JP3516318B2 - 新規エンドペプチダーゼ - Google Patents
新規エンドペプチダーゼInfo
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Description
バチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticu
s) から産生される新規なエンドペプチダーゼに関す
る。本発明のエンドペプチダーゼは、たんぱく質を分解
する性質を有せず、ペプチドのみを分解する性質を有す
るので、プロティナーゼやアミノペプチダーゼなどのた
んぱく質分解酵素と共に利用して、飲食品や医薬などに
用いるたんぱく質分解物を効率的に製造することができ
る。また、本発明のエンドペプチダーゼを単独で利用し
て、特殊なペプチドを選択的に製造することができる。
酵素が知られており、それらの酵素が種々の分野で利用
されている。その中で乳酸球菌由来のたんぱく質分解酵
素は、安全性の面から食品加工などの分野で利用されて
いる。この中、乳酸球菌が産生するエンドペプチダーゼ
は、たんぱく質をアミノ酸に分解する過程でプロティナ
ーゼの作用により生じた長鎖のペプチドを短鎖のペプチ
ドに分解する作用を有しており、たんぱく質の分解を効
率良く進めるために大変重要な酵素であると考えられて
いる。また、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシ
イズ・クレモリス(Lactococcus lactis ssp. cremori
s) が産生するエンドペプチダーゼが精製されており、
その性質が明らかにされている [特開平5-268955号公
報] 。しかし、発酵乳やチーズなどの乳製品に含まれて
おり、産業界、特に、食品業界で極めて重要な役割を担
っている乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘルベティカス(L
actobacillus helveticus) からは、未だ精製されたエ
ンドペプチダーゼが得られていない現状にある。
うな現状を鑑み、乳酸桿菌のラクトバチルス・ヘルベテ
ィカス(Lactobacillus helveticus) が産生するたんぱ
く質分解酵素について鋭意研究を行っていたところ、各
種カゼインなどのたんぱく質には作用せず、ペプチドの
ペプチド鎖内部のペプチド結合に作用してペプチドを特
異的に分解する新規なエンドペプチダーゼをラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) が
産生することを見出し、本発明を完成するに至った。し
たがって、本発明は、ラクトバチルス・ヘルベティカス
(Lactobacillus helveticus) が産生し、ペプチドを特
異的に分解するエンドペプチダーゼを提供することを課
題とする。
ーゼは、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacill
us helveticus) を通常行われているような培養法に従
って培養し、その培養液から菌体を回収した後、この菌
体を破砕し、通常行われているような酵素の精製法に従
ってこの酵素を採取精製することにより得ることができ
る。
うな性質を有している。 (1)分子量:SDS電気泳動法による測定で約 70kDa
を示す (2)等電点:約 4.8 (3)至適温度:約 30 ℃ (4)至適pH:約 7.0 (5) Km 値及び Vmax 値:基質Try-Gly-Gly-Phe-Met
の分解において、ミカエリス定数(Km 値)が約0.20mM、
最大速度(Vmax 値)が約56μmol/min/mg (6)基質特異性:ペプチドのペプチド鎖内部のペプチ
ド結合に作用し、ペプチドは分解するが、たんぱく質を
分解しない。 (7)酵素阻害剤の影響: 1,10-Phenanthroline、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesu
lfonic acid(p-CMBS) により活性が阻害される。 (8)金属イオンの影響:Cu2+、Zn2+及びFe2+により活
性が阻害される。 また、本発明のエンドペプチダーゼは、乳酸球菌のラク
トコッカス・ラクチス・サブスピーシイズ・クレモリス
(Lactococcus lactis ssp. cremoris) Wg2株が産生す
るエンドペプチダーゼに対するポリクローナル抗体と免
疫反応を起こさないため、Wg2株が産生するエンドペプ
チダーゼとは免疫的に異なる。さらに、本発明のエンド
ペプチダーゼのN末端からのアミノ酸配列はVal-Arg-Gl
y-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Ala-Asp-Leu-Ser-Ala-
Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Asn-である
(配列表配列番号1参照)。本配列は既知の文献および
