示している。表から明らかなように、
本酵素はLeu-Pro,Met-Pro,Val-Pro,Ala-Pro などのX-Pr
o タイプのジペプチドにのみ活性を有し、Z-Gly-Pro に
作用せず、また、Pro-Xタイプのジペプチド、Poly-Pro,
ブラジキニン、X-Pro-Y タイプのトリペプチドにも作
用しなかった。
【００３６】
【表４】
【００３７】
【発明の効果】本発明のプロリンジペプチダーゼは、高
度好熱細菌であるサーマス・アクアティカスに由来する
ものであり、極めて高い耐熱性を有し、７０〜８０℃で
も活性を失わないという特色がある。そのため、食品工
業などで有利に利用できる他、研究用試薬等としても有
用である。
度好熱細菌であるサーマス・アクアティカスに由来する
ものであり、極めて高い耐熱性を有し、７０〜８０℃で
も活性を失わないという特色がある。そのため、食品工
業などで有利に利用できる他、研究用試薬等としても有
用である。
【００３８】
【図１】 DEAEセファセルクロマトグラフィーによる硫
安塩析沈澱画分のクロマトグラフィーの結果を示す。
安塩析沈澱画分のクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２】 DEAEセファセルクロマトグラフィーによって
得られた酵素画分のフェニルセファロースCL4Bクロマト
グラフィーの結果を示す。
得られた酵素画分のフェニルセファロースCL4Bクロマト
グラフィーの結果を示す。
【図３】 フェニルセファロースCL4Bクロマトグラフィ
ーによって得られた酵素画分のモノＱクロマトグラフィ
ーの結果を示す。
ーによって得られた酵素画分のモノＱクロマトグラフィ
ーの結果を示す。
【図４】 モノＱクロマトグラフィーによって得られた
酵素画分のクロマトフォーカシングの結果を示す。
酵素画分のクロマトフォーカシングの結果を示す。
【図５】 クロマトフォーカシングによって得られた酵
素画分のジオール３００カラムゲル濾過の結果を示す。
素画分のジオール３００カラムゲル濾過の結果を示す。
【図６】 ジオール３００カラムゲル濾過法による本酵
素の分子量を示す。
素の分子量を示す。
【図７】 ＳＤＳ電気泳動法による本酵素のサブユニッ
トの分子量を示す。
トの分子量を示す。
【図８】 本酵素の活性と温度の関係を示す。
【図９】 酵素活性への加熱の影響を示す。
【図１０】酵素活性とpHの関係を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 元島 英雅
北海道札幌郡広島町輪厚465−１番地 よ
つ葉乳業株式会社リサーチセンター内
Claims (3)
- 【請求項１】 サーマス・アクアティカス(Thermus aqu
aticus) YT−１株（ＡＴＣＣ２５１０４）に由来し、下
記の性質を有する新規プロリンジペプチダーゼ。 ａ）この酵素の活性の至適pHは7.０〜7.５である。 ｂ）この酵素の活性の至適温度は７０〜８０℃である。 ｃ）この酵素は、Leu-Pro を基質として、６０℃で酵素
濃度0.５μg/ml、５０mM燐酸塩緩衝液（pH7.５）を用い
た条件で、４８時間後で７０％以上の残存活性を示す。 ｄ）この酵素は、EDTA、２−メルカプトエタノールによ
って強く阻害される。 ｅ）この酵素は、EDTAで処理した後、Co2+もしくはMn2+
あるいはZn2+により賦活される。 ｆ）この酵素の分子量はゲル濾過法で約３２万であり、
ＳＤＳ電気泳動法で約４万のサブユニットからなる８量
体酵素である。 - 【請求項２】 サーマス・アクアティカス(Thermus aqu
aticus) YT−１株（ＡＴＣＣ２５１０４）の菌体を超音
波処理で破砕抽出し、その後、硫安による塩析、EDTA−
セファセルおよびフェニルセファロース、クロマトフォ
ーカシング、ゲル濾過などの酵素精製に用いられる通常
の操作を適宜組み合わせることを特徴とする請求項１記
載の新規プロリンジペプチダーゼの精製方法。 - 【請求項３】 サーマス・アクアティカス(Thermus aqu
aticus) YT−１株（ＡＴＣＣ２５１０４）の自然的もし
くは人工的変異株の菌体から取り出された請求項１記載
の新規プロリンジペプチダーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20874691A JPH0530968A (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 新規プロリンジペプチダーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20874691A JPH0530968A (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 新規プロリンジペプチダーゼおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0530968A true JPH0530968A (ja) | 1993-02-09 |
Family
ID=16561399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20874691A Pending JPH0530968A (ja) | 1991-07-26 | 1991-07-26 | 新規プロリンジペプチダーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0530968A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994010290A1 (en) * | 1992-10-30 | 1994-05-11 | Gomei Kaisha Nakamura Sangyo | Thermophilic cellulose-decomposing bacterium and utilization thereof |
| WO2001070937A1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-09-27 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | A new thermostable d-stereospecific dipeptidase from brevibacillus bostelensis bcs-1 and its use as a biocatalyst for the synthesis of peptides containing d-amino acids |
-
1991
- 1991-07-26 JP JP20874691A patent/JPH0530968A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994010290A1 (en) * | 1992-10-30 | 1994-05-11 | Gomei Kaisha Nakamura Sangyo | Thermophilic cellulose-decomposing bacterium and utilization thereof |
| US5648264A (en) * | 1992-10-30 | 1997-07-15 | Gomei Kaisha Nakamura Sangyo | Thermocellulolytic bacteria and their uses |
| WO2001070937A1 (en) * | 2000-03-24 | 2001-09-27 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | A new thermostable d-stereospecific dipeptidase from brevibacillus bostelensis bcs-1 and its use as a biocatalyst for the synthesis of peptides containing d-amino acids |
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