インターネット中のBLASTプログラムにある全ての
たんぱく質、DNAのデータベースとホモロジー(相同
性)検索を行ったが、相同性の高い酵素は見つからず、
全く新規の酵素であると判断される。
株は、市販の発酵乳から次のような方法で得ることがで
きる。まず、発酵乳1gを滅菌した生理食塩水に懸濁し、
さらに滅菌した生理食塩水で菌数が106 〜107 /ml とな
るよう希釈した懸濁液を調製する。そして、この懸濁液
1mlを市販のMRS培地に寒天を 1.5%となるように加
えたMRS寒天培地に塗抹し、37℃で2日以上培養す
る。さらに出現したコロニーを採取してMRS培地に接
種し、37℃で1日間培養して菌株を得る。なお、MRS
培地の組成は、次の通りである。 ペプトン 10 (g/リットル) 肉エキス 5 酵母エキス 5 グルコース 20 第二リン酸カリウム 2 ツィーン80 1 クエン酸二アンモニウム 2 酢酸ナトリウム 5 硫酸マグネシウム 0.1 硫酸マンガン 0.05
を次に示す。 A 形態的性状 (1)細胞の形: 桿菌 (2)運動性: なし (3)胞子の有無: なし (4)グラム染色性: 陽性 B 培地上の生育状態 (1)培養温度15℃: 生育しない (2)培養温度45℃: 生育する C 生理学的性質 (1)カタラーゼ: 陰性 (2)グルコースよりガスを産生しない。 (3)グルコン酸よりガスを産生しない。 (4)グルコースより乳酸発酵によりDL乳酸を産生す
る。 (5)各種炭水化物の分解性 1. リボース − 2. アラビノース − 3. キシロース − 4. ラムノース − 5. マンニトール − 6. ソルビトール − 7. リビトール − 8. グリセロール − 9. フラクトース − 10.マンノース + 11.ガラクトース + 12.グルコース + 13.ラクトース + 14.マルトース − 15.シュクロース − 16.トレハロース − 17.セロビオース − 18.ラフィノース − 19.メリビオース − 20.メレチトース − 21.サリシン − 22.グルコナート − (+は分解することを示し、−は分解しないことを示
す。) この菌学的性質から、Bergey’smanual
of systematic bacteriolog
y,Vol.2,pp.1222−1224(198
6)の記載を参酌して検索すると、この菌株はラクトバ
チルス・ヘルベティカス(Lactobacillus
helveticus)と同定された。そして、得ら
れた菌株をラクトバチルス・ヘルベティカス(Lact
obacillus helveticus)SBT2
171(FERM P−14381)として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託した。そして、後にブタ
ペスト条約による寄託に移管され、受託番号FERM
BP−5445が付された。
集菌し、これをリゾチームなどを用いた酵素処理、超音
波処理、凍結乾燥処理、ポールミル処理、フレンチプレ
スなどの機械的処理、有機溶媒などを用いた化学的処理
など、通常行なわれているような菌体の破砕手段によっ
て菌体を破砕し、その破砕菌体を除去した上清などを用
いることができる。また、精製菌体は、得られた前記粗
酵素液を各種クロマトグラフィー、塩析、電気泳動、イ
ムノブロット法などたんぱく質分解酵素の精製単離に通
常用いられている方法の中から適宜選択して用いること
ができる。そして、本発明のエンドペプチダーゼはこれ
らの精製段階のいずれの段階においても用いることがで
きる。このようにして得られたエンドペプチダーゼは、
前記したような性質を有している。本発明のエンドペプ
チダーゼは、粗酵素液あるいは精製酵素液または単離さ
れたエンドペプチダーゼのいずれの形でも使用すること
ができる。
チダーゼなどと共にチーズの製造工程において原料に添
加したり、たんぱく質やペプチドなどに添加したりする
ことにより、効率的にその苦味を除去し、風味を改善す
ることができる。また、プロティナーゼや特異性の高い
ペプチダーゼと共に使用することにより、ペプチドの鎖
長をアミノ酸2〜10個にコントロールすることもでき
る。したがって、飲食品や医薬品の素材として用いるた
んぱく質やペプチドの加水分解物を製造する際に有用で
ある。
する。
tobacillus helveticus)SBT
2171(FERM BP−5445)を次の組成を有
する改変MRS培地10リットル(1リットル×10
本)に接種し、37℃で一晩(10−16時間)静置培
養し、650nmにおいて光路長1cmのセルで測定し
た時の培養液の濁度が1.0である対数増殖期後期の菌
体を遠心分離(7,500×g、10分、4℃)によっ
て集菌した。得られた菌体を、15mMの塩化カルシウ
ムを含む50mM 4−(2−ヒドロキシエチル)−1
−ピペラジン−エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液
(pH7.0)100mlで2回洗浄後、120mlの
同緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液各60mlを−1
0℃の冷媒で冷却しながら、出力10、パルス20%
(1秒間に0.2秒間のみ出力)で、40分間、超音波
破砕を行った。この操作により、試料の濁度は超音波破
砕前の20%以下となった。次いで、この破砕物を遠心
分離(30,000×g、10分、4℃)し、得られた
上清を粗酵素液とした。培養液10リットルより得られ
た粗酵素液のたんぱく質量は、ウシ血清アルブミン換算
で10.3gであった。なお、改変MRS培地の組成
は、次の通りである。 ペプトン 10 (g/リットル) 肉エキス 5 酵母エキス 5 グルコース 20 βグリセロリン酸 2 ツィーン80 1 クエン酸三アンモニウム 2 酢酸ナトリウム 3 塩化マグネシウム 0.1 塩化カルシウム 2.2
マトグラフィー (Fast Protein Liquid Chromatograph
y、 Pharmacia社製) に、以下に示すカラムを設置し、
実施例1で得られた、ウシ血清アルブミン換算で 991mg
のたんぱく質を含有する粗酵素液70mlを次の方法で精製
した。なお、各精製段階は全て4℃で行い、供する試料
は全てポアサイズ0.22μm のフィルターで濾過した。ま
た、たんぱく質量は 280nm又は 214nmの吸光度で表し
た。精製段階での酵素活性は、50mM HEPES(pH 7.0)に溶
解した0.5mM MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA を基質溶液と
し、その基質溶液 200μl に被検酵素液5μl 及び市販
のロイシンアミノペプチダーゼを加え、30℃で15分間反
応後、 405nmにおける反応液の吸光度を Microplate Re
ader Model 3550-UV (Bio-Rad Laboratories社製) を用
いて測定した。一方、酵素の特性把握及び各精製段階で
の酵素活性の正確な測定には、 0.1%トリフルオロ酢酸
中のアセトニトリル濃度を直線的に増加させる(0〜40
%)逆相クロマトグラフィーを用い、Tyr-Gly-Gly-Phe-
Met が分解される速度又はTyr-Gly-Gly-Phe-Met の分解
により生じたTyr-Gly-Gly の生成量を測定した。
ラフィー Q−セファロース(Sepharose)HP 26/10 カラム(Pharmac
ia社製) を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)で平衡化し
た後、粗酵素液を供した。次いで、流速 2.0ml/minで同
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜1M)
させることにより溶出を行い、溶出液を4mlずつ分画し
た。得られた活性画分は使用するまで−50℃で凍結保存
した。
e)クロマトグラフィー Q−セファロース(Sepharose) クロマトグラフィーで得
られた活性画分に同体積の3.4M硫酸アンモニウム溶液を
滴下し、最終濃度1.7Mの硫酸アンモニウムを含む試料を
調製した。フェニル セファロース(Phenyl Sepharose)
HP 26/10カラム(Pharmacia社製) を1.7M硫酸アンモニウ
ムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化した
後、調製した試料を供した。次いで、流速 2.0ml/minで
同緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を直線的に減じるこ
とにより溶出を行い、溶出液を4mlずつ分画した。得ら
れた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩
及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。
−塩酸緩衝液(pH 7.5)で平衡化した後、フェニル セフ
ァロース(Phenyl Sepharose)クロマトグラフィーで得ら
れた活性画分を供した。次いで、流速 0.5ml/minで同緩
衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に増加(0〜1M)さ
せることにより溶出を行い、溶出液を 0.5mlずつ分画し
た。得られた活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過
膜で脱塩及び濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存し
た。
クロマトグラフィー ヒドロキシアパタイト スーパーフォーマンス(Hydroxy
lapatite Superformance)5/7.5カラム(Merck社製) を5
mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で平衡化した後、モノ
(Mono)-Qクロマトグラフィーで得られた活性画分を供し
た。次いで、流速0.25ml/minでリン酸カリウム緩衝液(p
H 7.0)の濃度を直線的に増加(5〜500mM)させることによ
り溶出を行い、溶出液を 0.5mlずつ分画した。得られた
活性画分は、分画分子量10,000の限外濾過膜で脱塩及び
濃縮し、使用するまで−50℃で凍結保存した。以上のよ
うな操作を行うことにより、SDS電気泳動法で単一な
本発明の精製酵素0.32mgを回収率 3.1%で得た。
比活性などを表1に示す。
いて、 Laemmliの方法[Nature, vol.227, pp.680-685
(1970)]に従い、SDS電気泳動法により確認した。そ
の結果を図1に示す。なお、図中a〜eは表1の各精製
段階の、またfはマーカー(ホスホリラーゼb 97.4kDa
、ウシ血清アルブミン 66.2kDa、卵白アルブミン 45kD
a) のSDS電気泳動を示す。本発明のエンドペプチダ
ーゼは、ヒドロキシアパタイト(Hydroxylapatite) クロ
マトグラフィー後、分子量 66.0kDaの牛血清アルブミン
のバンドより若干高分子側に染色され、約 70kDaの明確
で単一のバンドを示した。
ゼの等電点を、等電点電気泳動により測定した。装置は
自動電気泳動装置Phast System(Pharmacia社製) を用
い、ゲルはPhastGel IEF 3-9およびPhastGel IEF 4-6.5
(それぞれPharmacia 社製) を使用して、精製エンドペ
プチダーゼを各等電点のマーカーとともに泳動した。泳
動後のゲル中のたんぱく質は、上記装置によって自動的
に銀染色され、検出できる。その結果、等電点は4.8 と
測定された。
質とし、10〜70℃の温度範囲で本発明のエンドペプチダ
ーゼの温度特性を測定した。精製エンドペプチダーゼ(5
μg/ml) 10μl に50mM HEPES緩衝液(pH7.0) 70μl を加
えた酵素液を各温度に5分間保持し、10mM Tyr-Gly-Gly
-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、30%酢酸50μlを
加えて反応を停止させた。活性の測定は実施例2で示し
た逆相クロマトグラフィー法に従って行った。その結果
を図2に示す。本発明のエンドペプチダーゼ活性は30℃
で最大となり、30〜45℃の温度範囲で最大活性の70%の
活性を維持していた。
とし、pH4〜10の範囲で本発明のエンドペプチダーゼの
pH特性を測定した。精製エンドペプチターゼ(5μg/ml)
10μl に各pHに調整した緩衝液 (リンゴ酸、MES、
HEPES及びほう酸を各20mMとなるように混合した緩
衝液) 70μl を加えた酵素液を5分間、30℃に保持し、
10mM Tyr-Gly-Gly-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、
30%酢酸50μl を加えて反応を停止させた。活性の測定
は実施例2で示した逆相クロマトグラフィー法に従って
行った。その結果を図3に示す。本発明のエンドペプチ
ダーゼの最大活性はpH7付近に認められ、pH 4.5以下の
酸性域及びpH 9.0以上のアルカリ域において活性は殆ど
認められなかった。
ンドペプチダーゼの酵素反応の最大速度(Vmax 値) 及び
ミカエリス定数(Km 値) を測定した。精製エンドペプチ
ダーゼ(5μg/ml) 10μl に50mM HEPES緩衝液(pH7.0) 70
μl を加えた酵素液を30℃で5分間保持し、各濃度の T
yr-Gly-Gly-Phe-Metを20μl 加えて20分反応後、30%酢
酸50μl を加えて反応を停止させた。活性の測定は実施
例2で示した逆相クロマトグラフィー法に従って行い、
得られた結果よりラインウィーバー・バークプロットを
作成した。その結果を図4に示す。それによると、 Km
値は0.20mM、 Vmax 値は56μmol/min/mgであった。
について測定した。測定に用いる基質濃度が2〜5mMと
なるよう50mM HEPES緩衝液(pH 7.0)で溶解した基質溶液
200μl に、50mM HEPES緩衝液(pH 7.0)に5μg/mlの濃
度になるように調製した本発明のエンドペプチダーゼ10
μl を加え、30℃で 5.0時間反応させた。次いで、その
反応液を 0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル濃
度を直線的に増加させる(0〜60%)逆相クロマトグラフ
ィーを用い、 214nmにおける基質のピークが酵素反応後
に減少したか否かにより酵素活性の有無を検出した。そ
の結果を表2に示す。
で基質として用いたペプチドの範囲ではアミノ酸が3〜
34個結合したペプチドを分解することはできるが、カゼ
インなどの各種たんぱく質を分解することはできないこ
とが判った。
による影響について測定した。本発明のエンドペプチダ
ーゼを40mM HEPES緩衝液(pH 7.0)中に 0.5μg/mlの濃度
になるように調製し、この酵素液に各酵素阻害剤を 0.0
01〜2.0mM となるように加え、4℃で30分間放置した。
次いで、予めこの酵素液を5分間、30℃に保った後、Ty
r-Gly-Gly-Phe-Metを最終濃度が1mMとなるように加え
て反応を開始し、20分後に30%酢酸を最終濃度10%とな
るよう加えて酵素反応を停止させた。そして、酵素活性
の測定を逆相クロマトグラフィーで行った。その結果、
前記した通り、1,10-Phenanthroline、エチレンジアミ
ン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesulfonic aci
d(p-CMBS) により酵素活性は阻害されたが、Phenylmeth
ylsulfonyl fluoride(p-CMBS) 、Iodoacetic acid によ
り酵素活性は全く阻害されなかった。
の影響についても、試験例7と同様の方法で測定した。
その結果、前記した通り、Cu2+、Zn2+及びFe2+により酵
素活性が阻害された。
ゼをアミノ酸シークエンサー model476A(Applied Biosy
stems 社) を用いて同定したところ、この精製酵素は、
N末端からのアミノ酸配列が、配列表配列番号1に示す
ように、Val-Arg-Gly-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Al
a-Asp-Leu-Ser-Ala-Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-
Ala-Val-Asn-であることが判明した。
プロティナーゼやアミノペプチダーゼなどと併用するこ
とにより、飲食品、飼料、化粧品及び医薬品などの素材
として用いるたんぱく質やペプチドを加水分解する際に
利用することができる。また、たんぱく質を分解しない
でペプチドのみを分解するという本発明のエンドペプチ
ダーゼの性質を利用して、特殊なペプチドを選択的に生
産する際に利用することもできる。さらに、本発明のエ
ンドペプチダーゼは、酪農乳酸菌の産生する酵素であ
り、安全の面でも優れているといえる。
ペプチダーゼのSDS電気泳動の状態を示す。
す。
he-Metを基質とした酵素反応のミカエリス定数(Km 値)
及び最大速度(Vmax 値) を示すライン・ウィーバー・バ
ークプロットを示す。
Claims (4)
- 【請求項1】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) が産生し、以下の性質を有する
エンドペプチダーゼ。 (1)分子量:SDS電気泳動法による測定で約 70kDa
を示す。 (2)等電点:約 4.8 (3)至適温度:約 30 ℃ (4)至適pH:約 7.0 (5)基質特異性:ペプチドのペプチド鎖内部のペプチ
ド結合に作用し、ペプチドは分解するが、たんぱく質は
分解しない。 (6)酵素阻害剤の影響: 1,10-Phenanthroline、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)、p-Chloromercuribenzenesu
lfonic acid(p-CMBS) により活性が阻害される。 (7)金属イオンの影響:Cu2+、Zn2+及びFe2+により活
性が阻害される。 - 【請求項2】 ラクトバチルス・ヘルベティカス(La
ctobacillus helveticus)が、
ラクトバチルス・ヘルベテイカス(Lactobaci
llus helveticus)SBT2171(F
ERM BP−5445)である請求項1記載のエンド
ペプチダーゼ。 - 【請求項3】 基質Try-Gly-Gly-Phe-Met の分解におい
て、ミカエリス定数(Km 値) が約0.20mM、最大速度(V
max 値) が約56μmol/min/mgである請求項1記載のエン
ドペプチダーゼ。 - 【請求項4】 N末端からのアミノ酸配列がVal-Arg-Gl
y-Gly-Ala-Gly-Asp-Ile-Thr-Glu-Ala-Asp-Leu-Ser-Ala-
Arg-Pro-Gln-Asp-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Asn- (配列
表配列番号1)である請求項1記載のエンドペプチダー
ゼ。
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US08/611,395 US6168939B1 (en) | 1995-03-07 | 1996-03-06 | Endopeptidase produced by Lactobacillus helveticus |
EP96103529A EP0733703A3 (en) | 1995-03-07 | 1996-03-07 | Endopeptidase from Lactobacillus helveticus |
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JP7465095 | 1995-03-07 | ||
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